實(shí)驗(yàn)課件(苯甲醇苯甲酸水揚(yáng)酸酸測(cè)定)

1、2022-3-19苯甲醇、苯甲酸、水楊酸的毛細(xì)管電泳分離苯甲醇、苯甲酸、水楊酸的毛細(xì)管電泳分離教師教師 肖艷玲肖艷玲0808級(jí)綜合實(shí)驗(yàn)級(jí)綜合實(shí)驗(yàn) 2010.102010.102022-3-19一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模阂?、?shí)驗(yàn)?zāi)康模?、掌握毛細(xì)管電泳的基本概念；2、通過(guò)實(shí)驗(yàn)熟悉毛細(xì)管電泳儀的基本原理和操作；3、了解影響毛細(xì)管電泳分離的主要操作參數(shù)。2022-3-19二、基本概念：二、基本概念：電泳：電泳：在電解質(zhì)溶液中，位于電場(chǎng)中的帶電離子在電場(chǎng)力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象，稱(chēng)之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質(zhì)的不同，遷移速率不同，可實(shí)現(xiàn)分離。 利用電泳現(xiàn)象對(duì)某些化學(xué)或生

2、物物質(zhì)進(jìn)行分離分析的方法和技術(shù)叫電泳法或電泳技術(shù)。高效毛細(xì)管電泳高效毛細(xì)管電泳:( CE, capillary electrophoresis)，以毛細(xì)管為分離通道（用75um內(nèi)徑石英毛細(xì)管），以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以樣品的多種特性為分離依據(jù)的分析技術(shù)。高效毛細(xì)管電泳。2022-3-19電滲流現(xiàn)象電滲流現(xiàn)象電滲流：電滲流：毛細(xì)管內(nèi)壁表面電毛細(xì)管內(nèi)壁表面電荷所引起的管內(nèi)液體的整體荷所引起的管內(nèi)液體的整體流動(dòng)流動(dòng) ，來(lái)源于外加電場(chǎng)對(duì)管，來(lái)源于外加電場(chǎng)對(duì)管壁溶液雙電層的作用壁溶液雙電層的作用 電滲現(xiàn)象中整體移動(dòng)著的液電滲現(xiàn)象中整體移動(dòng)著的液體叫體叫電滲流電滲流（electroosmotic flo

3、w ，簡(jiǎn)稱(chēng)簡(jiǎn)稱(chēng)EOF）。）。 電滲現(xiàn)象電滲現(xiàn)象: 當(dāng)液體兩端施加電壓時(shí)，就會(huì)發(fā)生液體相對(duì)于當(dāng)液體兩端施加電壓時(shí)，就會(huì)發(fā)生液體相對(duì)于固體表面的移動(dòng)，這種液體相對(duì)于固體表面的移動(dòng)的現(xiàn)象固體表面的移動(dòng)，這種液體相對(duì)于固體表面的移動(dòng)的現(xiàn)象叫電滲現(xiàn)象叫電滲現(xiàn)象.2022-3-19HPCE中電滲流的大小與方向電滲流的大小電滲流的大小: 用電滲流速度用電滲流速度電滲流電滲流表示，取決于電滲淌度表示，取決于電滲淌度和電場(chǎng)強(qiáng)度和電場(chǎng)強(qiáng)度E E。即即 電滲流電滲流 = = E E淌度：淌度：取決于帶電離子在單位電場(chǎng)下的遷移速度；取決于帶電離子在單位電場(chǎng)下的遷移速度； 是特征常數(shù)是特征常數(shù) 淌度不同是電泳分離的基礎(chǔ)

4、。淌度不同是電泳分離的基礎(chǔ)。2022-3-19電滲流的作用：電滲流的作用： 電滲流的速度約等于一般離子電泳速度的電滲流的速度約等于一般離子電泳速度的5 57 7倍；倍；（1 1）可一次完成陽(yáng)離子、陰離子、中性粒子的分離；）可一次完成陽(yáng)離子、陰離子、中性粒子的分離；（2 2）改變電滲流的大小和方向可改變分離效率和選擇性，）改變電滲流的大小和方向可改變分離效率和選擇性， 如同改變?nèi)缤淖僉CLC中的流速；中的流速；在在HPCE中，控制電滲流非常重要中，控制電滲流非常重要。電滲流的方向電滲流的方向: 取決于毛細(xì)管內(nèi)表面電荷的性質(zhì)：取決于毛細(xì)管內(nèi)表面電荷的性質(zhì)：內(nèi)表面帶負(fù)電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向

