核酸外切酶、內(nèi)切酶、聚合酶、連接酶

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上核酸外切酶（exonuclease） 外切酶是一類能從多核苷酸鏈的一端開始按序催化3、5-，降解的酶。其水解的最終產(chǎn)物是單個的核苷酸（為dNTP，為NTP）。按作用的特性差異可以將其分為單鏈的核酸外切酶和雙鏈的核酸外切酶。 單鏈的核酸外切酶包括大腸桿菌核酸外切酶（exo）和核酸外切酶（exo）。核酸外切酶（exo）能夠從5-末端或3-末端呈單鏈狀態(tài)的DNA分子上降解DNA，產(chǎn)生出短片段，而且是唯一不需要Mg2+離子的活性，是一種耐受性很強的。核酸外切酶（exo）可以用來測定基因組DNA中一些特殊的間隔序列和編碼序列的位置。它只切割末端有單鏈突出的DNA分子。 雙鏈的核

2、酸外切酶包括核酸外切酶（exo）、核酸外切酶（exo）以及T7基因6核酸外切酶等。大腸桿菌核酸外切酶（exo ）具有多種功能，可以降解雙鏈DNA分子中的許多類型的磷酸二酯鍵。其中主要的催化活性是催化雙鏈DNA按35的方向從3-OH末端釋放5-單核苷酸。大腸桿菌核酸外切酶（exo）通過其35外切酶活性使雙鏈DNA分子產(chǎn)生出單鏈區(qū)，經(jīng)過這種修飾的DNA再配合使用Klenow酶，同時加進帶的核苷酸，便可以制備特異性的放射性探針。 噬菌體核酸外切酶（exo）最初是從感染了噬菌體的大腸桿菌細胞中純化出來的。這種酶催化雙鏈DNA分子從5-P末端進行逐步的水解釋放出5-單核苷酸。但不能降解5-OH末端。內(nèi)切

3、酶（incision enzyme） 這是一類能從中間水解,從而切斷雙鏈DNA的核酸水解酶。它們不同于一般的脫氧核糖核酸酶（DNase）,它們的切點大多很嚴格，要求專一的核苷酸順序識別順序內(nèi)切酶主要分成三大類。 第一類內(nèi)切酶能識別專一的核苷酸順序，并在識別點附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的雙鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機的。這類限制性內(nèi)切酶在或基因工程中沒有多大用處，無法用于分析DNA結(jié)構(gòu)或克隆基因。這類酶如EcoB、EcoK等。 第二類內(nèi)切酶能識別專一的核苷酸順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上切割雙鏈。由于這類限制性內(nèi)切酶的識別和切割的核苷酸都是專一的。所以總能得到同樣核苷酸順序

4、的DNA片段，并能構(gòu)建來自不同基因組的DNA片段，形成雜合DNA分子。因此，這種限制性內(nèi)切酶是DNA重組技術(shù)中最常用的之一。這種酶識別的專一核苷酸順序最常見的是4個或6個核苷酸，少數(shù)也有識別5個核苷酸以及7個、9個、10個和11個核苷酸的。如果識別位置在DNA分子中分布是隨機的，則識別4個核苷酸的限制性內(nèi)切酶每隔46（4096）個核苷酸就有一個切點。人的單倍體基因組據(jù)估計為3×199核苷酸，識別4個核苷酸的限制性內(nèi)切酶的切點將有（3×109/2.5×102）約107個切點，也就是可被這種酶切成107片段，識別6個核苷酸的限制性內(nèi)切酶也將有（3×109/4

