沙門(mén)菌檢查法

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上沙門(mén)菌檢查法1 簡(jiǎn)述沙門(mén)菌屬是腸桿菌科的重要致病菌，按Bergey系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)第一卷（1984），沙門(mén)菌分5個(gè)亞屬。2003年出版的第八版的臨床微生物手冊(cè)將沙門(mén)菌屬分成兩個(gè)菌種即腸炎沙門(mén)菌和乍得沙門(mén)菌，其中腸炎沙門(mén)菌分6個(gè)亞種，包括常見(jiàn)的傷寒、甲型副傷寒、乙型副傷寒、丙型副傷寒、，鼠傷寒，豬霍亂等沙門(mén)菌雜內(nèi)，迄今已發(fā)現(xiàn)2501個(gè)血清型。O抗原抗血清A-E群包含了沙門(mén)菌分離株的95%，所以常用沙門(mén)菌A-F O多價(jià)血清進(jìn)行沙門(mén)菌初篩試驗(yàn)。藥品中的沙門(mén)菌，是以鑒定沙門(mén)菌屬為準(zhǔn)，即對(duì)沒(méi)10g（或10ml）藥品中是否檢出沙門(mén)菌作出檢驗(yàn)報(bào)告。由于沙門(mén)菌血清型繁多，各血清型的生化

2、及血清學(xué)特性雖密切相關(guān)，卻不盡相同，采用一種增菌培養(yǎng)基和兩種分離培養(yǎng)基，不可能涵蓋所有沙門(mén)菌的最適增菌及分離條件。此外，由于藥品在生產(chǎn)過(guò)程中，常受到加熱、干燥等加工步驟的影響，藥品中污染的沙門(mén)菌可受到損傷或呈休眠狀態(tài)，故須在增菌培養(yǎng)前先進(jìn)行預(yù)增菌。然后再進(jìn)行增菌及分離、三糖鐵瓊脂初步鑒別、生化試驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)等步驟。2 儀器、設(shè)備及用具（見(jiàn)大腸埃希菌2）。3 試液指示液（參見(jiàn)大腸埃希菌3）3.1 無(wú)菌脲試液附錄2.5。3.2 酚磺酞指示液附錄4.4。 3.3 亮綠試液附錄2.9。3.4 氰化鉀試液附錄2.14。3.5溴甲酚紫指示液附錄4.5。3.6 革蘭染色液附錄2.4，2.10，2.16。3

3、.7 沙門(mén)菌屬A-F“O”多價(jià)血清（即O多價(jià)1）生物制品研究所供應(yīng)。4 培養(yǎng)基4.1 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基附錄5.2。4.2 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基附錄5.1。4.3 半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基附錄5.3。4.4 曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（EMB）附錄5.8。4.5 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MacC）附錄5.9。4.6 四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基（TTB）附錄5.11。4.7 三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基（TSI）附錄5.10。4.8 膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基（DHL）附錄5.13。4.9 沙門(mén)菌屬志賀菌屬瓊脂培養(yǎng)基（SS）附錄5.12。4.10 蛋白胨水培養(yǎng)基附錄5.18。4.11 脲（尿素）瓊脂培養(yǎng)基附錄5.23。4.12 氰化鉀培養(yǎng)基附錄5

4、.24。4.13 賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基附錄5.25。5 對(duì)照用菌液取乙型副傷寒沙門(mén)菌CMCC（B）50094是營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許，接種至5ml營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，36±1培養(yǎng)1824h后，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋至1:106（濃度相當(dāng)于50100cfu/0.1ml），作陽(yáng)性對(duì)照用菌液。其菌液濃度可用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)得。即取0.1ml加入平皿內(nèi)，傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂，混勻，或以0.1ml均勻涂布于事先準(zhǔn)備好的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，經(jīng)培養(yǎng)后點(diǎn)計(jì)求得。6 操作方法6.1 準(zhǔn)備工作：（見(jiàn)細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)6）。6.2 供試液的制備：（見(jiàn)細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)7）。含抑菌成分供試品供試液的制備：（見(jiàn)

