柴胡龍牡湯對小鼠Lewis肺癌細胞凋亡的影響及其機制的實驗研究

1、LOGO柴胡龍牡湯柴胡龍牡湯對對小鼠小鼠LewisLewis肺癌細胞肺癌細胞凋亡的影響及其機制的實驗研究凋亡的影響及其機制的實驗研究遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 腫瘤科腫瘤科 潘玉真潘玉真 研 究 背 景 臨床運用柴胡龍牡湯治療存在咳嗽、咳痰等肺 經(jīng)癥狀的肺癌患者 43例，顯效 5例（12%），有效 31例（72%），無效 7例（16%），總有效率（顯效有效）達 84% 1 。 體內(nèi)實驗研究已證實，該藥具有抑制 Lewis 肺癌細胞生長的作用，對荷瘤小鼠的抑瘤率可達 31.4% 2 。1調(diào)整氣機治療肺癌肺經(jīng)癥狀43例臨床研究. 秦海運，殷東風(fēng);實用中醫(yī)內(nèi)科雜志, 2009,23

2、(4)80-82 .2肺積寧方對C57小鼠肺癌VEGF蛋白表達和生存質(zhì)量的影響現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2009, 17（6）：1042-1045.柴胡龍牡湯前期研究中藥與細胞凋亡的研究腫瘤的發(fā)生不僅因細胞過度增殖，還與細胞凋亡機制受到抑制不能正常進行細胞死亡清除有關(guān)細胞凋亡過程多因素、多基因聯(lián)合作用結(jié)果。中藥復(fù)方成分更為復(fù)雜，其作用多環(huán)節(jié)、影響細胞凋亡方面可能更為有效遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥與細胞凋亡細胞凋亡與腫瘤研 究 背 景 實 驗 動 物C57BL/6J 近交系小鼠，共 60 只，4 - 6 周齡，清潔級，體重 18-20 g，雌雄各半。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所提供，飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)

3、實驗動物中心。遼寧中醫(yī)藥大學(xué)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實 驗 材 料瘤 株 Lewis 肺癌瘤株 ( Lewis Lung carcinoma LLC ) ，為小鼠來源的上皮樣肺腺癌細胞。 由中國醫(yī)科大學(xué)免疫教研室提供。遼寧中醫(yī)藥大學(xué)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實 驗 材 料柴胡龍牡湯 藥物組成：由柴胡、龍骨、牡蠣、黃芩、半夏、太子參、桔梗、炙甘草等11味中藥組成。 藥物煎煮方法：先后用 10 倍水煎 60 min 、8倍水煎煮 40 min ，合并煎煮液，過濾后，濃縮至 1.0 g 生藥生藥 / ml，置于 4 冰箱保存?zhèn)溆?。遼寧中醫(yī)藥大學(xué)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實 驗 藥 品順 鉑 順鉑(DDP)：齊

4、魯制藥有限公司產(chǎn)品, 制劑規(guī)格為10 mg / ml 。 每次給藥前用 0.9% 生理鹽水，把10mg 順鉑稀釋成1mg / ml 順鉑注射液備用。遼寧中醫(yī)藥大學(xué)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實 驗 藥 品動 物 造 模 細胞株的復(fù)蘇及C57BL/6J 小鼠體內(nèi)傳代 注入小鼠腹腔中，注入小鼠腹腔中，每只小鼠注射每只小鼠注射0.2ml0.2ml。加入加入2ml2ml生理鹽水生理鹽水吹打混勻吹打混勻離心兩次離心兩次每次每次5min5min3737水浴箱水浴箱-8080冰箱冰箱遼寧中醫(yī)藥大學(xué)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院動 物 造 模 模型制備遼寧中醫(yī)藥大學(xué)鏡下調(diào)整細胞濃度鏡下調(diào)整細胞濃度為為1 110107 7/

5、ml/ml無菌抽取無菌抽取小鼠腹腔積液小鼠腹腔積液腹部隆起腹部隆起明顯的小鼠明顯的小鼠0.2ml/只只，接種于，接種于小鼠右側(cè)腋部皮下小鼠右側(cè)腋部皮下 遼寧中醫(yī)藥大附屬醫(yī)院動 物 分 組-模型組中藥組化療組綜合組正常組肺癌模型組接種肺癌瘤株，不做治療處理。中藥柴胡龍牡湯組接種肺癌瘤株，并中藥治療。單純順鉑化療組接種肺癌瘤株，并化療。柴胡龍牡湯順鉑綜合組接種肺癌瘤株，中藥聯(lián)合化療處理。正常對照組不做造模及治療處理。共分 5 組遼寧中醫(yī)藥大學(xué)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實 驗 給 藥 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)化療組順鉑注射液0.1ml /只只/ d （DDP 0.1mg） 腹腔注射化療，共3 次，于第1、3、5天