5、×103）約106個切點。第三類內(nèi)切酶的識別順序是一個回文對稱順序，即有一個中心對稱軸，從這個軸朝二個方向“讀”都完全相同。這種酶的切割可以有兩種方式。一是交錯切割，結(jié)果形成兩條單鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補的，可形成氫鍵，所以稱為粘性末端。粘性末端的意義：（1） 連接便利： 不同的DNA雙鏈，只要粘性末端堿基互補就可以連接，這比連接兩個平齊末端容易的多；同一個DNA分子內(nèi)連接，通過兩個相同的粘性末端可以連接成環(huán)狀分子。 （2）5末端標記： 凸出的5末端可以用DNA多核苷酸激酶進行32P標記。凸出的3端可以通過末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個多聚核苷酸的尾巴(如AAA或TTT等）造成人工粘性

6、末端（3）補平成平齊末端 粘性末端可以用DNA聚合酶補平成平齊末端如EcoRI的識別順序為： | 5GAA | TTC3 3CTT | AAG5 | 垂直虛線表示中心對稱軸，從兩側(cè)“讀”核苷酸順序都是GAATTC或CTTAAG，這就是回文順序（palindrome）。實線剪頭表示在雙鏈上交錯切割的位置，切割后生成5G和AATTC3、3CTTAA和G5二個DNA片段，各有一個單鏈末端，二條單鏈是互補的，可通過形成而“粘合”。另一種是在同一位置上切割雙鏈，產(chǎn)生平頭末端。例如Hae的識別位置是： 5GGCC3 3CCGG 在箭頭所指處切割，產(chǎn)生的兩個DNA片段是： 5GG CC3 和 3CC GG5

7、 有時候兩種限制性內(nèi)切酶的識別核苷酸順序和切割位置都相同，差別只在于當識別順序中有的核苷酸時，一種限制性內(nèi)切酶可以切割，另一種則不能。例如Hpa和Msp的識別順序都是5GCGG3，如果其中有5-甲基胞嘧啶，則只有Hpa能夠切割。這些有相同切點的酶稱為同切酶或異源同工酶（isoschizomer）。 第三類內(nèi)切酶也有專一的識別順序，但不是對稱的回文順序。它在識別順序旁邊幾個核苷酸對的固定位置上切割雙鏈。但這幾個核苷酸對則是任意的。因此，這種限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一定長度DNA片段，具有各種單鏈末端。這對于克隆基因或克隆DNA片段沒有多大用處。DNA聚合酶（DNA polymerase） DNA

8、聚合酶（DNA polymerase）是胞復制的重要作用酶。DNA聚合酶 , 以DNA為復制模板，從將DNA由5'端點開始復制到3'端的酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具備模板、引物、dNTP等的情況下）及其相輔的活性。DNA聚合酶的共同特點是：（1）需要提供合成模板；（2）不能起始新的DNA鏈，必須要有引物提供3'OH；（3）合成的方向都是5'3'（4）除聚合DNA外還有其它功能。 功能1聚合作用:在引物RNA'-OH末端，以dNTP為底物，按模板DNA上的指令由DNApol逐個將核苷酸加上去，就是DNApol的聚合作用。酶的專

9、一性主要表現(xiàn)為新進入的脫氧核苷酸必須與模板DNA配對時才有催化作用。dNTP進入結(jié)合位點后，可能使酶的構(gòu)象發(fā)生變化，促進3'-OH與5'-PO4結(jié)合生成磷酸二酯鍵。若是錯誤的核苷酸進入結(jié)合位點，則不能與模板配對，無法改變酶的構(gòu)象而被3'-5'外切酶活性位點所識別并切除之。 23'5'外切酶活性校對作用:這種酶活性的主要功能是從3'5'方向識別和切除不配對的DNA生長鏈末端的核苷酸。當反應體系中沒有反應底物dNTP時，由于沒有聚合作用而出現(xiàn)暫時的游離現(xiàn)象，從而被3'5'外切酶活性所降解。如果提高反應體系的溫度可以促進

