柱層析原理詳解課件

1、CONFIDENTIALA Introduction to Chromatography 2006.07 Column chromatography Pre TLCCONFIDENTIALColumn Chromatography CONFIDENTIALCONFIDENTIAL柱層v 原理v 吸附劑v 相互作用v 影響分離的參數(shù)v 裝柱v 上樣v 洗脫技術(shù)v 柱的監(jiān)控CONFIDENTIAL 有機(jī)化學(xué)家能用的最現(xiàn)代化和尖端的方法全部包括某種類型的層析法有機(jī)化學(xué)家能用的最現(xiàn)代化和尖端的方法全部包括某種類型的層析法. 層析層析法的定義是法的定義是, 通過在兩相之間的分配通過在兩相之間的分配, 使

2、一個(gè)由兩種或多種不同化合物使一個(gè)由兩種或多種不同化合物(有時(shí)有時(shí)是離子是離子) 組成的混合物得到分離組成的混合物得到分離, 這兩相中一相是固定的這兩相中一相是固定的, 另一相則是移動(dòng)的另一相則是移動(dòng)的. 根據(jù)所包括的兩個(gè)相的性質(zhì)根據(jù)所包括的兩個(gè)相的性質(zhì), 可有各種可能形式的層析法可有各種可能形式的層析法; 供普通使用的有供普通使用的有固固-液液(柱柱, 薄層和紙薄層和紙), 液液-液和氣液和氣-液液(蒸氣相蒸氣相) 層析法層析法. 所有層析法所根據(jù)的工作原理都是憑借于欲待分離的幾種物質(zhì)在將它們進(jìn)所有層析法所根據(jù)的工作原理都是憑借于欲待分離的幾種物質(zhì)在將它們進(jìn)行分配的兩相之間的溶解度行分配的兩相

3、之間的溶解度(或吸附度或吸附度) 上的差別上的差別.v原理原理CONFIDENTIALv吸附劑吸附劑 柱層析法是以吸附度和溶解度這兩者為根據(jù)的一種技術(shù)柱層析法是以吸附度和溶解度這兩者為根據(jù)的一種技術(shù), 它是一種固它是一種固-液相間液相間進(jìn)行分配的技術(shù)進(jìn)行分配的技術(shù). 其中的固體幾乎可以是任何物料其中的固體幾乎可以是任何物料, 只要不溶解于附著的液相只要不溶解于附著的液相中即行中即行. 但最常用的一些固體是硅膠但最常用的一些固體是硅膠(SiO2 xH2O) 也叫做硅酸也叫做硅酸, 和氧化鋁和氧化鋁(Al2O3 xH2O). 這些化合物均用其粉狀或磨細(xì)的形式這些化合物均用其粉狀或磨細(xì)的形式(通常為

4、通常為200至至400目目) 層析層析法中所用的極大多數(shù)氧化鋁系從粗的鋁礦石法中所用的極大多數(shù)氧化鋁系從粗的鋁礦石(Al2O3 xH2O + Fe2O3) 制得制得.將鋁將鋁土礦石溶于熱氫氧化鈉溶液中土礦石溶于熱氫氧化鈉溶液中, 過濾除去不溶的氧化鐵過濾除去不溶的氧化鐵; 礦石中的氧化鋁則成礦石中的氧化鋁則成為可溶性的兩性氫氧化物為可溶性的兩性氫氧化物 Al(OH)4-. 這個(gè)氫氧化物用這個(gè)氫氧化物用CO2(它能降低它能降低PH) 使沉淀使沉淀成為成為 Al(OH)3 , 在加熱時(shí)在加熱時(shí), 此此Al(OH)3失水成為純的失水成為純的 Al2O3. CONFIDENTIAL吸附劑吸附劑按此方法

5、制得的氧化鋁稱為按此方法制得的氧化鋁稱為堿性氧化鋁堿性氧化鋁. 因?yàn)樗耘f含一些氫氧化物因?yàn)樗耘f含一些氫氧化物. 堿性氧堿性氧化鋁不能用于對堿敏感的化合物的層析分離化鋁不能用于對堿敏感的化合物的層析分離. 因此因此, 要用酸加以洗滌以便將堿要用酸加以洗滌以便將堿中和中和, 這樣便得到這樣便得到酸性氧化鋁酸性氧化鋁. 這種物料仍然不能令人滿意這種物料仍然不能令人滿意, 除非經(jīng)過足夠的水除非經(jīng)過足夠的水洗以除去所有的酸洗以除去所有的酸, 才能獲得最適用于柱層析的物料才能獲得最適用于柱層析的物料, 稱為稱為中性氧化鋁中性氧化鋁. 如果化如果化合物是酸敏感的合物是酸敏感的, 必須使用堿性或中性氧化鋁

