實(shí)驗(yàn)二 培養(yǎng)基的制備及滅菌-07124010213

1、1 1、了解培養(yǎng)基制備原理，學(xué)習(xí)并掌握培、了解培養(yǎng)基制備原理，學(xué)習(xí)并掌握培養(yǎng)基制備方法。養(yǎng)基制備方法。2 2、掌握干熱滅菌和高壓蒸汽滅菌的原理、掌握干熱滅菌和高壓蒸汽滅菌的原理和方法。和方法。（一）培養(yǎng)基的制備原理（一）培養(yǎng)基的制備原理v培養(yǎng)基是微生物生長、繁殖、代謝的混合養(yǎng)料。培養(yǎng)基是微生物生長、繁殖、代謝的混合養(yǎng)料。v從營養(yǎng)角度分析：從營養(yǎng)角度分析： 營養(yǎng)：碳源、氮源、生長因子、水分和無機(jī)鹽等；營養(yǎng)：碳源、氮源、生長因子、水分和無機(jī)鹽等； 適宜的酸堿度適宜的酸堿度(pH值值)和一定緩沖能力；和一定緩沖能力； 一定的氧化還原電位；一定的氧化還原電位； 合適的滲透壓。合適的滲透壓。u1、干熱滅

2、菌原理、干熱滅菌原理 干熱是指相對濕度在干熱是指相對濕度在20以下的高熱。以下的高熱。干熱消毒滅菌是由空氣導(dǎo)熱，傳熱效果較干熱消毒滅菌是由空氣導(dǎo)熱，傳熱效果較慢。一般繁殖體在干熱慢。一般繁殖體在干熱80100中經(jīng)中經(jīng)1小小時(shí)可以殺死，芽孢需時(shí)可以殺死，芽孢需160170經(jīng)經(jīng)2小時(shí)小時(shí)方可殺死。方可殺死。u（1）在移液管尾部塞上少許棉花，然后用報(bào)紙條）在移液管尾部塞上少許棉花，然后用報(bào)紙條 包好；用報(bào)紙條包好干燥的培養(yǎng)皿。包好；用報(bào)紙條包好干燥的培養(yǎng)皿。u（2）將待滅菌物品包扎好，均勻放入烘箱內(nèi)，注）將待滅菌物品包扎好，均勻放入烘箱內(nèi)，注 意不要擺的太擠，以免妨礙氣流流通。意不要擺的太擠，以免妨

3、礙氣流流通。u（3）開啟電源，設(shè)定溫度為）開啟電源，設(shè)定溫度為160 170 ，保持，保持 此溫度此溫度12小時(shí)。小時(shí)。u（4）切斷電源，待溫度降至）切斷電源，待溫度降至70以下時(shí)，打開箱以下時(shí)，打開箱 門，取出滅菌物品。門，取出滅菌物品。（1 1）加水：）加水： 直接加水至鍋內(nèi)底部隔板以下直接加水至鍋內(nèi)底部隔板以下1/3處。有加水口者由加水口加入處。有加水口者由加水口加入至止水線處。至止水線處。（2 2）裝鍋：）裝鍋： 把需滅菌的器物放入鍋內(nèi)，關(guān)嚴(yán)鍋蓋。把需滅菌的器物放入鍋內(nèi)，關(guān)嚴(yán)鍋蓋。（3 3）接通熱源：）接通熱源： 將鍋蓋上排氣閥關(guān)閉，同時(shí)打開底部排氣閥。待見有大量水汽將鍋蓋上排氣閥關(guān)閉

4、，同時(shí)打開底部排氣閥。待見有大量水汽排出時(shí)，維持排出時(shí)，維持35min，關(guān)上底部排氣閥。，關(guān)上底部排氣閥。（4 4）升壓、升溫：）升壓、升溫： 關(guān)閉排氣閥以后，鍋內(nèi)成為密閉系統(tǒng)，蒸汽不斷增多，壓力關(guān)閉排氣閥以后，鍋內(nèi)成為密閉系統(tǒng)，蒸汽不斷增多，壓力計(jì)和溫度計(jì)的指針上升，當(dāng)壓力達(dá)到計(jì)和溫度計(jì)的指針上升，當(dāng)壓力達(dá)到 1.05 kg/cm1.05 kg/cm2 2（溫度為（溫度為 121121）即滅菌開始，這時(shí)維持在即滅菌開始，這時(shí)維持在1.05 kg/cm1.05 kg/cm2 2，202030min30min。 除含糖培養(yǎng)基用除含糖培養(yǎng)基用0.56 kg/cm0.56 kg/cm2 2壓力外，一