5、陰極；內(nèi)表面帶負(fù)電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向陰極；內(nèi)表面帶正電荷，溶液帶負(fù)電荷，電滲流流向陽(yáng)極；內(nèi)表面帶正電荷，溶液帶負(fù)電荷，電滲流流向陽(yáng)極；石英毛細(xì)管；帶負(fù)電荷，電滲流流向陰極；石英毛細(xì)管；帶負(fù)電荷，電滲流流向陰極；2022-3-19分離過(guò)程分離過(guò)程 電場(chǎng)作用下，毛細(xì)管柱中出現(xiàn)：電泳現(xiàn)電泳現(xiàn)象象和電滲流現(xiàn)象電滲流現(xiàn)象。 帶電粒子的帶電粒子的遷移速度遷移速度= =電泳電泳+ +電滲流；電滲流；兩種速度的矢量和兩種速度的矢量和。 正離子正離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動(dòng)方向一致，在兩種效應(yīng)的運(yùn)動(dòng)方向一致，在負(fù)極最先流出負(fù)極最先流出； 中性粒子中性粒子無(wú)電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，無(wú)電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽(yáng)

6、離子后流出在陽(yáng)離子后流出； 陰離子陰離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動(dòng)方向相反兩種效應(yīng)的運(yùn)動(dòng)方向相反。電滲流 電泳時(shí),陰離子在負(fù)極最后流出。在這種情況下,不但可以按類(lèi)分離, 同種類(lèi)離子由于受到的電場(chǎng)力大小不一樣也同時(shí)被相互分離。（動(dòng)畫(huà)）動(dòng)畫(huà)）2022-3-19三、高效毛細(xì)管電泳(HPCE)基本原理1.1.遷移時(shí)間（保留時(shí)間）遷移時(shí)間（保留時(shí)間） HPCEHPCE兼具有兼具有電化學(xué)的特性電化學(xué)的特性和和色譜分析色譜分析的特性。有關(guān)色譜的特性。有關(guān)色譜理論也適用。理論也適用。VLLELLtapefapefapef V外加電壓；L毛細(xì)管總長(zhǎng)度；2.2.分離效率（塔板數(shù)）分離效率（塔板數(shù)） 在在HPCEHPCE中，

7、僅存在縱向擴(kuò)散，中，僅存在縱向擴(kuò)散，2 2=2=2DtDt22/154. 5;22 YtnDELDLVLnRefapefap 擴(kuò)散系數(shù)小的溶質(zhì)比擴(kuò)散系數(shù)大的分離效率高，分離生擴(kuò)散系數(shù)小的溶質(zhì)比擴(kuò)散系數(shù)大的分離效率高，分離生物大分子的依據(jù)。物大分子的依據(jù)。2022-3-193.分離度 DLVLRefap 平均平均 177. 0 影響分離度的主要因素；工作電壓影響分離度的主要因素；工作電壓V V；毛細(xì)管有效長(zhǎng)度毛細(xì)管有效長(zhǎng)度與總長(zhǎng)度比；有效淌度差。分離度可按譜圖直接由下式計(jì)算：與總長(zhǎng)度比；有效淌度差。分離度可按譜圖直接由下式計(jì)算：221apap 平平均均1212)(2WWttR2022-3-19高

8、效毛細(xì)管電泳在技術(shù)上采取了兩項(xiàng)重要改進(jìn)：高效毛細(xì)管電泳在技術(shù)上采取了兩項(xiàng)重要改進(jìn)：電壓升高，電場(chǎng)推動(dòng)力大； 柱徑小，柱長(zhǎng)增加。 高效毛細(xì)管電泳的柱效遠(yuǎn)高于高效液相色譜，理論塔板數(shù)高達(dá)幾十萬(wàn)塊/米，特殊柱子可以達(dá)到數(shù)百萬(wàn)。一、采用了一、采用了 75um 內(nèi)徑的毛細(xì)管；內(nèi)徑的毛細(xì)管；二、采用了高達(dá)數(shù)千伏的電壓。二、采用了高達(dá)數(shù)千伏的電壓。2022-3-19高效毛細(xì)管電泳法的特點(diǎn)高效毛細(xì)管電泳法的特點(diǎn)1.1.儀器簡(jiǎn)單、易自動(dòng)化儀器簡(jiǎn)單、易自動(dòng)化 電源、毛細(xì)管、檢測(cè)器、溶液瓶2.2.分析速度快、分離效率高分析速度快、分離效率高 在3.1min內(nèi)分離36種無(wú)機(jī)及有機(jī)陰離子，4.1min內(nèi)分離了24種陽(yáng)離

