等溫滴定量熱法在生命科學研究中應用

1、等溫滴定量熱法在生命科學研究中應用0 等溫滴定量熱法(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)是近年來發(fā)展起來的一種研究生物熱力學與生物動力學的重要方法，它通過高靈敏度、高自動化的微量量熱儀連續(xù)、準確地監(jiān)測和記錄一個變化過程的量熱曲線，原位、在線和無損傷地同時提供熱力學和動力學信息。微量熱法具有許多獨特之處。它對被研究體系的溶劑性質(zhì)、光譜性質(zhì)和電學性質(zhì)等沒有任何限制條件，即具有非特異性的獨特優(yōu)勢，樣品用量小，方法靈敏度和精確度高(本儀器最小可檢測熱功率2 nW，最小可檢測熱效應0.125uJ，生物樣品最小用量0.4ug，溫度范圍2 0C - 80 0C，滴定

2、池體積1.43 ml)。實驗時間較短(典型的ITC實驗只需30-60分鐘，并加上幾分鐘的響應時間)，操作簡單(整個實驗由計算機控制，使用者只需輸入實驗的參數(shù)，如溫度、注射次數(shù)、注射量等，計算機就可以完成整個實驗，再由Origin軟件分析ITC得到的數(shù)據(jù))。測量時不需要制成透明清澈的溶液, 而且量熱實驗完畢的樣品未遭破壞，還可以進行后續(xù)生化分析。盡管微量熱法缺乏特異性但由于生物體系本身具有特異性，因此這種非特異性方法有時可以得到用特異方法得不到的結(jié)果，這有助于發(fā)現(xiàn)新現(xiàn)象和新規(guī)律，特別適應于研究生物體系中的各種特異過程。ITC的用途獲得生物分子相互作用的完整熱力學參數(shù)，包括結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)、摩

3、爾結(jié)合焓、摩爾結(jié)合熵、摩爾恒壓熱容，和動力學參數(shù)(如酶活力、酶促反應米氏常數(shù)和酶轉(zhuǎn)換數(shù))。ITC的應用范圍蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(包括抗原-抗體相互作用和分子伴侶-底物相互作用)；蛋白質(zhì)折疊/去折疊；蛋白質(zhì)-小分子相互作用以及酶-抑制劑相互作用；酶促反應動力學；藥物-DNA/RNA相互作用；RNA折疊；蛋白質(zhì)-核酸相互作用；核酸-小分子相互作用；核酸-核酸相互作用；生物分子-細胞相互作用；加樣體積：（實際體積）cell：1.43 ml，syringe：300 l準備樣品體積（最少量）cell：2 ml，syringe：500 l樣品濃度cell：幾十M到幾mM  syringe：幾百

4、M到幾十mM測量Kb范圍102-1012 M-1滴定實驗前恒溫30-60 min等溫滴定量熱實驗所需時間，一般1.5-4 hr微量熱技術(shù)(Microcalorimetry)(2008-05-27 19:58:14)標簽：雜談  微量熱法(包括等溫滴定量熱和差示掃描量熱)是近年來發(fā)展起來的研究生物熱力學與生物動力學的重要結(jié)構(gòu)生物學方法，它通過高靈敏度、高自動化的微量量熱儀連續(xù)和準確地監(jiān)測和記錄一變化過程的量熱曲線，原位(in situ)、在線(on-line)和無損傷地同時提供熱力學和動力學信息。微量熱法具有以下特點：1.它不干擾蛋白質(zhì)和核酸的生理功能，具有非特異性的獨特優(yōu)勢

5、，即對被研究蛋白質(zhì)和核酸體系的溶劑性質(zhì)、光譜性質(zhì)和電學性質(zhì)等沒有任何限制條件。2.樣品用量小,方法靈敏度高，測量時不需要制成透明清澈的溶液。3.量熱實驗完畢的樣品未遭破壞，還可以進行后續(xù)生化分析。4.微量熱法缺乏特異性。但由于蛋白質(zhì)和核酸本身具有特異性，因此種非特異性方法有時可以得到用特異方法得不到的結(jié)果，這有助于發(fā)現(xiàn)新現(xiàn)象和新規(guī)律。微量熱法在生物大分子研究中的應用主要有：1.酶促反應2. 蛋白質(zhì)去折疊/折疊3.抗原-抗體相互作用4.分子伴侶-底物相互作用5.藥物-核酸相互作用等溫滴定量熱法（Isothermal Titration Calorimetry，ITC

6、）實驗是通過滴定反應物到含有反應所必須的另一反應物的樣品溶液中。每次滴定后，反應熱放出或吸收，這些都可以被ITC所檢測到。檢測到的熱效應的熱力學分析提供了結(jié)合反應相關(guān)的能量過程的定量特征，可以直接測量與常溫下發(fā)生的反應過程相關(guān)的能量學參數(shù)。1  ITC的特點ITC能測量到的熱效應最低可達125 nJ，最小可檢測熱功率2 nW，生物樣品最小用量0.4 g，而且這些年來ITC的靈敏度得到了提高，降低了響應時間（小于10 s）。ITC不需要固定或改變反應物，因為結(jié)合熱的產(chǎn)生是自發(fā)的。獲得物質(zhì)相互作用完整的熱力學數(shù)據(jù)包括結(jié)合常數(shù)（Ka）、結(jié)合