10、這種作用，這表明溫度升高使DNA生長鏈3'末端與模板發(fā)生分離的機會更多，因而降解作用加強。當向反應體系加入dNTP，而且只加放與模板互補的上述核苷酸才會使這種外切酶活性受到抑制，并繼續(xù)進行DNA的合成。由此推論，3'5'外切酶活性的主要功能是校對作用，當加入的核苷酸與模板不互補而游離時則被3'5'外切酶切除，以便重新在這個位置上聚合對應的核苷酸。在某些T4噬菌體突變株中DNA復制的真實性降低，而易發(fā)生突變，從此突變株分離得到的T4DNA聚合酶的3'5'外切酶活性很低。相反，另外一些具有抗突變能力的T4突變株中的T4DNA聚合酶的3'

11、;5'外切酶活性比野生型高得多，因此，其DNA復制真實性好，變異率低。可見，3'5'外切酶活性對DNA復制真實性的維持是十分重要的。 35'3'外切酶活性切除修復作用:5'3'外切酶活性就是從5'3'方向水解DNA生長鏈前方的DNA鏈，主要產(chǎn)生5'-脫氧核苷酸。這種酶活性只對DNA上配對部分(雙鏈)磷酸二酯鍵有切割活力作用，方向是5'3'。每次能切除10個核苷酸，而且DNA的聚合作用能刺激5'3'外切酶活力達10倍以上。因此，這種酶活性在DNA損傷的修復中可能起著重要作用。對岡崎片段

12、5'末端的去除依賴此種外切酶活性。 4焦磷酸解作用:DNApol的這種活性可以催化3'末端焦磷酸解DNA分子。這種作用就是無機焦磷酸分解DNA生長鏈，可以認為是DNA聚合作用的逆反應，而且這種水解DNA鏈作用需要有模板DNA的存在。(dNMP)n+XPPi(dNMP)n-x+X(dNPPP)DNA 5焦磷酸交換作用:催化dNTP末端的PPi同無機焦磷酸的交換反應。反應式為32P32Pi+dNPPPdNP32P32P+PPiDNA 最后兩種作用，都要求有較高濃度的PPi，因此，在體內(nèi)由于沒有足夠高的PPi而無重要意義。 DNApol的DNA聚合酶活性和5'3'外切

13、酶活性協(xié)同作用，可以使DNA鏈上的切口向前推進，即沒有新的DNA合成，只有核苷酸的交換。這種反應叫缺口平移(Nick translation)。當雙鏈DNA上某個磷酸二酯鍵斷裂產(chǎn)生切口時，DNApoI能從切口開始合成新的NDA鏈，同時切除原來的舊鏈。這樣，從切口開始合成了一條與被取代的舊鏈完全相同的新鏈。如果新?lián)饺氲拿撗鹾塑账崛姿釣?32P-dNTP，則重新合成的新鏈即為帶有同位素標記的DNA分子，可以用作探針進行實驗。 大腸桿菌DNA聚合酶1、大腸桿菌DNA聚合酶(DNApolymerase，DNApol)這是1956年由ArthurKornberg首先發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶，又稱Kornbe

14、r酶。此酶研究得清楚而且代表了其他DNA聚合酶的基本特點。 (1) 理化性質(zhì)：純化的DNApol由一條多肽鏈組成，約含1000個氨基酸殘基，MW為109KD。分子含有一個二硫鍵和一個-SH基。通過二個酶分子上的-SH基與Hg2+結(jié)合產(chǎn)生二聚體，仍有活性。每個酶分子中含有一個Zn2+，在DNA聚合反應起著很重要的作用。每個大腸桿菌細胞中含有約400個分子，每個分子每分鐘在37下能催化667個核苷酸摻入正在生長的DNA鏈。經(jīng)過枯草桿菌蛋白酶處理后，酶分子分裂成兩個片段，大片段分子量為76KD，通常稱為，小片段的分子量為34KD。此酶的模板專一性和底物專一性均較差，它可以用人工合成的RNA作為模板，