6、必須使用堿性或中性氧化鋁, 必須仔細(xì)的弄清你在層析法中必須仔細(xì)的弄清你在層析法中所用的氧化鋁屬於哪一類型所用的氧化鋁屬於哪一類型. 硅膠除了以適用于層析法的形式供應(yīng)外別無任何硅膠除了以適用于層析法的形式供應(yīng)外別無任何其他類型其他類型.CONFIDENTIALv 相互作用相互作用若將粉末狀或磨細(xì)的氧化鋁若將粉末狀或磨細(xì)的氧化鋁(或硅膠或硅膠) 加入至含有一種有機(jī)化合物的溶液中時(shí)加入至含有一種有機(jī)化合物的溶液中時(shí), 一部分有機(jī)物將會(huì)吸附或黏在氧化鋁細(xì)粒上一部分有機(jī)物將會(huì)吸附或黏在氧化鋁細(xì)粒上, 使有機(jī)分子和氧化鋁結(jié)合的力有使有機(jī)分子和氧化鋁結(jié)合的力有好幾種好幾種. 這些力按其種類不同這些力按其種類

7、不同, 強(qiáng)度不一強(qiáng)度不一. 非極性化合物只用非極性化合物只用范德華范德華( Van der waals) 力力與氧化鋁結(jié)合與氧化鋁結(jié)合. 這種力較弱這種力較弱, 故非極性化合物不能結(jié)合得很牢除非它故非極性化合物不能結(jié)合得很牢除非它們的分子量非常大們的分子量非常大. 極性有機(jī)化合物所用的相互作用力則較為重要極性有機(jī)化合物所用的相互作用力則較為重要,此中所用此中所用之力或?yàn)橹驗(yàn)?偶極偶極-偶極相互作用力偶極相互作用力, 或?yàn)槟撤N或?yàn)槟撤N 直接的相互作用力直接的相互作用力(配位作用配位作用, 氫鍵氫鍵, 或鹽的形成等或鹽的形成等). CONFIDENTIAL相互作用相互作用這些相互作用的強(qiáng)度變化

8、次序大致是這些相互作用的強(qiáng)度變化次序大致是: 鹽的形成鹽的形成配位作用配位作用氫鍵氫鍵偶極偶極-偶極相偶極相互作用力互作用力范德華力范德華力CONFIDENTIAL相互作用相互作用對於溶解度來說對於溶解度來說, 也有類似的法則也有類似的法則. 極性溶劑對極性化合物的溶解比非極性溶極性溶劑對極性化合物的溶解比非極性溶劑更為有效劑更為有效; 非極性化合物則最易被非極性溶劑所溶解非極性化合物則最易被非極性溶劑所溶解. 因此任何一個(gè)給定溶因此任何一個(gè)給定溶劑洗下吸附在氧化鋁或硅膠上的化合物的能力大小幾乎直接決定于該溶劑的劑洗下吸附在氧化鋁或硅膠上的化合物的能力大小幾乎直接決定于該溶劑的相對極性相對極性

9、. 對於每一被吸附著的物料來說對於每一被吸附著的物料來說, 可以想象它們在吸附劑和溶劑之間可以想象它們在吸附劑和溶劑之間都有一種分配平衡都有一種分配平衡, 即不斷地從溶液中吸附分子又不斷地向溶液中解吸分子即不斷地從溶液中吸附分子又不斷地向溶液中解吸分子. 達(dá)到平衡時(shí)最終被吸附在顆粒上的分子的平均數(shù)既取決于所涉及的特殊分子達(dá)到平衡時(shí)最終被吸附在顆粒上的分子的平均數(shù)既取決于所涉及的特殊分子又取決于吸附劑必須與之競爭的溶劑的溶解效力又取決于吸附劑必須與之競爭的溶劑的溶解效力.CONFIDENTIALv 影影響分離的參數(shù)響分離的參數(shù) 層析法是分離混合物的常用方法層析法是分離混合物的常用方法, 許多可以

10、改變的因素使層析法許多可以改變的因素使層析法成為一種多方面適用的方法成為一種多方面適用的方法. 這些因素包括這些因素包括: 1. 選定的吸附劑選定的吸附劑 2. 選定的溶劑極性選定的溶劑極性 3. 相對于需待分離的物料量的柱子尺寸相對于需待分離的物料量的柱子尺寸(長度和直徑長度和直徑) 4. 洗脫洗脫(或流動(dòng)或流動(dòng)) 的速率的速率CONFIDENTIALA.吸附劑吸附劑吸附劑的選擇通常要根據(jù)需待分離的化合物的類型而定吸附劑的選擇通常要根據(jù)需待分離的化合物的類型而定. 主要有主要有: 纖維素纖維素, 淀粉和糖類淀粉和糖類: 用于對酸堿相互作用非常敏感的多官能團(tuán)的動(dòng)用于對酸堿相互作用非常敏感的多官

11、能團(tuán)的動(dòng), 植物性化植物性化合物合物(天然產(chǎn)物天然產(chǎn)物) 硅酸鎂硅酸鎂: 分離乙酰分離乙酰化的糖類化的糖類, 甾體化合物和香精油甾體化合物和香精油. 硅膠和合成硅酸鎂載體硅膠和合成硅酸鎂載體(Florisil): 對大多數(shù)化合物來說相對地比較溫和對大多數(shù)化合物來說相對地比較溫和, 故可故可廣泛適用于種種官能團(tuán)廣泛適用于種種官能團(tuán)烴烴, 醇醇, 酮酮, 酯酯, 羧酸羧酸, 偶氮化合物偶氮化合物, 胺胺. CONFIDENTIAL吸附劑吸附劑 氧化鋁氧化鋁: 分為酸性分為酸性(PH=4), 中性中性, 堿性堿性(PH=10). 這種吸附劑特別適用于分離象羧這種吸附劑特別適用于分離象羧酸和氨基酸之類