7、位點數(shù)（n），結(jié)合焓（H）、恒壓熱容（Cp）和動力學數(shù)據(jù)（如酶促反應的Km和kcat）。ITC 也比那些選擇分析方式（如分析型超速離心法，AUC）快，一個單純的AUC實驗需要幾個小時甚至幾天去完成，而典型的ITC實驗只需3060分鐘，在加上幾分鐘的響應時間。整個實驗有計算機控制，使用者只需輸入實驗的參數(shù)（溫度、注射次數(shù)、注射量等）計算機就可以完成整個實驗，再由Origin軟件分析 ITC得到的數(shù)據(jù)。其精確度高以及操作簡單。 ITC 獲取的結(jié)果示意圖上圖：峰底與峰尖之間的峰面積為每次注射時釋放或吸收的總熱量。 下圖：以產(chǎn)生或吸收的總熱量為縱坐標，以加入杯中的兩反應物

8、之摩爾比為橫坐標作圖，可得整個反應過程的結(jié)合等溫曲線。 2  ITC的應用1）蛋白質(zhì)-小分子和酶-抑制物相互作用；2）蛋白質(zhì)-糖類相互作用；3）蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用：如Jacobson等用ITC研究了人細胞RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄因子TFIID的最大亞單位TAFII250的組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶活性(Jacobson et al., 2000)。日本Kanagawa科學技術(shù)研究所的Tahirov等利用ITC、CD和UV研究了 AML1/Runx-1小結(jié)構(gòu)域識別的DNA結(jié)構(gòu)及CBF控制的構(gòu)象調(diào)整，闡明了CBF與CBF間的相互作用模式及前者調(diào)控后者

9、結(jié)合到DNA上的機制(Tahirov, et al., 2001)。3）蛋白質(zhì)-脂質(zhì)相互作用；4）脂質(zhì)間以及脂質(zhì)-小分子相互作用；5）核酸-小分子相互作用；6）蛋白質(zhì)-核酸相互作用；7）核酸-核酸相互作用；8）抗體研究：美國Johns Hopkins大學生物系的生物量熱學中心是世界上從事生物量熱學最活躍和處于領(lǐng)先水平的實驗室，該中心的Freire小組(Murphy et al., 1993, 1995)應用高靈敏度ITC分別研究了血管緊縮素與其單克隆抗體和酸誘導去折疊細胞色素c與其單克隆抗體的結(jié)合，發(fā)現(xiàn)上述結(jié)合過程

10、均為焓和熵同時驅(qū)動的反應，實驗結(jié)果表明，這些過程中溶劑釋放所導致的熵增過量補償了因結(jié)合而引起的構(gòu)象熵的損失。9）受體相互作用；10）蛋白質(zhì)折疊和穩(wěn)定性：如美國的Wright小組應用ITC和核磁共振(NMR)等技術(shù)研究了核激素受體蛋白的一個結(jié)構(gòu)域與甲狀腺素及類纖維素A受體相互作用的熱力學，發(fā)現(xiàn)雖然分開的結(jié)構(gòu)域本身很凌亂，但是它們之間有高的親和力而且是焓驅(qū)動的，并以一種獨特的協(xié)同折疊的機制形成螺旋異二聚體。11）酶分析：如Freire小組應用等溫滴定微量熱法(ITC)結(jié)合高靈敏度差示掃描量熱法(DSC)和分光光度法研究了酵母細胞色素C氧化酶催化氧化其生理底物亞鐵細胞色素c的熱力學和動力學，并分析了

11、原鹽效應對該酶活性的影響。我們應用等溫微量熱法研究了超氧化物歧化酶催化歧化超氧陰離子等反應體系，獲得了這些酶促反應的各種熱力學和動力學信息,探討了相關(guān)催化機理，同時用該法研究了博萊霉素催化切割DNA的反應，從熱力學和動力學的角度嚴格地證明了博萊霉素在催化機制上類似于DNA切割酶，但其催化效率低于DNA切割酶，并用等溫滴定微量熱法研究了不同濃度鹽酸胍存在時肌酸激酶催化ATP與肌酸間轉(zhuǎn)磷酸化反應的熱力學，從熱力學的觀點確定了該酶促反應為快速平衡的隨機順序反應，還建立了新的肌酸激酶和超氧化物歧化酶活力測定方法微量熱測活法。值得指出的是，ITC不僅被應用于研究蛋白質(zhì)折疊/去折疊，而且被應用于核酸折疊，