5、大腸埃希菌6.2）。6.3 陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)、陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)（見(jiàn)大腸埃希菌7.1）。6.4 增菌培養(yǎng)6.4.1 預(yù)增菌 取營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基2份，每份200ml，1份加入10g或者10ml供試品使勻，另1份加入稀釋劑10ml作陰性對(duì)照，36±1培養(yǎng)1824h，觀察。搖動(dòng)陰性對(duì)照瓶后應(yīng)清亮透明，無(wú)菌生長(zhǎng)。6.4.2 增菌培養(yǎng) 輕微搖動(dòng)供試品增菌培養(yǎng)瓶，吸取1ml接種于1管含10ml四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基的試管中，培養(yǎng)1824h。6.5 分離培養(yǎng) 輕微搖動(dòng)供試品增菌培養(yǎng)，以接種環(huán)沾取12環(huán)培養(yǎng)液劃線于膽鹽硫乳瓊脂（DHL）或沙門(mén)菌志賀菌瓊脂（SS）平板及曙紅亞甲藍(lán)（EMB）瓊脂或麥康凱瓊脂平板各1個(gè)

6、，倒置培養(yǎng)2448h。檢查平板上有無(wú)疑似沙門(mén)菌菌落。沙門(mén)菌在上述平板上的菌落形態(tài)特征見(jiàn)表1。表1 沙門(mén)菌的菌落特征平板 菌落形態(tài)膽鹽硫乳瓊脂（DHL） 無(wú)色至淺橙色，半透明，菌落中心帶黑色或全部黑色或無(wú)黑色沙門(mén)菌屬志賀菌屬瓊脂（SS） 無(wú)色至淡紅色，半透明或不透明，菌落中心有時(shí)帶黑褐色曙紅亞甲藍(lán)瓊脂（EMB） 無(wú)色至淺橙色，透明或半透明，光滑濕潤(rùn)的圓形菌落麥康凱瓊脂（MacC） 無(wú)色至淺橙色，透明或半透明，菌落中心有時(shí)為暗色由于沙門(mén)菌不發(fā)酵乳糖和蔗糖，不產(chǎn)酸，菌落不著色，一般為無(wú)色半透明，多數(shù)沙門(mén)菌因產(chǎn)生H2S，菌落中心呈現(xiàn)黑色甚至全黑色，在DHL瓊脂平板上較為明顯。在SS瓊脂平板上，H2S特

7、征有時(shí)不明顯，沙門(mén)菌屬亞屬因多數(shù)菌株發(fā)酵乳糖，故在上述平板上的乳糖發(fā)酵菌落呈現(xiàn)粉紅或紫色，但由于產(chǎn)生H2S，在有H2S指示系統(tǒng)的平板上仍出現(xiàn)黑色中心。在上述培養(yǎng)基上，有些非沙門(mén)菌屬細(xì)菌，也可呈現(xiàn)類似沙門(mén)菌菌落形態(tài)，須進(jìn)一步鑒別。由于藥物的影響或非典型菌株的存在，沙門(mén)菌菌落可呈現(xiàn)非典型形態(tài)，如色澤變深，菌落粗糙等，應(yīng)注意辨別。6.6 初步鑒別試驗(yàn)從每個(gè)供試品的分離平板上挑取23個(gè)疑似菌落（菌落形態(tài)特征與表1所列的形態(tài)特征相符或疑似）分別接種于三糖鐵瓊脂斜面，接種時(shí)應(yīng)以接種針輕輕接觸單個(gè)菌落中心部位，沾取培養(yǎng)物劃線于三糖鐵瓊脂斜面并穿刺到底層或先穿刺底層再劃線斜面，培養(yǎng)1824h，觀察結(jié)果。疑似沙