6、給藥。 同時生理鹽水0.4ml/只只/d灌胃，共12天中藥組柴胡龍牡湯0.4ml /只只/ d （含生藥0.4g） 灌胃，共連續(xù)12天。 第1、3、5天，生理鹽水0.1ml /只只/ d ，腹腔注射。遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實 驗 給 藥 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)綜合組順鉑注射液給藥劑量、方法同化療組，柴胡龍牡湯用法同中藥組 。模型組正常組0.9%生理鹽水0.4ml /只只/ d 灌胃，共連續(xù)12天。 并于第1、3、5天， 0.9%生理鹽水0.1ml /只只/ d ，腹腔注射。遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實 驗 取 材 各組小鼠均于末次給藥后24小時進行取材完整剝離出瘤體，稱重后于冰盒上，將瘤塊切開在無壞死區(qū)共

7、取材 3 份，標(biāo)本塊大小約為1 mm3 。 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)Text蛋白測定 電鏡檢測 免疫組化檢測 立即置于-20冰箱中凍存?zhèn)溆谩?于戊二醛固定液中，4冷藏備用。 置于甲醛固定液中備用。 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院統(tǒng) 計 分 析 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS11.0軟件包。計量資料 進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），），組間比較采用最小顯著差法（LSD）方法。等級資料 采用非參數(shù)統(tǒng)計方法-秩和檢驗遼寧中醫(yī)藥大學(xué)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實 驗 指 標(biāo)透射電鏡下觀察腫瘤組織超微結(jié)構(gòu)變化檢測腫瘤組織中 TNF 的蛋白表達，采用免疫組織化學(xué)法凋亡相關(guān)基因 Bax、 Bcl-2、Caspase3蛋白

8、表達，用 Western blot方法探討柴胡龍牡湯誘導(dǎo)Lewis肺癌細胞凋亡的分子作用機制 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤細胞透射電鏡觀察呈現(xiàn)出惡性腫瘤細胞呈現(xiàn)出惡性腫瘤細胞特征。細胞核明顯增特征。細胞核明顯增大，核漿比例失調(diào)，大，核漿比例失調(diào)，核膜完整，雙層核膜核膜完整，雙層核膜清晰，核異形性明顯，清晰，核異形性明顯，細胞膜完整，胞質(zhì)內(nèi)細胞膜完整，胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹線粒體腫脹 嵴斷裂嵴斷裂消失，偶見粗面內(nèi)質(zhì)消失，偶見粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，散在核糖體顆粒。網(wǎng)，散在核糖體顆粒。模型組模型組- Lewis肺癌細胞肺癌細胞 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院結(jié) 果線粒體線粒體粗粗面面內(nèi)內(nèi)質(zhì)質(zhì)網(wǎng)網(wǎng)中

9、藥組中藥組- 凋亡細胞凋亡細胞 呈現(xiàn)出細胞凋亡早期呈現(xiàn)出細胞凋亡早期的特點。的特點。細胞體積明細胞體積明顯縮小，細胞膜結(jié)構(gòu)顯縮小，細胞膜結(jié)構(gòu)完整，核膜稍擴張，完整，核膜稍擴張，核形不規(guī)整，核內(nèi)異核形不規(guī)整，核內(nèi)異染色質(zhì)增多、邊集，染色質(zhì)增多、邊集，濃縮成團塊狀或新月濃縮成團塊狀或新月狀，分布在核膜的內(nèi)狀，分布在核膜的內(nèi)側(cè)。細胞質(zhì)內(nèi)細胞器側(cè)。細胞質(zhì)內(nèi)細胞器基本正常?；菊！ H異染色質(zhì)異染色質(zhì)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤細胞透射電鏡觀察結(jié) 果異染色質(zhì)異染色質(zhì)化療組化療組 - 壞死細胞壞死細胞 細胞體積異常細胞體積異常增大，核大畸增大，核大畸變，胞質(zhì)內(nèi)線變，胞質(zhì)內(nèi)線粒體、粗面內(nèi)粒體