12、例如英國的Hammann等人利用ITC研究了鎂離子誘導錘頭狀核酶折疊的熱力學，發(fā)現(xiàn)鎂離子與天然序列核酶的結(jié)合是一個強烈的放熱反應，和鎂離子與錘頭狀核酶不同序列變異體的結(jié)合有很大的區(qū)別，這些工作對于核酸折疊的熱力學研究是良好的開端。ITC 應用示例1  ITC法測量結(jié)合/解離常數(shù)Christian Herrmann等運用ITC研究了Ras與效應物和Cdc42與效應物的相互作用。Ras是一種在信號轉(zhuǎn)導過程中起重要作用的蛋白質(zhì)?？梢韵蚱湎掠蔚脑S多信號轉(zhuǎn)導途徑輸送細胞內(nèi)調(diào)控信號。Ras在非激活態(tài)，與GDP結(jié)合，當GDP被GTP取代時被激活，與其效應物（Raf，R

13、alGDS，3-磷脂酰肌醇激酶）呈現(xiàn)緊密的結(jié)合。Cdc42是一種GTPase，也是信號轉(zhuǎn)導相關(guān)的蛋白。它參與細胞增殖調(diào)控和肌動蛋白細胞骨架的調(diào)控。Cdc42在參與細胞骨架調(diào)控的過程中，很重要的一步是與WASP蛋白的相互作用。Ras及其效應物（Raf，RalGDS）的結(jié)合方式都很類似，包括富含親水氨基酸側(cè)鏈的反平行ß折疊。Cdc42及其效應物(WASP)的結(jié)合區(qū)則富含疏水氨基酸，其復合物也比Ras/效應物復合物大得多。ITC可以直接測量焓變H，結(jié)合常數(shù)Ka，而不對反應體系產(chǎn)生影響，也不引入修飾基團，因此測得的結(jié)果更加可信。圖18-7  實驗結(jié)果：20時GCN4-D和GCN4-

14、M與AP-1的滴定反應和擬合曲線(a) GCN4-D滴定AP-1；(b) GCN-M滴定AP-1這里是以獨立結(jié)合位點模型進行最小二乘法擬合計算出了結(jié)合常數(shù)Kb、結(jié)合焓變H0和結(jié)合計量數(shù)N等值（結(jié)果見表18-1、2）。研究結(jié)果：ITC測定的反應熱既包含結(jié)合反應又包含折疊反應。肽與DNA結(jié)合過程伴隨著肽的構(gòu)象折疊和疏水表面包埋。肽的構(gòu)象中熵的損失對熵變的不利貢獻大于溶劑效應產(chǎn)生的有利貢獻，由于包埋疏水表面時所引起的結(jié)合水的損失對熵變產(chǎn)生有利貢獻，因此肽與DNA結(jié)合過程中總的熵變對結(jié)合是不利的。產(chǎn)生熵變的因素有：1）疏水作用產(chǎn)生的有利貢獻；2）肽與DNA形成復合物由于轉(zhuǎn)動和平移自由度的減小引起的熵損

15、失；3）結(jié)合過程中肽與DNA的折疊或其他構(gòu)象變化產(chǎn)生的不利貢獻。表18-1  GCN4-D與AP-1和CRE結(jié)合的熱力學參數(shù) AP-1181.04±0.052.25±0.25-84.2±0.7-35.4±0.3-48.8±1.0200.98±0.033.26±0.12-87.0±0.8-36.5±0.1-50.5±0.9220.98±0.033.61±0.28-89.6±1.2-37.0±0.2-52.6±1.4251.09&

16、#177;0.070.73±0.10-94.2±3.9-33.6±0.4-60.7±4.3CRE181.03±0.042.64±0.40-74.5±1.4-35.8±0.3-38.7±1.7201.05±0.057.10±0.61-77.6±0.9-38.4±0.2-39.2±1.1220.99±0.026.45±0.80-80.3±0.8-38.4±0.3-41.9±1.1251.08±0.03

17、6.99±0.25-84.6±2.5-39.0±0.1-45.6±2.6表18-2  GCN4-D與AP-1和CRE結(jié)合的熱力學參數(shù) AP-1151.94±0.053.36±0.15-34.8±0.7-30.5±0.1-4.3±0.8181.98±0.032.20±0.09-36.8±0.3-29.8±0.1-7.0±0.4202.01±0.051.50±0.30-39.2±0.4-29.5±0.

18、5-9.7±0.9221.96±0.032.08±0.18-40.5±0.6-30.0±0.2-10.5±0.8251.99±0.051.28±0.31-43.8±1.4-29.0±0.6-14.8±2.0CRE152.02±0.042.64±0.18-33.4±1.4-29.9±0.2-3.5±1.6182.04±0.033.75±0.23-35.9±0.4-31.0±0.1-4.9±0.5202.05±0.043.21±0.40-38.2±0.8-30.9±0.3-7.3±1.1221.99&