9、子；3.3.操作方便、消耗少操作方便、消耗少 進(jìn)樣量極少，水介質(zhì)中進(jìn)行；4.4.應(yīng)用范圍極廣應(yīng)用范圍極廣 有機(jī)物、無(wú)機(jī)物、生物、中性分子；生物大分子等； 分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、化學(xué)、環(huán)境保護(hù)、材料等； 2022-3-19四、儀器結(jié)構(gòu)及主要部件四、儀器結(jié)構(gòu)及主要部件紫外或激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器；（可檢測(cè)到：10-1910-21 mol/L）1. 高壓電源高壓電源2. 毛細(xì)管柱毛細(xì)管柱3. 緩沖液池緩沖液池4. 檢測(cè)器檢測(cè)器2022-3-191.1.高壓電源高壓電源（1 1）0 03030 kV kV 穩(wěn)定、連續(xù)可調(diào)的直流電源；穩(wěn)定、連續(xù)可調(diào)的直流電源；（2 2）具有恒壓、恒流、恒功率輸出；）具有恒

10、壓、恒流、恒功率輸出；（3 3）電場(chǎng)強(qiáng)度程序控制系統(tǒng)；）電場(chǎng)強(qiáng)度程序控制系統(tǒng)；2. 2. 毛細(xì)管柱毛細(xì)管柱（1 1）材料：石英（）材料：石英（分離柱不涂敷任何固定液）各項(xiàng)各項(xiàng)性能好；性能好；（2 2）規(guī)格：）規(guī)格：內(nèi)徑內(nèi)徑 2075m，外徑外徑350400m；長(zhǎng)度長(zhǎng)度1m2022-3-193.3.緩沖液池緩沖液池 化學(xué)惰性，機(jī)械穩(wěn)定性好；4. 4. 檢測(cè)器檢測(cè)器 要求：具有極高靈敏度，可柱端檢測(cè)； 檢測(cè)器、數(shù)據(jù)采集與計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理一體化； 類(lèi)型類(lèi)型 檢測(cè)限檢測(cè)限/mol 特點(diǎn)特點(diǎn)紫外 10-1310-15 光譜信息熒光 10-1510-17 靈敏度高，樣品需衍生激光誘導(dǎo)熒光 10-1810-2

11、0 靈敏度極高，樣品需衍生2022-3-191. 離子分析離子分析analysis of ion2. 藥物分析藥物分析analysis of pharmaceutics3. 氨基酸分析氨基酸分析analysis of amino acids4. 核酸分析及核酸分析及DNA測(cè)序測(cè)序analysis of nucleic acids and sequence of DNA5. 新進(jìn)展及熱點(diǎn)問(wèn)題新進(jìn)展及熱點(diǎn)問(wèn)題advances and special topics高效毛細(xì)管電泳應(yīng)用與進(jìn)展2022-3-191. 離子分析2022-3-192. 藥物分析 檢測(cè)體液或細(xì)胞中某些代謝產(chǎn)物的分析； 尿液中的氨

12、基酸含量作為臨床診斷糖尿病的輔助手段； 采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳方式，在11min內(nèi)分離17種藥物；2022-3-193. 氨基酸與蛋白質(zhì)分析可分離23種丹酰化氨基酸；HPCE可取代傳統(tǒng)的氨基酸分析儀；問(wèn)題：吸附和檢測(cè)；蛋白質(zhì)分析2022-3-194. 核酸分析及DNA排序2022-3-19五、操作步驟五、操作步驟1.打開(kāi)計(jì)算機(jī)和主機(jī)，預(yù)熱 30min。2.雙擊 32Karat 7.0工作界面，選擇進(jìn)入 UV 檢測(cè)項(xiàng)。3.切換至工具欄里的 Direct Control 選項(xiàng)，按下 Load，并將樣品按照匹配程序的位置放置。（注意：毛細(xì)管對(duì)準(zhǔn)樣品管口 向瓶中裝樣時(shí)，樣品不應(yīng)過(guò)滿(mǎn)，也不能沾濕瓶頸。）4.

13、在工具欄里選擇 Time Program 選項(xiàng)，對(duì)以下將要進(jìn)行的步驟進(jìn)行編寫(xiě)。2022-3-195.按下工具欄里的藍(lán)色箭頭（Single Run），運(yùn)行儀器。注意：運(yùn)行時(shí)不能打開(kāi)蓋子注意：運(yùn)行時(shí)不能打開(kāi)蓋子6.依次檢測(cè)標(biāo)樣標(biāo)樣和未知樣未知樣，并在工具欄里的 Reports 里的View(Area%) 查看實(shí)驗(yàn)結(jié)果。7.結(jié)束測(cè)量時(shí)，用緩沖液清洗 1015min， 按下Home鍵。8.關(guān)閉主機(jī)和計(jì)算機(jī)電源。2022-3-19NOTime(min)EventValueDurationLnlet(vial)Outlet(vial)Sum mary1Rinse-Pressure20.0psi5.00minBl:B1B0:B1forward2Rinse-Pressure20.0psi5.00minBl:B2B0:B1forward3Rinse-Pressure20.0psi5.00minBl:B3B0:B1forward4