實驗室分析方法驗證及案例

1、1分析方法驗證Method Validation 2005-102需要驗證的分析方法 藥典方法 完全驗證或部分驗證或系統(tǒng)適用性試驗 非藥典分析方法(新建立變更修改) 成品的方法(含量有關物質) 殘留溶劑測定方法 原料中間體測定方法 清洗驗證分析方法的驗證 其它雜質研究用方法 穩(wěn)定性批示方法 Stability indicating methods3方法適用范圍和可接受標準 方案中應確定,包括: 化合物的成分、組成和含量 輔料或添加劑 定量/定性 檢測限和定量限線性范圍 精密度和準確度 儀器的類型4驗證方案的內容驗證目的:方法原理使用范圍和目的.驗證人員及職責(驗證執(zhí)行人員、組長、經理、QA):

2、引用標準分析方法SOP 儀器及其操作參數(shù)需要的檢驗材料、試劑及標準物質等; 溶液的制備:標準、樣品溶液等的制備; 測定的過程:如平衡時間,空白、標準、樣品測定次序,系統(tǒng)適用性試驗(項目、指標),測定參數(shù)等; 計算公式及說明。5驗證方案的內容驗證項目可接受標準驗證內容 驗證項目1 測定規(guī)程（溶液配制、測定條件、測定方法） 數(shù)據(jù)表格 計算公式及結果統(tǒng)計 結論 記錄與圖譜要求 驗證項目2樣品測定（包括系統(tǒng)適用性試驗等）驗證評價及結論要求。驗證方案的起草、審核、批準6驗證報告內容摘要：方法原理、檢驗目的和應用范圍；化合物類型；驗證結果及結論。驗證人員及職責測定方法描述 驗證項目1 測定規(guī)程（溶液配制、

3、測定條件、測定方法） 數(shù)據(jù)表格 計算公式及結果統(tǒng)計 結論 記錄與圖譜、標準曲線 驗證項目27驗證報告內容樣品測定（包括系統(tǒng)適用性試驗等）驗證評價及結論。起草、審核、批準。附件：SOP、驗證記錄、圖譜、標準曲線復印件。8分析方法分類 標準分析方法：指法定分析方法，包括各國現(xiàn)行的藥典（USP、EP）或其實公認的的標準參考資料中的方法。 非標準化分析方法：新建立的分析方法或修改了的標準化分析方法都屬于非標準分析方法。 在根據(jù)方法類型，選擇不同的驗證項目進行分析方法驗證9分析方法驗證重視程度 驗證的方法類型和內容必須反映分析的目的和API生產的步驟。 原料（GB） 溶劑 API 包裝材料 關鍵中間體G

4、MP要求驗證的重要性遞增 10分析方法驗證的前提 儀器：已校驗，校驗同期之內； 人員：培訓；熟悉方法和儀器； 對照品：法定標準品、商業(yè)標準品、工作標準品； 材料：試劑；容器 穩(wěn)定性：溶液和試劑在檢驗周期的穩(wěn)定性，尤其使用自動進樣器。 方法的開發(fā)以完成，對方法草案進行驗證。11分析方法驗證檢查的關注點 驗證的SOP 驗證方案：起草、審核和批準 驗證項目和可接受標準 驗證用標準品和樣品 驗證報告：起草、審核批準12標準分析方法驗證 Q7A：除非所使用方法是載于現(xiàn)行法定藥典或其它公認的標準參考資料內，分析方法應進行驗證。盡管如此，所有所用方法的適用性應在實際使用情況予以證實并記錄成文。 兩個要求：實

5、驗室必須滿足標準方法規(guī)定的性能指標；標準分析方法驗證的數(shù)據(jù)必須充分滿足實驗室測定的要求。13標準分析方法驗證 對標準分析方法進行評價，以確定需要進行驗證的程度。 有三種選擇：不需要驗證（系統(tǒng)適用性試驗 ）部分驗證和完全驗證。 適用性考慮的因素有：用戶的儀器、人員、試劑和環(huán)境條件證明可以滿足方法規(guī)定的分析要求，則只需規(guī)定和執(zhí)行系統(tǒng)適用性試驗即可，方法無需再驗證； 評價：化合物的類型、方法的檢測限和定量限、線性范圍、儀器的類型及其它的存放地和環(huán)境條件等。14標準分析方法驗證 企業(yè)內控的要求 藥品申報注冊要求 檢驗方法性能的再驗證 一些臨介項目，如雜質檢查的定量限和檢測限，應予以證明。15非標準分析