12、的酸性物質(zhì)酸和氨基酸之類的酸性物質(zhì). 堿性氧化鋁的堿性氧化鋁的PH約為約為10, 故適用于分離胺故適用于分離胺. 中性中性氧化鋁可用于分離各種非酸性和非堿性物質(zhì)氧化鋁可用于分離各種非酸性和非堿性物質(zhì).纖維素淀粉糖類硅酸鎂硫酸鈣硅酸硅膠人造硅酸鎂氧化鎂氧化鋁活性炭（Norit)與極性化合物發(fā)生結(jié)合作用的能力遞增次序CONFIDENTIAL吸附劑吸附劑* 應(yīng)該特別注意的是應(yīng)該特別注意的是, 這個(gè)次序是近似的這個(gè)次序是近似的, 可變的可變的. 如氧化鋁和硅膠的強(qiáng)度或分離如氧化鋁和硅膠的強(qiáng)度或分離能力在很大程度上取決于其中所存在的水能力在很大程度上取決于其中所存在的水. 水能非常緊密地與這兩種吸附劑結(jié)

13、水能非常緊密地與這兩種吸附劑結(jié)合合, 占去顆粒上的一些部位占去顆粒上的一些部位, 這些部位本來是可供平衡用的這些部位本來是可供平衡用的. 因此如果將吸附劑因此如果將吸附劑里面加進(jìn)水里面加進(jìn)水, 我們便稱為失活我們便稱為失活. 無水氧化鋁或硅膠則是高度活化的無水氧化鋁或硅膠則是高度活化的, 這種高活性這種高活性是吸附劑需要避免的是吸附劑需要避免的, 因?yàn)檫@種高活性會(huì)使得吸附劑和待分離的化合物發(fā)生某因?yàn)檫@種高活性會(huì)使得吸附劑和待分離的化合物發(fā)生某些形式的破壞作用和分解作用些形式的破壞作用和分解作用, 往往能引起某些類型的溶質(zhì)化合物發(fā)生分子重往往能引起某些類型的溶質(zhì)化合物發(fā)生分子重排反應(yīng)排反應(yīng).CO

14、NFIDENTIALB 溶劑溶劑石油醚環(huán)己烷四氯化碳苯二氯甲烷氯仿二乙醚乙酸乙酯吡啶丙酮乙醇甲醇水乙酸供層析用的溶劑對于極性官能團(tuán)的“溶劑能力”和極性遞增次序各類溶劑的極性次序如下表各類溶劑的極性次序如下表: CONFIDENTIAL溶劑溶劑在層析分離過程中在層析分離過程中, 若擬改變?nèi)軇┑臉O性若擬改變?nèi)軇┑臉O性, 要采取一些預(yù)防措施要采取一些預(yù)防措施. 務(wù)須避免迅速務(wù)須避免迅速從一種溶劑換成另一種溶劑從一種溶劑換成另一種溶劑(尤其是當(dāng)使用硅膠或氧化鋁時(shí)尤其是當(dāng)使用硅膠或氧化鋁時(shí)). 通常通常, 應(yīng)將新溶應(yīng)將新溶劑以小百分比慢慢混入正在使用的溶劑中劑以小百分比慢慢混入正在使用的溶劑中. 如不這

15、樣做如不這樣做, 柱內(nèi)填重料往往會(huì)出柱內(nèi)填重料往往會(huì)出現(xiàn)縫隙現(xiàn)縫隙. 縫隙之所以發(fā)生是由於氧化鋁或硅膠與溶劑混合時(shí)放熱所致縫隙之所以發(fā)生是由於氧化鋁或硅膠與溶劑混合時(shí)放熱所致. 溶劑將溶劑將吸附劑溶劑化吸附劑溶劑化, 從而形成一種弱鍵而放出熱量從而形成一種弱鍵而放出熱量. 溶劑溶劑 + 氧化鋁氧化鋁 (氧化鋁氧化鋁 溶劑溶劑) + 熱熱 往往能在局部地方生成足能使溶劑蒸發(fā)的熱量往往能在局部地方生成足能使溶劑蒸發(fā)的熱量. 蒸氣的產(chǎn)生造成了氣泡蒸氣的產(chǎn)生造成了氣泡, 氣泡又氣泡又把柱內(nèi)填充料擠開把柱內(nèi)填充料擠開, 這就是所謂的縫隙這就是所謂的縫隙 .CONFIDENTIAL溶劑溶劑使用氧化鋁或硅膠

