實(shí)驗(yàn)一質(zhì)粒DNA的提取和鑒定

1、實(shí)驗(yàn)一質(zhì)粒DNA的提取和鑒定分子生物學(xué)分子生物學(xué) 從分子水平上研究生命現(xiàn)象物質(zhì)基礎(chǔ)的學(xué)從分子水平上研究生命現(xiàn)象物質(zhì)基礎(chǔ)的學(xué)科。研究細(xì)胞成分的物理、化學(xué)的性質(zhì)和科。研究細(xì)胞成分的物理、化學(xué)的性質(zhì)和變化以及這些性質(zhì)和變化與生命現(xiàn)象的關(guān)變化以及這些性質(zhì)和變化與生命現(xiàn)象的關(guān)系，如遺傳信息的傳遞，基因的結(jié)構(gòu)、復(fù)系，如遺傳信息的傳遞，基因的結(jié)構(gòu)、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、表達(dá)調(diào)控和表達(dá)產(chǎn)物的制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、表達(dá)調(diào)控和表達(dá)產(chǎn)物的生理功能，以及細(xì)胞信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)等。生理功能，以及細(xì)胞信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)等。 基因工程基因工程移液器和EP管質(zhì)質(zhì) 粒粒 質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，獨(dú)

2、立獨(dú)立于染色體之外的、能自主復(fù)制的雙鏈環(huán)狀脫氧核糖核酸于染色體之外的、能自主復(fù)制的雙鏈環(huán)狀脫氧核糖核酸物質(zhì)。物質(zhì)。 質(zhì)粒的存在使宿主具有一些額外的特性，如對(duì)抗生素質(zhì)粒的存在使宿主具有一些額外的特性，如對(duì)抗生素的抗性等。的抗性等。F質(zhì)粒質(zhì)粒(又稱又稱F因子或性質(zhì)粒因子或性質(zhì)粒)、R質(zhì)粒質(zhì)粒(抗藥抗藥性因子性因子)和和Col質(zhì)粒質(zhì)粒(產(chǎn)大腸桿菌素因子產(chǎn)大腸桿菌素因子)等都是常見(jiàn)的等都是常見(jiàn)的天然質(zhì)粒。天然質(zhì)粒。 能穩(wěn)定地獨(dú)立存在于染色體外，并傳遞到子代，一能穩(wěn)定地獨(dú)立存在于染色體外，并傳遞到子代，一般不整合到宿主染色體上。般不整合到宿主染色體上。 現(xiàn)在常用的質(zhì)粒大多數(shù)是經(jīng)過(guò)改造或人工構(gòu)建的，常含現(xiàn)

3、在常用的質(zhì)粒大多數(shù)是經(jīng)過(guò)改造或人工構(gòu)建的，常含抗生素抗性基因，是重組抗生素抗性基因，是重組DNADNA技術(shù)中重要的工具。技術(shù)中重要的工具。 分類：分類：u單拷貝質(zhì)粒；單拷貝質(zhì)粒；u多拷貝質(zhì)粒多拷貝質(zhì)粒；l緊密控制型；緊密控制型；l松弛控制型；松弛控制型；質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的提取方法的提取方法 堿裂解法；堿裂解法； 煮沸裂解法；煮沸裂解法； 酚氯仿抽提法；酚氯仿抽提法； 概括起來(lái)主要是用非離子型或離子型去污概括起來(lái)主要是用非離子型或離子型去污劑、有機(jī)溶劑或堿進(jìn)行處理及用加熱處理。劑、有機(jī)溶劑或堿進(jìn)行處理及用加熱處理?；舅悸坊舅悸放囵B(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)菌；收集和

4、裂解細(xì)菌；分離質(zhì)粒分離質(zhì)粒DNA(DNA(有時(shí)還要求純化質(zhì)粒有時(shí)還要求純化質(zhì)粒DNADNA，根，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需據(jù)實(shí)驗(yàn)所需) )電泳檢測(cè)；電泳檢測(cè)；堿裂解法的基本原理堿裂解法的基本原理十二烷基磺酸鈉十二烷基磺酸鈉(SDS)(SDS) 可使細(xì)胞膜裂解?？墒辜?xì)胞膜裂解。經(jīng)經(jīng)SDSSDS處理后，細(xì)菌染色體處理后，細(xì)菌染色體DNADNA會(huì)纏繞附著在細(xì)胞碎片上，同會(huì)纏繞附著在細(xì)胞碎片上，同時(shí)由于細(xì)菌染色體時(shí)由于細(xì)菌染色體DNADNA比質(zhì)粒大得多，易受機(jī)械力和核酸酶等比質(zhì)粒大得多，易受機(jī)械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。的作用而被切斷成不同大小的線性片段。當(dāng)用強(qiáng)熱或酸、堿處理時(shí)，細(xì)菌的線性染色