15、也可以用核苷酸為底物。在無模板和引物時還可以從頭合成同聚物或異聚物。 DNAPol在空間結(jié)構(gòu)上近似球體，直徑約65A。在酶的縱軸上有一個約20A的深溝(cleft)，帶有正電荷，這是該酶的活性中心位置，在此位置上至少有6個結(jié)合位點:1模板DNA結(jié)合位點;2DNA生長鏈或引物結(jié)合位點;3引物末端結(jié)合位點，用以專一引物或DNA生長鏈的3'-OH;4脫氧核苷三磷酸結(jié)合位點;55'3'外切酶活性位點，用以結(jié)合生長鏈前方的5'-端脫氧核苷酸并切除之;63'5'外切酶活性位點，用以結(jié)合和切除生長鏈上未配對的3'-端核苷酸。 大腸桿菌DNA聚合酶I 大

16、片段(Klenow)Klenow酶的基本用途：（1）補平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5粘性末端（2）DNA片段的同位素末端標記（3）cDNA第二鏈的合成（4）雙脫氧末端終止法測定DNA序列2、大腸桿菌DNA聚合酶(DNApol)：DNA聚合酶缺陷的突變株仍能生存，這表明DNApol不是DNA復制的主要聚合酶。人們開始尋找另外的DNA聚合酶，并于1970年發(fā)現(xiàn)了DNApol。此酶MW為120KD，每個細胞內(nèi)約有100個酶分子，但活性只有DNApol的5%。該酶的催化特性如下： (1)聚合作用:該酶催化DNA的聚合，但是對模板有特殊的要求。該酶的最適模板是雙鏈DNA而中間有空隙(gap)的單鏈DNA部分，而

17、且該單鏈空隙部分不長于100個核苷酸。對于較長的單鏈DNA模板區(qū)該酶的聚合活性很低。但是用單鏈結(jié)合蛋白(SSBP)可以提高其聚合速率，可達原來的50-100倍。 (2)該酶也具有3'5'外切酶活性，但無5'3'外切酶活性。 (3)該酶對作用底物的選擇性較強，一般只能將2-脫氧核苷酸摻入到DNA鏈中。 (4)該酶不是復制的主要聚合酶，因為此酶缺陷的大腸桿菌突變株的DNA復制都正常?？赡茉贒NA的損傷修復中該酶起到一定的作用。 3、 大腸桿菌DNA聚合酶(DNApol)：DNA pol 全酶由多種亞基組成(見下表)，而且容易分解。大腸桿菌每個細胞中只有10-20個酶

18、分子，因此不易獲得純品，為研究該酶的各種性質(zhì)和功能帶來了許多困難。直到不久前，才對其性質(zhì)和功能有所了解，但每個亞基的具體作用扔不十分清楚。盡管該酶在細胞內(nèi)存在的數(shù)量較少，但催化脫氧核苷酸摻入DNA鏈的速率分別是DNA聚合酶的15倍和30倍。該酶對模板的要求與DNA聚合酶相同，最適模板也是鏈DNA中間有空隙的單鏈DNA，單鏈結(jié)合蛋白可以提高該酶催化單鏈DNA模板的DNA聚合作用。DNApol也有3'5'和5'3'外切酶活性，但是3'5'外切酶活性的最適底物是單鏈是DNA，只產(chǎn)生5'-單核苷酸，不會產(chǎn)生二核苷酸，即每次只能從3'端開始

19、切除一個核苷酸。5'3'外切酶活性也要求有單鏈DNA為起始作用底物，但一旦開始后，便可作用于雙鏈區(qū)。DNA聚合酶是細胞內(nèi)DNA復制所必需的酶，缺乏該酶的溫度突變株在限制溫度(non permissive temperature)內(nèi)是不能生長的，此種突變株的裂解液也不能合DNA，但加入DNA聚合酶則可以恢復其合成DNA的能力。 大腸桿菌三種DNA聚合酶的特性 功能 pol pol pol 聚合作用5'3' + + + 外切酶活性3'5' + + + 外切酶活性5'3' + - + 焦磷酸解和焦磷酸交換作用 + - + 模板及引物的選