16、時(shí)使用氧化鋁或硅膠時(shí), 要避免使用某些溶劑要避免使用某些溶劑, 特別是酸性的特別是酸性的, 堿性的和高活性形堿性的和高活性形式的溶劑式的溶劑. 舉例來說舉例來說, 丙酮會(huì)與任何一個(gè)這樣的吸附劑通過醇醛縮合作用二聚丙酮會(huì)與任何一個(gè)這樣的吸附劑通過醇醛縮合作用二聚成乙酰成乙酰丙酮丙酮. 當(dāng)用乙酸乙酯或醇類作為洗脫液時(shí)當(dāng)用乙酸乙酯或醇類作為洗脫液時(shí), 會(huì)使酯類的混合物發(fā)生酯交會(huì)使酯類的混合物發(fā)生酯交換作用換作用. 最后最后, 更活潑的溶劑更活潑的溶劑(吡啶吡啶, 甲醇甲醇, 水和乙酸水和乙酸) 會(huì)溶解和洗脫一部分吸附會(huì)溶解和洗脫一部分吸附劑本身劑本身.CONFIDENTIAL溶劑溶劑烴烯烴醚鹵代烴芳

17、香族化合物酮醛酯醇胺酰胺酸，強(qiáng)堿供層析用的溶劑（洗脫劑）最快（可用非極性溶劑洗脫）洗脫的次序最慢（必須用極性溶劑）CONFIDENTIAL溶劑溶劑一般來說一般來說, 各類化合物被洗脫時(shí)各類化合物被洗脫時(shí), 非極性化合物最先洗脫非極性化合物最先洗脫, 極性化合物最后洗脫極性化合物最后洗脫. 可是可是, 分子量也是一個(gè)決定洗脫次序的因素分子量也是一個(gè)決定洗脫次序的因素. 高分子量的非極性化合物將比低高分子量的非極性化合物將比低分子量的非極性化合物洗脫得慢分子量的非極性化合物洗脫得慢, 甚至可能被某些極性化合物所超過甚至可能被某些極性化合物所超過. 具有下具有下列極性基團(tuán)的化合物列極性基團(tuán)的化合物,

18、 其吸附能力按下列排列次序遞增其吸附能力按下列排列次序遞增:CONFIDENTIALC 柱的尺寸和吸附劑量柱的尺寸和吸附劑量為了能使一定數(shù)量的樣品達(dá)到良好分離為了能使一定數(shù)量的樣品達(dá)到良好分離, 還應(yīng)正確地選定柱尺寸和吸附劑的量還應(yīng)正確地選定柱尺寸和吸附劑的量一條經(jīng)驗(yàn)規(guī)律是一條經(jīng)驗(yàn)規(guī)律是, 吸附劑的量應(yīng)是需待分離的混合物重量的吸附劑的量應(yīng)是需待分離的混合物重量的25至至30倍倍. 另外另外, 所用柱子的高度和直徑之比應(yīng)大約為所用柱子的高度和直徑之比應(yīng)大約為8:1. 但要注意的一點(diǎn)是但要注意的一點(diǎn)是, 柱的尺寸和長度及需用吸附劑的量還決定于分離的困難程柱的尺寸和長度及需用吸附劑的量還決定于分離的

19、困難程度度. 不易分離的化合物可能需要更長的柱子和更多的用量不易分離的化合物可能需要更長的柱子和更多的用量.CONFIDENTIAL柱的尺寸和吸附劑量柱的尺寸和吸附劑量某些典型樣品量適用的柱尺寸和吸附劑數(shù)量某些典型樣品量適用的柱尺寸和吸附劑數(shù)量 樣品量樣品量 吸附劑量吸附劑量 柱直徑柱直徑 柱高柱高 0.01g 0.3g 3.5mm 30mm 0.1g 3g 7.5mm 60mm 1.00g 30g 16.0mm 130mm 10.00g 300.0g 35.0mm 280mmCONFIDENTIALD 流速流速 溶劑流經(jīng)柱子的速率對於決定一個(gè)分離能進(jìn)行得多好也起著作用溶劑流經(jīng)柱子的速率對於決

20、定一個(gè)分離能進(jìn)行得多好也起著作用. 一般來一般來說說, 需待分離的化合物在柱上逗留愈久需待分離的化合物在柱上逗留愈久, 其在固定相和移動(dòng)相之間的平衡其在固定相和移動(dòng)相之間的平衡愈廣泛愈廣泛. 結(jié)果可以使較為相似的化合物得到分離結(jié)果可以使較為相似的化合物得到分離. 然而如果流速過慢然而如果流速過慢, 則混則混合物中各個(gè)物質(zhì)到了溶劑中后其在溶劑中的擴(kuò)散速率可能變得大於這些合物中各個(gè)物質(zhì)到了溶劑中后其在溶劑中的擴(kuò)散速率可能變得大於這些物質(zhì)沿柱下行速率物質(zhì)沿柱下行速率. 在這種情況下譜帶變寬在這種情況下譜帶變寬, 反而使分離效果變差反而使分離效果變差. 事實(shí)上事實(shí)上, 在溶劑極性相同的情況下在溶劑極性

21、相同的情況下, 溶劑的流速一般而言溶劑的流速一般而言（HPLC，MPLC除外），除外），流速均以越快越好，因?yàn)橐话愣粤鲃?dòng)相流速與板高成反比，而板高越流速均以越快越好，因?yàn)橐话愣粤鲃?dòng)相流速與板高成反比，而板高越小越好，所以流動(dòng)相流速越快越好。所以快速小越好，所以流動(dòng)相流速越快越好。所以快速CONFIDENTIAL流速流速（加壓）柱層析的效果比一般重力柱層析好（加壓）柱層析的效果比一般重力柱層析好。CONFIDENTIALv 裝柱裝柱柱層析法中最關(guān)鍵性的操作是裝柱柱層析法中最關(guān)鍵性的操作是裝柱. 柱子在用吸附劑填充時(shí)必須裝得非常均勻柱子在用吸附劑填充時(shí)必須裝得非常均勻, 如果裝得不整齊如果裝得