5、體當(dāng)用強(qiáng)熱或酸、堿處理時(shí)，細(xì)菌的線性染色體DNADNA變性，而共價(jià)閉合變性，而共價(jià)閉合環(huán)狀環(huán)狀DNA(Covalently closed circularDNADNA(Covalently closed circularDNA，簡(jiǎn)稱，簡(jiǎn)稱cccDNA)cccDNA)的兩條鏈的兩條鏈不會(huì)相互分開(kāi)。不會(huì)相互分開(kāi)。當(dāng)外界條件恢復(fù)正常時(shí)，線狀染色體當(dāng)外界條件恢復(fù)正常時(shí)，線狀染色體DNADNA片段難以復(fù)性，而是片段難以復(fù)性，而是與變性的蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片纏繞在一起，而質(zhì)粒與變性的蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片纏繞在一起，而質(zhì)粒DNADNA雙鏈又恢復(fù)雙鏈又恢復(fù)原狀，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解狀態(tài)存在于液相中。原狀

6、，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解狀態(tài)存在于液相中。實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟1 1、將含有質(zhì)粒的、將含有質(zhì)粒的DNADNA細(xì)菌在細(xì)菌在LBLB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。取培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。取1.5ml LB1.5ml LB培培養(yǎng)液倒入養(yǎng)液倒入1.5mleppendorf1.5mleppendorf管中，管中，44下下12000g12000g離心離心3030秒。秒。 2 2、棄上清，將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘，使液體流盡。、棄上清，將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘，使液體流盡。 3 3、菌體沉淀重懸浮于、菌體沉淀重懸浮于溶液溶液中（需劇烈振蕩）。中（需劇烈振蕩）。 4 4、加入新配制的溶液、加入新配制的溶液，蓋緊管口，

7、快速溫和顛倒，蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorfeppendorf管數(shù)次，以混勻內(nèi)容物（千萬(wàn)不要振蕩），冰浴管數(shù)次，以混勻內(nèi)容物（千萬(wàn)不要振蕩），冰浴2 2分鐘。分鐘。 5 5、加入、加入預(yù)冷的溶液預(yù)冷的溶液，蓋緊管口，顛倒混勻，冰浴中，蓋緊管口，顛倒混勻，冰浴中5-105-10分鐘，分鐘，44下下12000g12000g離心離心5-105-10分鐘。分鐘。6 6、上清液、上清液移入干凈移入干凈eppendorfeppendorf管中，加入等體積的飽和酚管中，加入等體積的飽和酚（1:11:1），充分顛倒混勻，），充分顛倒混勻，44下下12000g12000g離心離心1010分鐘。分鐘。

8、7 7、將水相、將水相移入干凈移入干凈eppendorfeppendorf管中，加入等體積酚管中，加入等體積酚/ /氯仿，顛氯仿，顛倒混勻，倒混勻，12000rpm12000rpm離心離心10min10min。8 8、將水相、將水相移入干凈移入干凈eppendorfeppendorf管中，加入管中，加入2 2倍體積的無(wú)水乙倍體積的無(wú)水乙醇，振蕩混勻后置于醇，振蕩混勻后置于-20-20冰箱中冰箱中2020分鐘，然后分鐘，然后44下下12000g12000g離心離心1010分分鐘。鐘。 8 8、棄上清，將管口敞開(kāi)倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出，加入、棄上清，將管口敞開(kāi)倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出，加

9、入 70 70乙醇洗沉淀一次，乙醇洗沉淀一次，44下下12000g12000g離心離心5-105-10分鐘。分鐘。 9 9、吸除上清液，將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡，真空干燥、吸除上清液，將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡，真空干燥1010分鐘分鐘或室溫干燥。或室溫干燥。 1010、將沉淀溶于、將沉淀溶于緩沖液（緩沖液（pH8.0pH8.0，含，含20g/ml RNaseA20g/ml RNaseA）中，儲(chǔ)）中，儲(chǔ)于于-20-20冰箱中。冰箱中。LBLB液體培養(yǎng)基（液體培養(yǎng)基（Luria-BertaniLuria-Bertani） 稱取蛋白胨（稱取蛋白胨（TryptoneTryptone）10g10