5、般都用壓力外，一般都用 1.05 kg/cm1.05 kg/cm2 2壓力。壓力。（5 5）切斷電源：）切斷電源： 達(dá)到滅菌時(shí)間要求后停止加熱，任其自然降壓，當(dāng)指針回到達(dá)到滅菌時(shí)間要求后停止加熱，任其自然降壓，當(dāng)指針回到0 0時(shí)，打開排氣閥。時(shí)，打開排氣閥。（6 6）揭開鍋蓋，取出滅菌物，排掉鍋內(nèi)剩余水。）揭開鍋蓋，取出滅菌物，排掉鍋內(nèi)剩余水。（7 7）待培養(yǎng)基冷卻后置于）待培養(yǎng)基冷卻后置于3737恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h24h，若無，若無 菌生長則放入冰箱或陰涼處保存?zhèn)溆谩＞L則放入冰箱或陰涼處保存?zhèn)溆?。u（1 1）滅菌物不要裝得太滿，否則滅菌）滅菌物不要裝得太滿，否則滅菌 不徹底。

6、不徹底。u（2 2）蓋上鍋蓋，以兩兩對稱方式同時(shí)旋緊螺栓，勿使）蓋上鍋蓋，以兩兩對稱方式同時(shí)旋緊螺栓，勿使 漏氣。漏氣。u（3 3）排氣閥不能過早打開，否則培養(yǎng)基因壓力突降，）排氣閥不能過早打開，否則培養(yǎng)基因壓力突降， 溫度沒下降會使培養(yǎng)基翻騰沖到棉塞處，既損失溫度沒下降會使培養(yǎng)基翻騰沖到棉塞處，既損失 培養(yǎng)基又沾污了棉塞。培養(yǎng)基又沾污了棉塞。1、藥品：、藥品：瓊脂，瓊脂，10HCL（各組自配），（各組自配），10%NaOH（各組自配），牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏（各組自配），牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏I號培養(yǎng)基號培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖（蔗糖）瓊脂培養(yǎng)基（和馬鈴薯葡萄糖（蔗糖）瓊脂培養(yǎng)基（PDA）的

7、配方）的配方藥品。藥品。2、材料：、材料：刻度刻度1000mL塘瓷量杯，天平，試管，量筒，塘瓷量杯，天平，試管，量筒，小燒杯，玻璃棒，藥匙，小燒杯，玻璃棒，藥匙，pH試紙，棉花，報(bào)紙，麻繩，試紙，棉花，報(bào)紙，麻繩，標(biāo)簽，培養(yǎng)皿等。標(biāo)簽，培養(yǎng)皿等。3、設(shè)備：、設(shè)備：高壓蒸汽滅菌鍋、烘箱、冰箱、電爐等。高壓蒸汽滅菌鍋、烘箱、冰箱、電爐等。（一）牛肉膏蛋白胨（一）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基的制備 u1、稱量稱量u2、溶解、溶解u3、調(diào)、調(diào)pHu4、過濾過濾u5、分裝、分裝u6、加塞、加塞u7、包扎、包扎u8、滅菌、滅菌u9、擱置斜面、擱置斜面u10、無菌檢查、無菌檢查步步 驟驟 牛肉膏牛肉膏 3

8、g 蛋白胨蛋白胨 10g NaCl 5g 瓊脂瓊脂 20g 水水 1000mL pH 7.47.6 配配 方方u按培養(yǎng)基配方比例依次準(zhǔn)確地稱取所需藥品放入燒杯中。按培養(yǎng)基配方比例依次準(zhǔn)確地稱取所需藥品放入燒杯中。u牛肉膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用牛肉膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶化后倒入燒杯。也可放在稱量紙上，稱量后直接熱水溶化后倒入燒杯。也可放在稱量紙上，稱量后直接放入水中，這時(shí)如稍微加熱，牛肉膏便會與稱量紙分離，放入水中，這時(shí)如稍微加熱，牛肉膏便會與稱量紙分離，然后立即取出紙片。然后立即取出紙片。u蛋白胨很易吸潮，在稱取時(shí)動作要迅速。蛋白胨很易吸潮，在稱