8、門(mén)菌在三糖鐵瓊脂斜面上的反應(yīng)為：斜面紅色（產(chǎn)堿），底層黑色（產(chǎn)H2S）并顯示黃色（產(chǎn)酸）；斜面紅色，底層黃色；斜面黃色，底層黑色，并顯示黃色。多數(shù)沙門(mén)菌在三糖鐵瓊脂上產(chǎn)生氣體，使底層瓊脂出現(xiàn)氣泡或使瓊脂斷裂，但也有不產(chǎn)生氣體的菌種。對(duì)在三糖鐵瓊脂斜面黃色并同時(shí)底層無(wú)黑色，或斜面及底層均為紅色者可以排除沙門(mén)菌。將疑似沙門(mén)菌的三糖鐵瓊脂或營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物作生化試驗(yàn)，血清凝集試驗(yàn)及革蘭染色，鏡檢。沙門(mén)菌應(yīng)為革蘭性桿菌。6.7 生化試驗(yàn)6.7.1 靛基質(zhì)試驗(yàn) 用接種環(huán)沾取少許培養(yǎng)物，接種到蛋白胨水培養(yǎng)基中，照大腸埃希菌靛基質(zhì)試驗(yàn)項(xiàng)下操作、判斷結(jié)果。沙門(mén)菌應(yīng)為陰性反應(yīng)。6.7.2 脲酶試驗(yàn) 用接種環(huán)沾

9、取少許培養(yǎng)物，劃線接種于脲瓊脂斜面，培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。斜面變?yōu)榧t色為陽(yáng)性反應(yīng)，沙門(mén)菌屬為陰性反應(yīng)。6.7.3 氰化鉀試驗(yàn) 竟培養(yǎng)物先接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)2024h，用接種環(huán)沾取培養(yǎng)液1環(huán)，接種至氰化鉀培養(yǎng)基內(nèi)，另取一環(huán)培養(yǎng)液接種于不含氰化鉀的同樣培養(yǎng)基內(nèi)作對(duì)照管，接種后即以橡膠塞塞緊，培養(yǎng)2448h，觀察結(jié)果。對(duì)照管內(nèi)有菌生長(zhǎng)（渾濁），而試驗(yàn)管也有菌生長(zhǎng)為陽(yáng)性反應(yīng)；對(duì)照管有菌生長(zhǎng)（渾濁）而試驗(yàn)管無(wú)菌生長(zhǎng)（清亮）為陰性反應(yīng)。沙門(mén)菌應(yīng)為陰性反應(yīng)。本試驗(yàn)應(yīng)十分注意密封管口，夏天分裝培養(yǎng)基宜在冰浴中進(jìn)行，防止氯化鉀分解，產(chǎn)生氫氰酸逸出，致使培養(yǎng)基內(nèi)氰化鉀濃度降低，不能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，造成假陽(yáng)性

10、。氰化鉀為劇毒品、操作時(shí)須謹(jǐn)慎，切勿用口吸液。用后的培養(yǎng)基，每管加數(shù)粒硫酸亞鐵和20%氫氧化鉀0.5ml，去毒，然后再滅菌，洗滌。6.7.4 賴氨酸脫羧酶試驗(yàn) 用接種環(huán)沾取少許培養(yǎng)物，接種在賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基中，同時(shí)接種一支不含賴氨酸的同樣培養(yǎng)基作為對(duì)照管，培養(yǎng)2448h觀察結(jié)果。對(duì)照管黃色（產(chǎn)酸），試驗(yàn)管呈紫色為陽(yáng)性反應(yīng)（賴氨酸脫羧酶產(chǎn)堿）；試驗(yàn)管黃色為陰性反應(yīng)。沙門(mén)菌應(yīng)為陽(yáng)性反應(yīng)。6.7.5 動(dòng)力試驗(yàn) 用接種針沾取培養(yǎng)物，穿刺接種于半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂管中，培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。有動(dòng)力的細(xì)菌能在穿刺線以外的培養(yǎng)基內(nèi)擴(kuò)散生長(zhǎng)使培養(yǎng)基呈渾濁現(xiàn)象；無(wú)動(dòng)力的細(xì)菌僅能沿穿刺線生長(zhǎng)，不向外擴(kuò)散，培養(yǎng)基仍呈清