6、方法新建立修改或變更16驗證的方法類型分析方法類型有四類： 鑒別； 雜質定量； 雜質限度檢查； 含量 原料藥含量或制劑中有效成份測定； 藥品溶出度釋放度測定。17分析方法的驗證項目1. Specificity(專屬性)2. Precision(精密度)3.Accuracy(準確度)4.Linesrity(線性)5.Range(范圍)6.Detection Limit(檢測限)7.Quantitation Limit(定量限)8.Robustness(耐用性) （USP）18驗證內容 分析方法的驗證，一般根據(jù)方法的類型和檢測的要求，有驗證方案中擬訂驗證的內容和可接受標準； 專屬性精密度（包括重復

7、性中間精密度）線性范圍準確度檢測限和定量限。 耐用性只有在分析方法建立的適當階段或特殊要求時予以考慮進行驗證。19驗證的方法類型與驗證內容鑒別雜質定量雜質限度含量/效價溶出度準確度-+-+精密度重復性中間精密度-+(1)-+專屬性+檢測限-+-定量限-+-線性-+-+范圍-+-+20驗證的方法類型與驗證內容(補充) “+”代表需要 “-”代表不需要 （1）有了重現(xiàn)性驗證情況下，驗證可不需要21專屬性（Specificity）定義 專屬性 是指在其他成份（如雜質、降解產物、輔料等）可能存在的情況下，采用的方法能準確測定出被測物的特性；能反映該分析方法在有共存物時對供試物準確而不受干擾的測定能力。

8、22專屬性的測定 鑒別反應：能與可能共存的物質或結構相似的化合物區(qū)分。 含量測定和雜質測定 分離度評價色譜法和其他分離方法； 已知的雜質定性； 破壞性試驗證明 DAD（PDA）峰純度檢查。23準確度（Accuracy） 準確度是指用該方法測定的結果與真實值或參考值接近的程度。 一般以回收率（%）表示。 準確度應在不同測定項目規(guī)定的限度范圍內建立。24準確度測定 原料藥；已知純度的對照品或樣品進行測定 依據(jù)線性數(shù)據(jù)結果推算 制劑可用配料試驗來測定收率 雜質定量測定的準確度 標準加入法：向制劑中加入已知量雜質測定 雜質標準品 準確度可接受的范圍根據(jù)方法的類型、測量的濃度范圍及方法的本身的要求來確定

9、（常量、微量）25精密度（ Precision） 精密度是指在規(guī)定的測試條件下，同一個均勻樣品，經過多次取樣測定所得一系列結果之間的接近程度。 精密度用相對標準偏差（RSD）來表示。 精密度有三人評價水平：重復性、中間精密度、重現(xiàn)性。26重復性（Repeatability ） 在相同操作條件下，由個分析人員在較短的時間連續(xù)測定所得結果的精密度為重復性； 不同溶液制備27重復性測定 用100%的測試濃度至少用6次測定結果進行評價。 或3個濃度（80%、100%、120%）3次 重復性用RSD來評價。 RSD范圍應根據(jù)方法的類型、測量的濃度范圍及方法本身的要求來確定。 常量測定，RSD一般不大于2

10、.0%。28中間精密度（Intermediate Precision） 在同一個實驗室內，在 不同時間 或不同分析人員 或用不同設備 測定結果的精密度。29中間精密度的測定 變動因素有不同日期不同分析人員不同設備。 以T-檢驗評價（6次結果的平均值之間差異） 以F-檢驗評價（6次結果的精密度之間差異） 評價不同因素之間測定結果之間有無顯著性差異。30重現(xiàn)性（Reproducibility） 在不同實驗室，測定結果的精密度（也稱為實驗室間的精密度）。 通常在分析方法藥典標準化時才考慮。31檢測限（Limit of detection, LOD） 是在指定的分析方法條件下，樣品中被測物能被檢出的最

11、低量。 是一種限度試驗的參數(shù)，用以表示測量方法在所述條件下對樣品中供試物的最低檢出量，但不需要準確定量，只需指出高于或低于該規(guī)定濃度即可。 通常用樣品中百分濃度或 ppm表示。32檢測限測定 直觀評價法（比色，TLC等） 信噪比法 以信噪比為23:1時相應濃度或注入儀器的量來表確定檢測限。如色譜方法 標準偏差和斜率法（UV、AA等） 檢測限=3.3SD/S 檢測限（%或ppm）:C min/樣品濃度33定量限（Limit of Quantitation, LOQ） 是在指定的分析方法條件下，樣品中被測物能被定量檢出的最低量。 其測定結果應具一定準確度和精密度。 是一種含量測定的定量參數(shù)，雜質和

12、降解產物的定量測定時應確定。 通常用以樣品中的百分濃度或ppm 表示。34定量限測定 直觀評價法（比色，TLC等） 信噪比法 以信噪比為10:1時相應濃度或注入儀器的量來表確定檢測限。如色譜方法 標準偏差和斜率法（UV、AA等） 檢測限=10SD/S 檢測限（%或ppm）:C min/樣品濃度35線性（Linearity） 指在給范圍內，測試結果與試樣中被測物濃度呈正比的程度。 或試驗結果（或測得響應信號）與供試物濃度（或質量）的變化成線性關系。36線性測定 線性關系的測定應在規(guī)定的范圍內進行。 經精密稀釋或稱量，至少制備5份供試液。每個濃度測定13次，以測得的響應信號（或平均值）對被測物濃度