9、取時(shí)動作要迅速。u稱藥品時(shí)嚴(yán)防藥品混雜，一把牛角匙用于一種藥品，或稱藥品時(shí)嚴(yán)防藥品混雜，一把牛角匙用于一種藥品，或稱取一種藥品后，洗凈、擦干，再稱取另一藥品，瓶蓋稱取一種藥品后，洗凈、擦干，再稱取另一藥品，瓶蓋也不要蓋錯(cuò)。也不要蓋錯(cuò)。 u在未調(diào)在未調(diào)pH前，先用精密前，先用精密pH試紙測量培養(yǎng)基的原始試紙測量培養(yǎng)基的原始pH值，如果值，如果pH偏酸，用滴管向培養(yǎng)基中逐滴加入偏酸，用滴管向培養(yǎng)基中逐滴加入1mol/L NaOH，邊加邊攪拌，并隨時(shí)用，邊加邊攪拌，并隨時(shí)用pH試紙測其試紙測其pH值，值，直至直至pH達(dá)達(dá)7.6，反之，則用，反之，則用1mol/LHCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。進(jìn)行調(diào)節(jié)。u注意注意p

10、H值不要調(diào)過頭，以避免回調(diào)，否則，將會影值不要調(diào)過頭，以避免回調(diào)，否則，將會影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。 u對于有些要求對于有些要求pH值較精確的微生物，其值較精確的微生物，其pH的調(diào)節(jié)可的調(diào)節(jié)可用酸度計(jì)進(jìn)行用酸度計(jì)進(jìn)行 。u趁熱用濾紙或多層紗布過濾，以利結(jié)果的觀察。趁熱用濾紙或多層紗布過濾，以利結(jié)果的觀察。一般無特殊要求的情況下，這一步可以省去。一般無特殊要求的情況下，這一步可以省去。 u在上述燒杯中可先加入少于所需要的水量，用玻在上述燒杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒攪勻，然后，在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解。待藥棒攪勻，然后，在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解。待藥品完全溶解后，補(bǔ)

11、充水分到所需的總體積。品完全溶解后，補(bǔ)充水分到所需的總體積。u如果配制固體培養(yǎng)基，將稱好的瓊脂放入已溶化如果配制固體培養(yǎng)基，將稱好的瓊脂放入已溶化的藥品中，再加熱溶化，在瓊脂溶化的過程中，的藥品中，再加熱溶化，在瓊脂溶化的過程中，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底使燒杯破裂。最后補(bǔ)需不斷攪拌，以防瓊脂糊底使燒杯破裂。最后補(bǔ)足所失的水分。足所失的水分。 u按實(shí)驗(yàn)要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管內(nèi)或三角燒按實(shí)驗(yàn)要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管內(nèi)或三角燒瓶內(nèi)。分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，瓶內(nèi)。分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。以免沾污棉塞而引起污染。 u(1)

12、液體分裝分裝高度以試管高度的液體分裝分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。左右為宜。u (2)固體分裝分裝試管，其裝量不超過管高的固體分裝分裝試管，其裝量不超過管高的1/5，滅菌后，滅菌后制成斜面。分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的制成斜面。分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜。一半為宜。 u(3)半固體分裝試管一般以試管高度的半固體分裝試管一般以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂為宜，滅菌后垂直待凝。直待凝。 u培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口或三角燒瓶口上培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口或三角燒瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基內(nèi)而塞上棉塞，以阻止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基內(nèi)而造成污染，并保

13、證有良好的通氣性能。造成污染，并保證有良好的通氣性能。u加塞后，將全部試管用麻繩捆扎好，再在棉塞外加塞后，將全部試管用麻繩捆扎好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時(shí)冷凝水潤濕棉塞，包一層牛皮紙，以防止滅菌時(shí)冷凝水潤濕棉塞，其外再用一道麻繩扎好。用記號筆注明培養(yǎng)基名其外再用一道麻繩扎好。用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、日期。稱、組別、日期。u三角燒瓶加塞后，外包牛皮紙，用麻繩以活結(jié)形三角燒瓶加塞后，外包牛皮紙，用麻繩以活結(jié)形式扎好，使用時(shí)容易解開，同樣用記號筆注明培式扎好，使用時(shí)容易解開，同樣用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、日期。養(yǎng)基名稱、組別、日期。u將上述培養(yǎng)基以將上述培養(yǎng)基以121，20分鐘

14、高壓蒸汽滅菌。分鐘高壓蒸汽滅菌。u如因特殊情況不能及時(shí)滅菌，則應(yīng)放入冰箱內(nèi)如因特殊情況不能及時(shí)滅菌，則應(yīng)放入冰箱內(nèi)暫存。暫存。 （二）（二）馬鈴薯馬鈴薯(PDA)培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基的制備(真菌用真菌用)馬鈴薯馬鈴薯 200g 蒸餾水蒸餾水 1000mL蔗糖（葡萄糖）蔗糖（葡萄糖） 20g pH 自然自然 瓊脂瓊脂 20gu馬鈴薯汁制備：將馬鈴薯去皮，稱量所需重量，馬鈴薯汁制備：將馬鈴薯去皮，稱量所需重量，切成小塊，切成小塊，加水煮沸加水煮沸30min。u用濾紙或用濾紙或雙層紗布雙層紗布(中間夾一層脫脂棉花中間夾一層脫脂棉花)趁熱趁熱過濾。過濾。u濾液煮沸后加糖，用于培養(yǎng)濾液煮沸后加糖，用于培養(yǎng)