11、晰透明狀；無(wú)動(dòng)力表現(xiàn)的培養(yǎng)物，應(yīng)在室溫保留23天后，再行觀察。沙門(mén)菌除雞雛沙門(mén)菌及無(wú)動(dòng)力的變種外，均具有周身鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，動(dòng)力試驗(yàn)陽(yáng)性。沙門(mén)菌生化反應(yīng)的初步鑒別見(jiàn)表2表2 沙門(mén)菌與有關(guān)細(xì)菌在三糖鐵瓊脂及初步生化試驗(yàn)的鑒別序號(hào)三糖鐵瓊脂靛基質(zhì)脲酶氰化鉀賴氨酸脫羧酶判定菌屬斜面產(chǎn)層產(chǎn)氣硫化氫1.1/沙門(mén)菌屬1.2/沙門(mén)菌屬2/緩慢愛(ài)德華菌屬3/弗勞地檸檬酸桿菌4.1S奇異變形桿菌4.2/S普通變形桿菌5/大腸埃希桿菌6/志賀菌屬7.1/陰溝腸桿菌7.2/肺炎克雷伯菌、產(chǎn)氣腸桿菌8S/普羅菲登斯菌屬、摩根菌屬9/蜂房哈夫尼亞菌、粘質(zhì)沙雷菌注：產(chǎn)酸（黃色），陽(yáng)性，陽(yáng)性率>90%；產(chǎn)堿（紅色），陰

12、性，陰性率>90%；多數(shù)陽(yáng)性、少數(shù)陰性；S產(chǎn)生少量氣體（本表依據(jù)何曉青衛(wèi)生防疫細(xì)菌檢驗(yàn)參考第八版美國(guó)臨床微生物手冊(cè)）；反應(yīng)序號(hào).不產(chǎn)H2S可結(jié)合血清學(xué)凝集試驗(yàn)，或加做部分生化試驗(yàn)，判定為沙門(mén)菌；反應(yīng)序號(hào)除典型反應(yīng)外，脲酶、氰化鉀試驗(yàn)、賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)三項(xiàng)中有一項(xiàng)異常；反應(yīng)序號(hào)僅靛基質(zhì)陽(yáng)性。其他情況可排除沙門(mén)菌。6.8 血清學(xué)凝集試驗(yàn)6.8.1 準(zhǔn)備1片潔凈的滅菌載玻片，在近中央的一端，以直徑3mm接種環(huán)沾取沙門(mén)菌屬多價(jià)1血清23環(huán)制成與玻片橫徑相垂直的條形涂抹，長(zhǎng)約1.5cm，寬約0.5cm。另一端用生理鹽水代替血清同法操作，作為陰性對(duì)照。6.8.2 用接種環(huán)分別挑取三糖鐵瓊脂斜面或營(yíng)養(yǎng)

13、瓊脂斜面的新鮮培養(yǎng)物少許，在血清和鹽水中混勻。菌量要適當(dāng)，勿過(guò)濃。6.8.3 將玻片前后傾斜數(shù)次，以暗色背景襯底，在良好的照明條件下進(jìn)行觀察，陰性對(duì)照不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象都是陽(yáng)性反應(yīng)。陽(yáng)性反應(yīng)通常在3min內(nèi)發(fā)生。有時(shí)因血清效價(jià)低、反應(yīng)遲緩時(shí)，應(yīng)將玻片置培養(yǎng)皿內(nèi)，并放一個(gè)濕棉球在旁邊，蓋上皿蓋，經(jīng)約20min，再觀察結(jié)果。如果仍然沒(méi)有出現(xiàn)凝聚，應(yīng)取斜面培養(yǎng)物，置含少量生理鹽水的試管中，制成濃菌懸液，在100水浴中保溫30min，以除去可能存在的Vi抗原，待冷，再做凝集試驗(yàn)，如出現(xiàn)凝集，仍判為陽(yáng)性反應(yīng)；如不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，則為陰性反應(yīng)。6.8.4 如對(duì)照試驗(yàn)出現(xiàn)凝集現(xiàn)象為非特異反應(yīng)，須對(duì)該菌株培養(yǎng)物進(jìn)行