10、g，酵母提取物，酵母提取物（YeastextractYeastextract）5g5g，NaCl10gNaCl10g，溶于，溶于800ml800ml去離子去離子水中，用水中，用NaOHNaOH調(diào)調(diào)pHpH至至7.57.5，加去離子水至總體，加去離子水至總體積積1 1升，高壓下蒸氣滅菌升，高壓下蒸氣滅菌2020分鐘。分鐘。溶液溶液I I 50mmol/L50mmol/L葡萄糖，葡萄糖，25mmol/ L T r i s. Cl25mmol/ L T r i s. Cl（pH8.0pH8.0），），10mmol/L10mmol/LEDTAEDTA（pH8.0pH8.0）。）。溶液溶液可成批配可成批

11、配制，每瓶制，每瓶100ml100ml，高壓滅菌高壓滅菌1515分鐘，儲(chǔ)存于分鐘，儲(chǔ)存于44冰冰箱箱u溶液溶液I I：重懸細(xì)菌；：重懸細(xì)菌；u葡萄糖：比重大，使細(xì)菌不易沉淀；葡萄糖：比重大，使細(xì)菌不易沉淀；uTrisTrisHClHCl：緩沖體系；：緩沖體系；uEDTAEDTA：螯合金屬離子；：螯合金屬離子；溶液溶液 0.2mol/L0.2mol/LNaOHNaOH（臨用前用臨用前用10mol/LNaOH10mol/LNaOH母液母液稀釋），稀釋），1 1SDSSDSu溶液溶液IIII破膜，變性基因組破膜，變性基因組DNADNA和蛋白質(zhì)；和蛋白質(zhì)；uSDSSDS破膜作用，變性蛋白質(zhì)；破膜作用，

12、變性蛋白質(zhì)；uNaOHNaOH破膜，變性基因組破膜，變性基因組DNADNA；溶液溶液 5mol/LKAc60ml5mol/LKAc60ml，冰醋酸冰醋酸11.5ml11.5ml，H2O 28.5mlH2O 28.5ml，定容至定容至100ml100ml，并高壓滅菌。溶液終濃度為：并高壓滅菌。溶液終濃度為：K+3mol/LK+3mol/L，Ac5mol/LAc5mol/L。u溶液溶液IIIIII中和溶液，復(fù)性質(zhì)粒中和溶液，復(fù)性質(zhì)粒DNADNA；酚酚/ /氯仿（氯仿（1:11:1）u酚酚變性蛋白質(zhì)；變性蛋白質(zhì)；u氯仿氯仿萃取溶液中的酚；萃取溶液中的酚； 分為兩層，上層為水層，下層為酚氯仿混分為兩層

13、，上層為水層，下層為酚氯仿混合液。吸取時(shí)不要震蕩。合液。吸取時(shí)不要震蕩。乙醇乙醇u無(wú)水乙醇（無(wú)水乙醇（2 2倍體積）倍體積）沉淀質(zhì)粒沉淀質(zhì)粒DNADNA；u70%70%乙醇乙醇洗滌質(zhì)粒洗滌質(zhì)粒DNADNA沉淀，除去沉淀，除去沉淀中的鹽分；沉淀中的鹽分；電電 泳泳 Electrophoresis 電泳電泳帶電粒子在直流電場(chǎng)中向著電性相帶電粒子在直流電場(chǎng)中向著電性相反電極移動(dòng)的現(xiàn)象。反電極移動(dòng)的現(xiàn)象。電泳分析技術(shù)電泳分析技術(shù)利用電泳現(xiàn)象進(jìn)行物質(zhì)分利用電泳現(xiàn)象進(jìn)行物質(zhì)分離的技術(shù)。離的技術(shù)。二、電泳分析技術(shù)發(fā)展概況二、電泳分析技術(shù)發(fā)展概況 1809年年 發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象 1937年年 Tise

14、lius 自由界面電泳自由界面電泳 1948年年 Wieland 濾紙電泳濾紙電泳 1980年年 毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳 (capiliary electrophoresis三、電泳分析技術(shù)的分類三、電泳分析技術(shù)的分類4. 4. 按支持物的物理性狀不同按支持物的物理性狀不同濾紙及其他纖維薄膜電泳，如醋酸纖維素、玻璃纖維、濾紙及其他纖維薄膜電泳，如醋酸纖維素、玻璃纖維、聚氯乙烯纖維聚氯乙烯纖維凝膠電泳，如瓊脂、瓊脂糖、硅膠、淀粉膠、聚丙烯凝膠電泳，如瓊脂、瓊脂糖、硅膠、淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠電泳酰胺凝膠電泳粉末電泳，纖維素粉、淀粉、玻璃粉電泳粉末電泳，纖維素粉、淀粉、玻璃粉電泳絲狀電泳，如尼龍絲、