22、不整齊, 出現(xiàn)氣泡出現(xiàn)氣泡, 縫隙等會(huì)明顯影響分離效率縫隙等會(huì)明顯影響分離效率. 主要存在兩種情況主要存在兩種情況: 一一: 譜帶的最前面的邊緣或稱前沿不水平譜帶的最前面的邊緣或稱前沿不水平, 如果兩條譜帶緊靠在一起而又無水如果兩條譜帶緊靠在一起而又無水平的譜帶前沿平的譜帶前沿, 那么要想收集每一條譜帶而把另外一條譜帶完全排除在外是不那么要想收集每一條譜帶而把另外一條譜帶完全排除在外是不可能的可能的! 造成這個(gè)問題的因素有兩個(gè)造成這個(gè)問題的因素有兩個(gè): 1. 吸附劑填充料的頂面不呈水平吸附劑填充料的頂面不呈水平. 2. 柱子未被夾柱子未被夾持在兩個(gè)平面中持在兩個(gè)平面中(即前即前-后后, 左左-

23、右兩個(gè)平面右兩個(gè)平面) 完全垂直的位置完全垂直的位置. CONFIDENTIAL裝柱裝柱二二: 譜帶前沿的一部分從譜帶的主體部分中間向前伸出譜帶前沿的一部分從譜帶的主體部分中間向前伸出, 此時(shí)發(fā)生的現(xiàn)象稱為此時(shí)發(fā)生的現(xiàn)象稱為流動(dòng)或稱溝流流動(dòng)或稱溝流. 造成這種現(xiàn)象的原因主要是吸附劑表面不平整或在填料中有任何不平整性或氣造成這種現(xiàn)象的原因主要是吸附劑表面不平整或在填料中有任何不平整性或氣泡泡.CONFIDENTIALCONFIDENTIALCONFIDENTIAL裝柱裝柱A 濕法濕法(漿液法漿液法) 即吸附劑以漿液狀態(tài)被裝入管內(nèi)即吸附劑以漿液狀態(tài)被裝入管內(nèi). 漿液是一種溶劑和一種不溶解的固體的混

24、漿液是一種溶劑和一種不溶解的固體的混合物合物. 操作方法是將固體吸附劑慢慢加入盛有大量溶劑的容器中操作方法是將固體吸附劑慢慢加入盛有大量溶劑的容器中. 注意要嚴(yán)格注意要嚴(yán)格遵守這種加料次序遵守這種加料次序(加吸附劑至溶劑加吸附劑至溶劑), 因?yàn)槲絼┰诩尤氲饺軇┲袝r(shí)會(huì)因溶劑因?yàn)槲絼┰诩尤氲饺軇┲袝r(shí)會(huì)因溶劑化效應(yīng)而放熱化效應(yīng)而放熱. 若向吸附劑內(nèi)加溶劑若向吸附劑內(nèi)加溶劑, 由於發(fā)熱會(huì)使溶劑幾乎與加入速率一樣由於發(fā)熱會(huì)使溶劑幾乎與加入速率一樣快地氣化逸出快地氣化逸出, 使最終的混合物不均勻或結(jié)塊使最終的混合物不均勻或結(jié)塊. 因此通常的做法是將吸附劑加因此通常的做法是將吸附劑加入溶劑中入溶劑中,

25、邊加邊旋搖邊加邊旋搖, 使其形成一種稠厚但能流動(dòng)的漿液使其形成一種稠厚但能流動(dòng)的漿液. 漿液應(yīng)不斷旋搖直漿液應(yīng)不斷旋搖直至已呈均勻狀態(tài)且相對地不再含有空氣泡為宜至已呈均勻狀態(tài)且相對地不再含有空氣泡為宜.CONFIDENTIAL裝柱裝柱 裝柱時(shí)裝柱時(shí), 先向柱內(nèi)充入溶劑至約半滿先向柱內(nèi)充入溶劑至約半滿, 然后開啟活塞讓溶劑慢慢流下然后開啟活塞讓溶劑慢慢流下, 借助旋借助旋搖動(dòng)作使?jié){液混合搖動(dòng)作使?jié){液混合, 然后慢慢傾入正在流出溶劑的柱子的頂部然后慢慢傾入正在流出溶劑的柱子的頂部. 同時(shí)要不斷輕同時(shí)要不斷輕輕地敲擊柱壁輕地敲擊柱壁, 促進(jìn)均勻沉降和混合促進(jìn)均勻沉降和混合, 避免空氣泡的形成避免空氣