20、擇 完整的DNA雙鏈 - - - 帶引物的長單鏈DNA + - - 帶缺口的雙鏈DNA + - - 雙鏈而有間障的DNA + + + 一般性質(zhì) 分子量 1 09KD 120KD 140KD 每細胞中的分子量 400 17-100 10-20 結(jié)構(gòu)基因 polA polB polCT4-DNA聚合酶T4-DNA聚合酶(T4-DNApol)：近年來在枯草桿菌，鼠傷寒沙門氏桿菌等細胞及噬菌體T4、T5、T7中分離到NDA聚合酶，這里只介紹T4DNA聚合酶。T4DNA聚合酶與大腸桿菌DNA聚合酶相似，也是一條多肽鏈，分子量亦相近，但氨基酸組成不同，它至少含有15個半胱氨酸殘基。但是，它在作用上與大腸桿

21、菌DNApol不同;1它無5'3'外切酶活性;2它需要一條有引物的單鏈DNA作模板。在有缺口的雙鏈DNA作模板時，需要有基因32蛋白的輔助(基因32蛋白在T4DNA復制中的作用和大腸桿菌單鏈結(jié)合蛋白的作用相似，基因32蛋白在復制叉處和單鏈DNA結(jié)合后可以促進雙鏈的進一步打開，并保持其單鏈狀態(tài)有利于新生鏈的合成);它利用單鏈DNA為模板進，可同時利用它作為引物，即此單鏈DNA的3'端能環(huán)繞其本身的某一順序形成氫鍵配對，3'端的未雜交部分即被T4DNA聚合酶的3'5'外切酶活性切去，然后在其作用下從3'-OH端開始聚合，合成該模板DNA的互補

22、鏈，再以互補鏈為模板合成原來的單鏈DNA實驗室常用的耐熱DNA聚合酶耐熱DNA聚合酶多應用在PCR技術(shù)中。各種耐熱DNA聚合酶均具有5'-3'聚合酶活性，但不一定具有3'-5'和5'-3'的外切酶活性。3'-5'外切酶活性可以消除錯配，切平末端；5'-3'外切酶活性可以消除合成障礙。由于上述這些不同，可以將耐熱DNA聚合酶分為三類： 一、普通耐熱DNA聚合酶 Taq DNA 聚合酶 由一種水生棲熱菌yT1株分離提取出，是發(fā)現(xiàn)的耐熱DNA聚合酶中活性最高的一種，達200,000單位/mg。具有5'-3'

23、;外切酶活性，但不具有3'-5'外切酶活性，因而在合成中對某些單核苷酸錯配沒有校正功能。 還要具有非模板依賴性活性，可將PCR雙鏈產(chǎn)物的每一條鏈3'加入單核苷酸尾，故可使PCR產(chǎn)物具有3'突出的單A核苷酸尾；另一方面，在僅有dTTP存在時，它可將平端的質(zhì)粒的3'端加入單T核苷酸尾，產(chǎn)生3'端突出的單T核苷酸尾。應用這一特性，可實現(xiàn)PCR產(chǎn)物的T-A克隆法。 Tth DNA 聚合酶 從Thermus thermophilus HB8中提取而得，改酶在高溫和MnCl2條件下，能有效地逆轉(zhuǎn)錄RNA；當加入Mg2+后，該酶的聚合活性大大增加，從而使cDN

24、A合成與擴增可用一種酶催化。 2、 高保真DNA聚合酶 pfu DNA 聚合酶 是從Pyrococcus furiosis中精制而成的高保真耐高溫DNA聚合酶，它不具有5'-3'外切酶活性，但具有3'-5'外切酶活性，可校正過程中產(chǎn)生的錯誤，使產(chǎn)物的堿基錯配率極低。PCR產(chǎn)物為平端，無3'端突出的單A核苷酸。 Vent DNA 聚合酶 改酶是從Litoralis棲熱球菌中分離出的，不具有5'-3'外切酶活性，但具有3'-5'外切酶活性，可以去除錯配的堿基，具有校對功能。 3、 DNA序列測定中應用的耐熱DNA聚合酶 Pro