15、霉菌的加入蔗糖霉菌的加入蔗糖，用于培養(yǎng)用于培養(yǎng)酵母菌的加入葡萄糖酵母菌的加入葡萄糖，再加入其它。，再加入其它。u其余同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的制備。其余同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的制備?？扇苄缘矸劭扇苄缘矸?20g KNO3 1gNaCl 0.5g K2HPO43H2O 0.5gMgSO47H2O 0.5g FeSO47H2O 0.01g瓊脂瓊脂 20g 水水 1000mLpH 7.4-7.6 u按配方先稱取可溶性淀粉，放入小燒杯中，并用少按配方先稱取可溶性淀粉，放入小燒杯中，并用少量冷水將淀粉調(diào)成糊狀，再加入少于所需水量的沸量冷水將淀粉調(diào)成糊狀，再加入少于所需水量的沸水，繼續(xù)加熱，使可溶性淀粉完全熔化

16、，然后再稱水，繼續(xù)加熱，使可溶性淀粉完全熔化，然后再稱取其各成分依次熔化。取其各成分依次熔化。u對微量成分對微量成分FeSO47H2O，可先在，可先在100mL水中加入水中加入1g的的FeSO47H2O，配成，配成0.01g/mL，再在，再在10000mL培養(yǎng)培養(yǎng)基中加基中加1mL的的0.01g/mL的貯備液。的貯備液。u其它同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配置。其它同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配置。注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)！u（1）在制備固體培養(yǎng)基加熱融化瓊脂時(shí)要不斷攪拌，）在制備固體培養(yǎng)基加熱融化瓊脂時(shí)要不斷攪拌， 避免瓊脂糊底燒焦。避免瓊脂糊底燒焦。u（2）液體培養(yǎng)基：分裝高度以試管的）液體培養(yǎng)基：分裝高度以試

17、管的1/4左右為宜。左右為宜。u（3）固體培養(yǎng)基：分裝試管，其裝量為管高的）固體培養(yǎng)基：分裝試管，其裝量為管高的1/61/5 滅菌后制成斜面。分裝三角瓶容量以一半為宜。滅菌后制成斜面。分裝三角瓶容量以一半為宜。u（4）半固體培養(yǎng)基：分裝試管一般以試管高度的）半固體培養(yǎng)基：分裝試管一般以試管高度的1/3為為 宜，滅菌后，垂直待凝成半固體深層瓊脂。宜，滅菌后，垂直待凝成半固體深層瓊脂。u（5）不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口，如沾上，需用干）不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口，如沾上，需用干 凈的紗布擦干凈。凈的紗布擦干凈。 全班同學(xué)共分成全班同學(xué)共分成4組，每組組，每組7人人u一組完成一組完成馬鈴薯馬鈴薯(P

18、DA)培養(yǎng)基培養(yǎng)基（霉菌用，（霉菌用，用用蔗糖），蔗糖），u二組完成二組完成馬鈴薯馬鈴薯(PDA)培養(yǎng)基培養(yǎng)基（酵母菌用，（酵母菌用，用用葡萄糖），葡萄糖），u三組完成三組完成高氏高氏I號培養(yǎng)基號培養(yǎng)基（用于放線菌培養(yǎng)），（用于放線菌培養(yǎng)），u四組完成四組完成牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用于細(xì)菌培養(yǎng)）。（用于細(xì)菌培養(yǎng)）。 每組的培養(yǎng)基每組的培養(yǎng)基均配制成均配制成1000mL，分裝，分裝4個(gè)三角瓶（個(gè)三角瓶（150mL），），其余分裝試管做成斜面。其余分裝試管做成斜面。 全班同學(xué)共分成全班同學(xué)共分成4組，每組組，每組7人人u試試 管：管： 2支支/人人（5支裝支裝9ml蒸餾水，其余裝培養(yǎng)基）蒸餾水，其余裝培養(yǎng)基），u培養(yǎng)皿：培養(yǎng)皿：1套套/人，人，u吸吸 管：管：1支支/人，人，u三角瓶：三角瓶：5瓶瓶/組組（1瓶裝瓶裝90ml蒸餾水，蒸餾水，4瓶裝瓶裝150ml培養(yǎng)基）培養(yǎng)基），分裝好的培養(yǎng)基分裝好的培養(yǎng)基裝有玻璃珠