14、處理后再作凝集試驗(yàn)。7 結(jié)果判定7.1 供試品培養(yǎng)物為革蘭陰性桿菌，三糖鐵瓊脂反應(yīng)及生化反應(yīng)符合沙門(mén)菌屬反應(yīng)。多價(jià)1血清凝集試驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)（含待檢培養(yǎng)物經(jīng)10030min處理后凝集試驗(yàn)為陽(yáng)性反應(yīng)），報(bào)告10g或10ml供試品檢出沙門(mén)菌。7.2 供試品培養(yǎng)物三糖鐵瓊脂反應(yīng)或生化反應(yīng)不符合沙門(mén)菌屬反應(yīng)。多價(jià)1血清凝集試驗(yàn)為陰性反應(yīng)（含待檢培養(yǎng)物經(jīng)10030min處理后凝集試驗(yàn)為陰性反應(yīng)），報(bào)告10g或10ml供試品未檢出沙門(mén)菌。7.3 供試品培養(yǎng)物出現(xiàn)下列情況，應(yīng)繼續(xù)鑒定或保留菌種，送交有關(guān)單位進(jìn)一不鑒定后，再作報(bào)告。7.3.1 供試品培養(yǎng)物的生化反應(yīng)符合沙門(mén)菌屬反應(yīng)多價(jià)1血清凝集試驗(yàn)陰性反應(yīng)。7.

15、3.2 供試品培養(yǎng)物的生化反應(yīng)不符合沙門(mén)菌屬反應(yīng)多價(jià)1血清凝集反應(yīng)呈陽(yáng)性反應(yīng)。7.4 對(duì)已檢出沙門(mén)菌的供試品分離的菌種，有條件者，應(yīng)進(jìn)一步作菌型鑒定。根據(jù)檢出菌的特性，推斷可能菌型，增加生化試驗(yàn)項(xiàng)目及沙門(mén)菌單因子血清“O”及“H”進(jìn)行鑒定。8 注意事項(xiàng)8.1 試驗(yàn)用培養(yǎng)基，需經(jīng)過(guò)質(zhì)量鑒定，用已知典型反應(yīng)菌株（如乙型副傷寒沙門(mén)菌CMCC（B）50094進(jìn)行測(cè)試，其靈敏度及特征性反應(yīng)應(yīng)符合要求。培養(yǎng)基需在規(guī)定條件保存，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)使用。分離平板在使用 應(yīng)置36溫箱內(nèi)倒置孵育12h，使其表面溫暖濕潤(rùn)，利于分離。8.2 在對(duì)供試品進(jìn)行測(cè)試的同時(shí)，需做陽(yáng)性菌對(duì)照及陰性對(duì)照。陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)，陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)

16、顯示陽(yáng)性結(jié)果，否則檢驗(yàn)結(jié)果無(wú)效。特別是用接種環(huán)沾取菌液進(jìn)行接種或分離時(shí)，避免動(dòng)作過(guò)大，形成氣溶膠，污染操作環(huán)境。8.3 為保證試驗(yàn)方法發(fā)可靠性，對(duì)分離平板上的疑似菌落，應(yīng)多選取幾個(gè)菌落同時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。挑取菌落時(shí)，不要在分離平板菌落密集部位挑取可疑菌落，而應(yīng)在菌落分布稀疏部位挑選。8.4 生化試驗(yàn)及血清學(xué)試驗(yàn)的被鑒定培養(yǎng)物必須是純培養(yǎng)物，否則，不可能得到正確結(jié)果。如遇血清學(xué)凝集試驗(yàn)陽(yáng)性而生化試驗(yàn)不符合時(shí)，應(yīng)首先檢查培養(yǎng)物的純度。對(duì)已污染的培養(yǎng)物，不應(yīng)丟棄，因?yàn)槲廴揪赡苎谏w沙門(mén)菌，故應(yīng)對(duì)被污染的培養(yǎng)物重新分離，仔細(xì)選取單個(gè)菌落再進(jìn)行試驗(yàn)。8.5 所有生化反應(yīng)均需按照規(guī)定的試驗(yàn)要求進(jìn)行，如觀察三糖鐵瓊脂斜面反應(yīng)的時(shí)間，應(yīng)在24±2h，時(shí)間過(guò)短過(guò)長(zhǎng)，都可能出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果判斷。又如氰化鉀試驗(yàn)，試管口