15、人造絲電泳絲狀電泳，如尼龍絲、人造絲電泳5. 5. 按支持物的裝置形式不同按支持物的裝置形式不同 平板式電泳平板式電泳 垂直板式電泳垂直板式電泳a)垂直柱式電泳垂直柱式電泳6 6. .根據(jù)電泳系統(tǒng)根據(jù)電泳系統(tǒng)pHpH是否連續(xù)是否連續(xù) 連續(xù)連續(xù)pHpH電泳電泳指電泳過(guò)程中指電泳過(guò)程中pHpH保持不變；保持不變； 不連續(xù)不連續(xù)pHpH電泳電泳指電極緩沖液和電泳支持物的不同區(qū)指電極緩沖液和電泳支持物的不同區(qū)段也有不同的段也有不同的pHpH ； 電泳技術(shù)的特點(diǎn)電泳技術(shù)的特點(diǎn): : 凡是帶電物質(zhì)均可應(yīng)用某一電泳技術(shù)進(jìn)行分離凡是帶電物質(zhì)均可應(yīng)用某一電泳技術(shù)進(jìn)行分離, ,并可并可進(jìn)行定性或定量分析進(jìn)行定性或

16、定量分析; ; 樣品用量極少樣品用量極少; ; 設(shè)備簡(jiǎn)單設(shè)備簡(jiǎn)單; ; 可在常溫進(jìn)行可在常溫進(jìn)行; ; 操作簡(jiǎn)便省時(shí)操作簡(jiǎn)便省時(shí); ; 分辨率高分辨率高. .移動(dòng)速度移動(dòng)速度以蛋白質(zhì)分子為例以蛋白質(zhì)分子為例: : 遷移率（遷移率（Mobility)Mobility)帶電顆粒在單位電帶電顆粒在單位電場(chǎng)強(qiáng)度下的泳動(dòng)速度。場(chǎng)強(qiáng)度下的泳動(dòng)速度。 V QV Q M = = M = = E 6 E 6 r r 五、影響電泳速度的因素五、影響電泳速度的因素1. 1.電場(chǎng)強(qiáng)度（電場(chǎng)強(qiáng)度（E E） E E電流電流熱效應(yīng)熱效應(yīng)支持介質(zhì)上的水分蒸發(fā)支持介質(zhì)上的水分蒸發(fā)樣品的熱樣品的熱變性變性 EE電泳速度慢電泳速度

17、慢延長(zhǎng)電泳時(shí)間延長(zhǎng)電泳時(shí)間樣品擴(kuò)散樣品擴(kuò)散區(qū)帶模糊不清區(qū)帶模糊不清分辨率下降分辨率下降2. 2. 帶點(diǎn)顆粒的半徑帶點(diǎn)顆粒的半徑 r r 阻力阻力電泳速度變慢電泳速度變慢3. 3. 支持物介質(zhì)支持物介質(zhì)吸附作用；電滲作用；分子篩作用吸附作用；電滲作用；分子篩作用 緩沖液緩沖液 離子強(qiáng)度（離子強(qiáng)度（I I）： pH pH電泳電泳 在一定電場(chǎng)強(qiáng)度下，在一定電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNADNA分子的遷移取決于分子篩效分子的遷移取決于分子篩效應(yīng)，即應(yīng)，即DNADNA分子本身的大小和構(gòu)型分子本身的大小和構(gòu)型( (相對(duì)分子質(zhì)量不同相對(duì)分子質(zhì)量不同的的DNADNA片段泳動(dòng)速度不一樣片段泳動(dòng)速度不一樣) )，且，且DNAD

18、NA分子的遷移速分子的遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。度與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。 凝膠電泳不僅可分離不同相對(duì)分子質(zhì)量的凝膠電泳不僅可分離不同相對(duì)分子質(zhì)量的DNADNA，也可，也可以分離相對(duì)分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的以分離相對(duì)分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNADNA分子。分子。瓊脂糖凝膠 從瓊脂中除去帶電荷的瓊脂膠后，剩下的不含磺酸從瓊脂中除去帶電荷的瓊脂膠后，剩下的不含磺酸基團(tuán)、羧酸基團(tuán)等帶電荷基團(tuán)的中性部分，結(jié)構(gòu)是基團(tuán)、羧酸基團(tuán)等帶電荷基團(tuán)的中性部分，結(jié)構(gòu)是鏈狀的聚半乳糖，易溶于沸水，冷卻后可依靠糖基鏈狀的聚半乳糖，易溶于沸水，冷卻后可依靠糖基間的氫鍵引力形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。間的氫鍵引力形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。 凝膠的網(wǎng)孔大小和凝膠的機(jī)械強(qiáng)度取決于瓊脂糖濃凝膠的網(wǎng)孔大小和凝膠的機(jī)械強(qiáng)度取決于瓊脂糖濃度。因此瓊脂糖凝膠可作為分子篩，常用于凝膠層度。因