26、泡的形成. 同時(shí)在所有物料沉降同時(shí)在所有物料沉降好之前要持續(xù)輕敲柱壁好之前要持續(xù)輕敲柱壁, 這樣可以使柱頂形成一個(gè)非常合格的水平面這樣可以使柱頂形成一個(gè)非常合格的水平面. 另外如果漿液有時(shí)因變得太厚而無法傾倒另外如果漿液有時(shí)因變得太厚而無法傾倒, 可將收集在燒杯中的溶劑重新加至可將收集在燒杯中的溶劑重新加至漿液內(nèi)漿液內(nèi). 然后將收集到的溶劑在柱內(nèi)反復(fù)循環(huán)幾次以保證沉降完全及柱子的緊然后將收集到的溶劑在柱內(nèi)反復(fù)循環(huán)幾次以保證沉降完全及柱子的緊實(shí)實(shí).CONFIDENTIALB 干法干法方法一方法一: 用溶劑將柱子充滿并讓它緩緩流出用溶劑將柱子充滿并讓它緩緩流出. 在按上述方法不停地輕敲柱子的在按上

27、述方法不停地輕敲柱子的同時(shí)同時(shí), 每次少量地把干的吸附劑加入柱中每次少量地把干的吸附劑加入柱中. 此法也可得到裝得很均勻的柱此法也可得到裝得很均勻的柱. 同上同上法一樣法一樣, 每次使用前應(yīng)將溶劑反復(fù)循環(huán)通過幾次每次使用前應(yīng)將溶劑反復(fù)循環(huán)通過幾次.方法二方法二: 先將干的吸附劑裝入柱中先將干的吸附劑裝入柱中, 硅膠面壓實(shí)頂部水平后將溶劑緩慢滲瀝穿硅膠面壓實(shí)頂部水平后將溶劑緩慢滲瀝穿過柱子過柱子, 直至柱子全被浸潤直至柱子全被浸潤. 但此法容易造成柱子不勻但此法容易造成柱子不勻, 空氣泡和縫隙空氣泡和縫隙, 尤其是尤其是使用在溶劑化過程中有高度放熱的溶劑時(shí)使用在溶劑化過程中有高度放熱的溶劑時(shí),

28、這些問題尤為突出這些問題尤為突出.CONFIDENTIALv 上樣上樣分為以下幾個(gè)步驟分為以下幾個(gè)步驟:將固體樣品溶于極少量適宜的極性溶劑中將固體樣品溶于極少量適宜的極性溶劑中, 溶劑的極性應(yīng)比樣品的極性小一溶劑的極性應(yīng)比樣品的極性小一些些, 否則樣品不易被吸附否則樣品不易被吸附. 溶劑對樣品的溶解度也不宜過大溶劑對樣品的溶解度也不宜過大. 通過排液通過排液, 使溶劑的水平面剛好低于吸附劑的頂部使溶劑的水平面剛好低于吸附劑的頂部.A. 將待分離的溶液用移液管將待分離的溶液用移液管(或長滴管或長滴管) 加入柱頂加入柱頂. 注意要接觸柱的內(nèi)壁慢慢注意要接觸柱的內(nèi)壁慢慢沿柱壁散布放樣使其慢慢下降沿柱

29、壁散布放樣使其慢慢下降. 從而使整個(gè)吸附劑表面都被其均勻地蓋住從而使整個(gè)吸附劑表面都被其均勻地蓋住. 同時(shí)要注意盡量使移液管貼近吸附劑表面同時(shí)要注意盡量使移液管貼近吸附劑表面.CONFIDENTIAL上樣上樣D 讓這一薄層液體進(jìn)入柱內(nèi)讓這一薄層液體進(jìn)入柱內(nèi), 直至柱頂表面恰好開始瀝干為止直至柱頂表面恰好開始瀝干為止.E: 小心用移液管加入一薄層層析分離溶劑小心用移液管加入一薄層層析分離溶劑, 小心不要攪動(dòng)表面小心不要攪動(dòng)表面, 讓這一薄層溶劑讓這一薄層溶劑排入柱中直至這段柱正好瀝干排入柱中直至這段柱正好瀝干, 目的是洗滌柱壁上附著的樣品目的是洗滌柱壁上附著的樣品. 如樣品有色如樣品有色, 則可

30、從新鮮溶劑層上有沒有這種樣品的顏色來判斷樣品有沒有被完全吸附則可從新鮮溶劑層上有沒有這種樣品的顏色來判斷樣品有沒有被完全吸附.F: 向柱頂加入石英砂并注入溶劑向柱頂加入石英砂并注入溶劑.CONFIDENTIAL上樣上樣* 在開始洗脫之前讓樣品在柱中停留一段短時(shí)間往往可以得到較好的分離在開始洗脫之前讓樣品在柱中停留一段短時(shí)間往往可以得到較好的分離, 這樣這樣做可以建立起一個(gè)真正的平衡做可以建立起一個(gè)真正的平衡. 然而然而, 必須指出必須指出, 在一個(gè)經(jīng)過長時(shí)期放置的柱中在一個(gè)經(jīng)過長時(shí)期放置的柱中, 吸附劑往往會(huì)變得緊密甚至溶脹吸附劑往往會(huì)變得緊密甚至溶脹, 而流速也可能變得令人討厭地慢而流速也可