13、進行線性回歸。 相關系數(shù)R越接近1.00，表明越呈線性。 方法目的不同，R的要求不同。（R0.999；殘留溶劑、清洗方法0.99） 線性回歸軟件：Origin 5.0。37范圍（Range） 分析方法的范圍指能達到一定的精密度、準確度和線性的條件下，測試方法適用的樣品中被測物上限和下限濃度（含量）之間的區(qū)別。 通常以分析方法測定結果相同的單位表示，如%或ppm。38范圍確定 原料藥和制劑含量：80%120%； 制劑含量均勻度檢查，范圍應為測試濃度的70%130%,其它劑型看藥典。 雜質測定：擬訂出規(guī)定限度的50%120%。 一些情況下，定量限日常測定結果150%，使測定結果在方法函蓋的范圍之內

14、。 如果含量測定與雜質檢查同時測定，用百分歸一化法，則線性范圍應為雜質規(guī)定下限的-20%至含量限度（或上限）的+20%。 注意：樣品測定的結果應包括在方法的范圍之內。39耐用性（Robustness） 指在測定條件有較小變動時（但仍在正常允許使用范圍內），測定結果不受影響的程度，也即證明方法的可靠性。 開始分析方法研究時，應考慮其耐用性。 如測定條件要求苛刻，則應在方法中寫明。 如溶液穩(wěn)定性；流動相組成/pH，不同牌號色譜柱，柱溫，流速等。40幾個典型分析方法的驗證案例 HPLC含量分析方法驗證 HPLC有關物質分析方法驗證 GC殘留溶劑分析方法驗證 UV清洗驗證分析方法驗證41HPLC含量分

15、析方法驗證項目 系統(tǒng)適用性試驗 系統(tǒng)精密度（峰面積的RSD） 柱效 分離度 對稱因子 外加：3批樣品測定（驗證系統(tǒng)適用性） USP27新規(guī)定42HPLC含量測定驗證的項目驗證的項目指標(參考)系統(tǒng)適用性關鍵參數(shù);重復性等專屬性分離度1.5準確度98.0102.0%精密度重復性中間精密度RSD2.0%RSD2.0%線性線性方程,R0.999范圍限度的80%120%耐用性依據(jù)方法特點和公司要求制定項目43HPLC有關物質分析方法驗證的項目 系統(tǒng)適用性試驗 系統(tǒng)精密度（峰面積的RSD）n=5 or 6 柱效 分離度 對稱因子44驗證的項目驗證項目雜質定量指標(參考)專屬性+分離度1.5準確度+98.

16、0102.0%精密度重復性中間精密度+RSD2.0%RSD2.0%檢測限+依據(jù)雜質限度評價，遠低于定量限+依據(jù)雜質限度評價，遠低于線性+線性方程,R0.999范圍+限度的50%150%或更寬，包括實際結果45HPLC有關物質分析方法驗證報告評述 關鍵點： 雜質對照品：原料、中間體、付產物、降解產物 線性范圍 每個雜質的LOD、LOQ46殘留溶劑分析方法驗證項目 系統(tǒng)適用性試驗 系統(tǒng)精密度（峰面積的RSD）n=6 柱效 分離度 對稱因子47殘留溶劑驗證項目驗證項目雜質定量指標(參考)專屬性+分離度3準確度+95.0105.0%精密度重復性中間精密度+RSD5.010.0%RSD5.010.0%檢

17、測限+依據(jù)雜質限度評價定量限+依據(jù)雜質限度評價線性+線性方程,R0.99范圍+LOQ限度的120%，包括實際結果48USP OVI USP有機揮發(fā)性雜質OVI 四個溶劑：氯仿、二氯甲烷、1,4二氯六環(huán)、三氯乙烯 專論規(guī)定 工藝未使用，不用檢測。49EP 殘留溶劑EP 4.8殘留溶劑（四類溶劑） 5.4 Residual solvents 殘留溶劑目錄和限度 2.4.24. Identification and control of residual solvents 殘留溶劑測定方法規(guī)程（選擇其一） LIMITS OF RESIDUAL SOLVENTS 4.1. SOLVENTS TO BE AVOIDED 苯 4.2. SOLVENTS TO BE LIMITED 4.3. SOLVENTS WITH LOW TOXIC POTENTIAL 4.4. SOLVENTS FOR WHICH NO ADEQUATE TOXICOLOGICAL DATA WAS FOUND50殘留溶劑分析方法驗證報告評述 關鍵點：