25、mega公司測序級TaqDNA聚合酶 是在TaqDNA聚合酶的基礎上對它進行修飾，去除5'-3'外切酶活性，保證測序記過的高度準確性，可產(chǎn)生強度均一的測序條帶，背景清晰。 Bca Best DNA 聚合酶 從Bacillus Caldotenax YT-G菌株中提純，并使其5'-3'外切酶活性缺失的DNA聚合酶。它的伸長性能優(yōu)越；可抑制DNA二級結(jié)構(gòu)形成，可以得到均一的DNA測序帶。 Sac DNA 聚合酶 從酸熱浴流化裂片菌中分離，無3'-5'外切酶活性，可用于DNA測序，但測序反應中ddNTP/dNTP的比率要高。DNA連接酶（DNA lig

26、ase） DNA連接酶是1967年在三個實驗室同時發(fā)現(xiàn)的，最初是在大腸桿菌細胞中發(fā)現(xiàn)的。它是一種封閉DNA 鏈上缺口酶，借助或水解提供的能量催化DNA鏈的5'-PO4與另一DNA鏈的3'-OH生成磷酸二酯鍵。但這兩條鏈必須是與同一條互補鏈配對結(jié)合的(除外)，而且必須是兩條緊鄰DNA鏈才能被DNA連接酶催化成磷酸二酯鍵。DNA連接酶主要用于，將由限制性核酸內(nèi)切酶“剪”出的粘性末端重新組合，故也稱“基因針線”。 在大腸桿菌及其他細菌中，DNA連接酶催化的連接反應是利用NAD+做能源的；而在動物細胞及噬菌體中，是利用ATP作能源。DNA連接酶并不能連接兩條單鏈的DNA分子或環(huán)化的單鏈

27、DNA分子，被連接的DNA鏈必須是雙螺旋的一部分。實際上，DNA連接酶是封閉雙螺旋DNA骨架上的切口（nick)，即在雙鏈DNA的某一條鏈上的兩個相鄰核苷酸之間失去一個磷酸二酯鍵所出現(xiàn)的單鏈斷裂 大腸桿菌DNA連接酶：只能催化雙鏈DNA的互補粘性末端，以NAD為能量；T4噬菌體連接酶：粘性、平末端均可連接，以ATP為能量。從分子動力學的角度講，由限制性核酸內(nèi)切酶創(chuàng)造的粘性末端的連接屬于分子內(nèi)部的連接，而平頭末端的連接則屬于分子間的連接，因此后者反應速度要慢得多T4DNA連接酶T4DNA連接酶是ATP依賴的DNA連接酶，催化兩條DNA雙鏈上相鄰的5磷酸基和3羥基之間形成磷酸二酯鍵?？山与p鏈DNA

28、的平末端、相容粘末端及其中的單鏈切口，在中有廣泛的應用。T4DNA連接酶是經(jīng)原核表達，純化獲得的高純T4DNA接酶，顯示為一條62kD的蛋白條帶。本品附帶10xLigationBuffer含有ATP。適用于DNA片斷接、克隆等各種反應。 內(nèi)容與儲存方法名稱:T4DNALigase :20ml 保存條件:-20 名稱:10xLigationBuffer 數(shù)量:100ml 保存:-20 T4DNA接酶活性為3u/ml，單位定為Weiss（0.01Weiss單位活性的T4DNA接酶在16時20ml體系反應20分鐘，可以連接95%的1gDNA-HindIII的酶切物）。無DNA外切酶或內(nèi)切酶活性?？蛇M行50次以上常規(guī)DNA接反應。低溫運輸，-20保存。有效期6個月。 10×LigationBuffer： Tris-HClpH7.8600mM MgCl215mM DTT100mM ATP10mM 連接條件推薦在1020ml反應體系中進行接反應，反應中DNA最大可達1mM（1kbDNA約1mg/ml