31、能變得令人討厭地慢. 如果柱子如果柱子放置時(shí)間過長放置時(shí)間過長, 也會(huì)出現(xiàn)樣品擴(kuò)散而使譜帶變寬的問題也會(huì)出現(xiàn)樣品擴(kuò)散而使譜帶變寬的問題.CONFIDENTIALv 洗脫洗脫 洗脫溶劑的選擇是柱色譜分離的重要環(huán)節(jié)洗脫溶劑的選擇是柱色譜分離的重要環(huán)節(jié). 通常先用非極性溶劑洗脫出極性小通常先用非極性溶劑洗脫出極性小的部分的部分, 再慢慢加大極性進(jìn)行洗脫再慢慢加大極性進(jìn)行洗脫. 常用溶劑和混合溶劑的洗脫力按遞增次序排列如下常用溶劑和混合溶劑的洗脫力按遞增次序排列如下: 己烷和石油醚己烷和石油醚 環(huán)己烷環(huán)己烷 四氯化碳四氯化碳 三氯乙烯三氯乙烯 二硫化碳二硫化碳 甲苯甲苯 苯苯 二氯二氯甲烷甲烷-乙醚乙

32、醚(80:20) 二氯甲烷二氯甲烷-乙醚乙醚(60:40) 環(huán)己烷環(huán)己烷-乙酸乙酯乙酸乙酯(20:80) 乙醚乙醚 乙醚乙醚-甲醇甲醇(99:1) 乙酸乙酯乙酸乙酯 四氫呋喃四氫呋喃 丙酮丙酮 正丙醇正丙醇 乙醇乙醇 甲醇甲醇 水水 吡啶吡啶 乙酸乙酸 甲酸甲酸CONFIDENTIALv 柱的監(jiān)控柱的監(jiān)控一: 通過薄層層析板進(jìn)行監(jiān)控通過薄層層析板進(jìn)行監(jiān)控二二: 通過加入無機(jī)熒光體通過加入無機(jī)熒光體. 當(dāng)用紫外光照射時(shí)當(dāng)用紫外光照射時(shí), 經(jīng)過此處理的吸附劑會(huì)發(fā)熒光經(jīng)過此處理的吸附劑會(huì)發(fā)熒光. 但但也有一些溶質(zhì)有使這種熒光體指示劑的熒光淬滅的能力也有一些溶質(zhì)有使這種熒光體指示劑的熒光淬滅的能力,

33、因此在有這些溶質(zhì)存因此在有這些溶質(zhì)存在的區(qū)域在的區(qū)域, 吸附劑將不發(fā)熒光吸附劑將不發(fā)熒光, 從而可以看到一條暗譜帶從而可以看到一條暗譜帶.CONFIDENTIAL 拖尾會(huì)干擾第二個(gè)組份的分離拖尾會(huì)干擾第二個(gè)組份的分離, 避免的一個(gè)辦法是在洗脫時(shí)不斷地提高溶劑的避免的一個(gè)辦法是在洗脫時(shí)不斷地提高溶劑的極性極性. 用這種方法時(shí)用這種方法時(shí), 由於在峰的尾部處極性正在增大由於在峰的尾部處極性正在增大, 化合物就會(huì)比其前緣處化合物就會(huì)比其前緣處移動(dòng)得快移動(dòng)得快, 從而使尾部緊縮從而使尾部緊縮, 形成一個(gè)更近乎理想的譜帶形成一個(gè)更近乎理想的譜帶v 拖尾拖尾CONFIDENTIALv 幾點(diǎn)注意幾點(diǎn)注意1.

34、 1. 層析樣品的層析樣品的RF值（值（Retenition fraction）是指樣品中心區(qū)與流動(dòng)相前端距起是指樣品中心區(qū)與流動(dòng)相前端距起始點(diǎn)的距離的比值始點(diǎn)的距離的比值 CONFIDENTIAL幾點(diǎn)注意幾點(diǎn)注意 2. 任何化合物若以任何化合物若以TLC檢驗(yàn)其純度，其所顯示的檢驗(yàn)其純度，其所顯示的Rf值超過值超過0.7或低于或低于0.1時(shí)，時(shí)，均無法確認(rèn)其是否為單一點(diǎn)，因?yàn)樵诖朔N均無法確認(rèn)其是否為單一點(diǎn)，因?yàn)樵诖朔NRf值時(shí)，許多值時(shí)，許多Rf值較接近的點(diǎn)均有值較接近的點(diǎn)均有可能重合。所以我們選擇觀察物最適合的可能重合。所以我們選擇觀察物最適合的Rf值為值為0.30.5。 3. 過柱子時(shí)所選用

35、的溶劑系統(tǒng)應(yīng)配合選用硅膠的用量及樣品的量來選擇其極過柱子時(shí)所選用的溶劑系統(tǒng)應(yīng)配合選用硅膠的用量及樣品的量來選擇其極性組合，一般而言欲分離的主樣品性組合，一般而言欲分離的主樣品Rf值以值以0.150.25為宜。為宜。 CONFIDENTIAL幾點(diǎn)注意幾點(diǎn)注意 4. 一般最常用的溶劑系統(tǒng)依其極性大小依次為正己烷（或石油醚）一般最常用的溶劑系統(tǒng)依其極性大小依次為正己烷（或石油醚）乙酸乙乙酸乙酯酯甲醇的組合為最通用，其他如乙醚也常為中極性的溶劑，對含氯有機(jī)溶劑甲醇的組合為最通用，其他如乙醚也常為中極性的溶劑，對含氯有機(jī)溶劑如如DCM，CHCl3常有特殊的效果，而笨對含芳香性的化合物也會(huì)有出人意料常有特