10、、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，核質(zhì)網(wǎng)擴張，核糖體顆粒脫落。糖體顆粒脫落。說明存在重度說明存在重度的炎性反應(yīng)的炎性反應(yīng)。 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤細胞透射電鏡觀察結(jié) 果中藥組中藥組 - 凋亡小體凋亡小體 化療組化療組 - 凋亡小體凋亡小體 綜合組綜合組 - 凋亡小體凋亡小體 凋亡小體：由膜包繞，小體內(nèi)可見核的殘片及胞質(zhì)。凋亡小體：由膜包繞，小體內(nèi)可見核的殘片及胞質(zhì)。 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤細胞透射電鏡觀察結(jié) 果凋亡小體凋亡小體凋亡小體凋亡小體凋亡小體凋亡小體瘤組織中TNF的免疫組化染色TNF 陰性陰性 (400) TNF 陽性陽性 (400) 細胞漿無棕色與背景著色一致細胞

11、漿無棕色與背景著色一致細胞漿內(nèi)出現(xiàn)均一的棕黃色細胞漿內(nèi)出現(xiàn)均一的棕黃色和深棕褐色顆粒狀染色和深棕褐色顆粒狀染色遼寧中醫(yī)藥大學(xué)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院結(jié) 果結(jié) 果瘤組織中TNF 的免疫組化染色結(jié)果結(jié)果分為結(jié)果分為4 4級級: : 未見陽性細胞為未見陽性細胞為(-)(-)； 陽性細胞數(shù)陽性細胞數(shù) 25% 25% 為為(+)(+)；陽性細胞數(shù)在；陽性細胞數(shù)在 25% 25% 50% 50% 之間為之間為(+)(+)；陽性細胞；陽性細胞 50%50%為為(+)(+)。 組別組別 N TNF染色結(jié)果染色結(jié)果 模模 型型 組組 10 - 中中 藥藥 組組 10 + 化化 療療 組組 8 - 綜綜 合合 組組

12、 9 + 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院1 2 3 4模型組模型組 中藥組中藥組 化療組化療組 綜合組綜合組Bcl-2、Bax、Caspase3 蛋白表達電泳圖蛋白表達電泳圖遼寧中醫(yī)藥大學(xué)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院結(jié) 果結(jié) 果瘤組織中 Bcl-2、Bax 及Caspase3 蛋白表達結(jié)果( x S ) 組別組別 N Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax Caspase3 模 型 組 10 189.6219.19 78.459.55 2.41 31.124.60 中 藥 組 10 178.3418.28 114.4013.59 1.56 47.205.80 化 療 組 8 158.4516.

13、9 121.6013.381.30 60.657.35 綜 合 組 9 145.2214.63 133.614.63 1.08 81.0310.3 與模型組比較： p 0.01， p0.05； 與中藥組比較： p0.01， p0.05；與化療組比較： p0.01， p0.05。遼寧中醫(yī)藥大學(xué)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院結(jié) 果瘤組織中 Bcl-2、Bax 及Caspase3 蛋白表達結(jié)果與與中藥組比較：中藥組比較： p 0.01； p 0.05。 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院正氣正氣內(nèi)虛內(nèi)虛 邪毒邪毒血瘀血瘀 痰濕痰濕 討 論遼寧中醫(yī)藥大學(xué)肺的宣發(fā)肅降功能失肺的宣發(fā)肅降功能失司，司，氣機紊亂氣機紊亂而發(fā)病而發(fā)病 肺積的病因病機病因病因?qū)е挛迮K六腑、陰陽氣血的功能活動紊亂、障礙, 從而產(chǎn)生相應(yīng)的種種病理變化。升降出入升降出入動態(tài)失衡動態(tài)失衡柴胡龍牡湯的理、法、方、藥升降平升降平衡理論衡理論 丹溪局方發(fā)揮“ 一升一降, 無有偏性, 是謂平人?！庇?論調(diào)暢氣機調(diào)暢氣機遼寧中醫(yī)藥大學(xué), 素問六微旨大論“非出入則無以生長壯老已,非升降則無以生長化收藏”氣機氣機升降升降柴胡龍牡湯的理、法、方、藥討 論柴胡龍牡湯軟堅散結(jié)重鎮(zhèn)降逆 升散之力 升降相宜，氣機暢達 通利三焦、開三焦之結(jié)氣。 化痰止咳，可引藥于肺經(jīng)可行氣化痰，鎮(zhèn)咳止吐一升一降以開宣肺氣入肺經(jīng)，可清肅肺熱柴胡 龍骨牡蠣桔梗