36、殊的效果，而笨對含芳香性的化合物也會(huì)有出人意料的好效果。的好效果。 5. 5. 過柱子所用的溶劑在配好后，應(yīng)以過柱子所用的溶劑在配好后，應(yīng)以TLC再作檢查試一次，以確定是否為恰再作檢查試一次，以確定是否為恰當(dāng)?shù)娜軇w系。當(dāng)?shù)娜軇w系。 CONFIDENTIAL幾點(diǎn)注意幾點(diǎn)注意 6. 在填裝層析柱時(shí)若不慎有氣泡（如溶劑部分流干引起）可補(bǔ)滿溶劑后以木在填裝層析柱時(shí)若不慎有氣泡（如溶劑部分流干引起）可補(bǔ)滿溶劑后以木棒輕敲管壁，使氣泡浮出。因?yàn)闅馀葜袥]有填充物，分離物流經(jīng)此處時(shí)移動(dòng)棒輕敲管壁，使氣泡浮出。因?yàn)闅馀葜袥]有填充物，分離物流經(jīng)此處時(shí)移動(dòng)速度會(huì)較其他處為快，而造成此處分離物與其他無氣泡處的分離

37、無排列次序速度會(huì)較其他處為快，而造成此處分離物與其他無氣泡處的分離無排列次序混亂，影響分離效果?；靵y，影響分離效果。 7. 在過柱子時(shí)所收集的餾分體積通常為硅膠克數(shù)的在過柱子時(shí)所收集的餾分體積通常為硅膠克數(shù)的1/4以下。實(shí)際情況可引用以下。實(shí)際情況可引用下列公式求出粗略值，如欲分離成分下列公式求出粗略值，如欲分離成分A與與B，而而A的的Rf值為值為0.3，B的的Rf值為值為0.2，則最合適的分離體積為：則最合適的分離體積為： 設(shè)硅膠量為設(shè)硅膠量為50g V2 x W x (RfA-RfB)=2 x 50 x (0.3-0.2)=10 ml CONFIDENTIAL PTLCCONFIDENTI

38、AL 分離時(shí)間短，效率高分離時(shí)間短，效率高 操作簡便操作簡便 分離樣品少分離樣品少特點(diǎn)特點(diǎn)CONFIDENTIAL原理原理各組分對吸附劑吸附能力不同各組分對吸附劑吸附能力不同 吸附能力弱（即極性較弱的）隨流動(dòng)相移動(dòng)吸附能力弱（即極性較弱的）隨流動(dòng)相移動(dòng) 吸附能力強(qiáng)（即極性較強(qiáng)的）隨流動(dòng)相移動(dòng)慢吸附能力強(qiáng)（即極性較強(qiáng)的）隨流動(dòng)相移動(dòng)慢CONFIDENTIALPTLC 板板 吸附劑吸附劑 最常用的吸附劑是硅膠最常用的吸附劑是硅膠 硅膠是無定型多孔物質(zhì)，略具酸性硅膠是無定型多孔物質(zhì)，略具酸性 適用于中性或酸性物質(zhì)的分離。適用于中性或酸性物質(zhì)的分離。 制備和活化制備和活化 負(fù)載量負(fù)載量 1.0mm，

39、5mg/cm2 e.g. 20 20cm, 10100mg CONFIDENTIAL 確定展開劑確定展開劑 上板上板 展板展板 顯色顯色 刮板與洗脫刮板與洗脫P(yáng)TLC過程過程CONFIDENTIAL確定展開劑確定展開劑u 溶解樣品時(shí)應(yīng)選用溶解度大，沸點(diǎn)低、易揮發(fā)的溶解樣品時(shí)應(yīng)選用溶解度大，沸點(diǎn)低、易揮發(fā)的溶劑溶劑u 溶劑量控制在溶劑量控制在1.52ml/塊板塊板 u 產(chǎn)物的產(chǎn)物的Rf值調(diào)至值調(diào)至0.40.6 u P-TLC可直接用可直接用TLC條件條件CONFIDENTIAL上板上板 準(zhǔn)備硅膠板準(zhǔn)備硅膠板 自制的一次性滴管自制的一次性滴管 上板次數(shù)上板次數(shù)4次次 左右約左右約1cm處不上樣處不上樣 寫上化合物編號(hào)寫上化合物編號(hào) CONFIDENTIALCONFIDENTIAL 用滴管吸取樣品溶劑，緩慢并且勻速地在板上劃一條直線用滴管吸取樣品溶劑，緩慢并且勻速地在板上劃一條直線 如果點(diǎn)樣太寬，可用大極性溶劑將其展開至如果點(diǎn)樣太寬，可用大極性溶劑將其展開至24cm，再吹干再吹干不要污染板不要污染板線條盡可能細(xì)線條盡可能細(xì)如果可能，點(diǎn)樣后先在如果可能，點(diǎn)樣后先在 UV下檢查下檢查 小心小心: