細(xì)胞系及其應(yīng)用吳克復(fù)

1、血源細(xì)胞系及其應(yīng)用吳克復(fù)現(xiàn)命科學(xué)研究的主要方法實(shí)驗(yàn)研究(in vivo; in vitro; ex vivo)-取得自然現(xiàn)象的第資料，是生物醫(yī)學(xué)研究的基礎(chǔ)，仍是大多數(shù)研究的主要內(nèi)容。臨床研究理論研究-進(jìn)化生物學(xué)(理論生物學(xué))，網(wǎng) 絡(luò)生物學(xué)等；近十多年來，各種組學(xué)(omics)的高通量測(cè)定取得了海量的數(shù)據(jù)， 建立了生物信息學(xué)。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)生物學(xué) 研究(in silico)-通過生物信息學(xué)建立計(jì)算機(jī)模型進(jìn)行研究。醫(yī)學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的三個(gè)主要體系 人類/動(dòng)物標(biāo)本(包括原代培養(yǎng)細(xì)胞)-臨床和實(shí)驗(yàn)研究(exvivo) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物-體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究(invivo) 細(xì)胞系-體外實(shí)驗(yàn),和細(xì)胞生物學(xué)研究(invitro)

2、思考題：如何選擇實(shí)驗(yàn)體系？三系的比較組織/細(xì)胞標(biāo)本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)胞糸性質(zhì)來源純度應(yīng)用評(píng)價(jià)exvivoinvivoinvitro臨床、動(dòng)物房異質(zhì)性臨床/前/基礎(chǔ)一線資料動(dòng)物房異質(zhì)性 臨前/基礎(chǔ)體內(nèi)研究單克隆*基礎(chǔ)/生產(chǎn)體料思考題：完善三系的比較！研究結(jié)果的分析處理A data integration framework for using disparate -omic data sets together to identify functional sub-networks in complex phenotypes.研究結(jié)果的整合應(yīng)用細(xì)胞系的基本性質(zhì)什么是細(xì)胞系？ 組織/細(xì)胞培養(yǎng)-模擬體內(nèi)微環(huán)

3、境在人工條件下維持組織/細(xì)胞生存，促使其生長、增殖。按培養(yǎng)方法和時(shí)間有多種分類 細(xì)胞系和細(xì)胞株-指能夠連續(xù)傳代培養(yǎng)的細(xì)胞群體，能保持細(xì)胞性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定的稱細(xì)胞株；否則稱細(xì)胞系。什么是細(xì)胞系？ 細(xì)胞系是已經(jīng)適應(yīng)體外培養(yǎng)環(huán)境的新的生物種，可以穩(wěn)定地在體外生長、增殖，類似于家畜、家禽和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。 可以視為培養(yǎng)瓶中細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)體系，比實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單純，更易于操作和。不用時(shí)可以深低溫（液氮）長期保存;便于。思考題:試比較細(xì)胞系與單細(xì)胞生物（如細(xì)菌、原生動(dòng)物）的性質(zhì)異同。細(xì)胞系的生長遵循學(xué)的一般規(guī)律細(xì)胞系的培養(yǎng)即掌握細(xì)胞系對(duì)環(huán)境的需求，按學(xué)規(guī)律提供最佳生長條件。體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長遵循希最小因子minimum”

4、）定律（Liebigs”lawof低于某種生物需要的最小量的任何特定因子，是決定該種生物生存和分布的根本因素例：谷胺酰胺和血清是決定培養(yǎng)細(xì)胞生長好壞的最小因子。 任何因子，當(dāng)接近或超過該生物的耐受極限而其生存、生長、繁殖或擴(kuò)散時(shí)，該因子稱為限制因子。因子處于最小量時(shí)成為限制因子，過量時(shí)也可以成為限制因子，即限制因子定律（Lawoflimitingfactors）。 設(shè)計(jì)和配制細(xì)胞培養(yǎng)液時(shí)必須遵循利比希最小因子定律和限制因子定律。思考題：最小因子定律和限制因子定律對(duì)細(xì)胞培 養(yǎng)實(shí)驗(yàn)體系有什么作用和意義?培養(yǎng)細(xì)胞的質(zhì)量檢測(cè)-如何細(xì)胞的生長狀態(tài)肉眼觀察：培養(yǎng)液pH值；細(xì)胞碎片（培養(yǎng)液清或混濁）細(xì)胞成叢

5、有無污染？光學(xué)顯微鏡觀察：活細(xì)胞-形態(tài)、折光率、密度、中期相；細(xì)胞碎片或顆粒；死活細(xì)胞計(jì)數(shù)。有無污染？固定細(xì)胞染色：形態(tài)、相指數(shù),細(xì)菌。特殊細(xì)胞化學(xué)染色（需要時(shí)，因細(xì)胞系性質(zhì)而異）。培養(yǎng)細(xì)胞的質(zhì)量-細(xì)胞生長的動(dòng)力學(xué)分析 體外培養(yǎng)細(xì)胞的增殖動(dòng)力學(xué)曲線呈S 形，遵循邏輯斯諦方程 （logisticequation）dN/dt=rN(1-N/K)e-rt其式為：Nt=K/(1+)對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞，N代表細(xì)胞濃度，t代表時(shí)間，r為增長率，K為環(huán)境容納量，參數(shù)的值取決于N0，表示曲線對(duì)原點(diǎn)的相對(duì)位置。細(xì)胞生長曲線的測(cè)定細(xì)胞生長曲線測(cè)定的作用和意義死活細(xì)胞計(jì)數(shù)的原理-拒染細(xì)胞計(jì)數(shù)與注意事項(xiàng)指數(shù)參照操作者個(gè)人差

6、異-方法標(biāo)準(zhǔn)化，定人操作。拒染法測(cè)出的是什么狀態(tài)的細(xì)胞?! 染色后計(jì)數(shù)時(shí)間的影響采樣技術(shù)的影響計(jì)數(shù)方法的影響檢驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)的選擇細(xì)胞系的數(shù)量-如何掌握培養(yǎng)細(xì)胞系的產(chǎn)量懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的密度效應(yīng)遵循農(nóng)作物的最后產(chǎn)量衡值法則（lawofconstantfinalyield）Y=Wd=KY為產(chǎn)量；W為平均重量；d為密度；K為常數(shù)。細(xì)胞系的數(shù)量-如何掌握培養(yǎng)細(xì)胞系的產(chǎn)量貼壁生長的正常細(xì)胞長滿后通?？梢?： 2至1：3比例傳代培養(yǎng)，遵循植株和固著性動(dòng)物增殖的密度效應(yīng)：Yoda氏-3/2 自疏法則（ Yodas law），即3/23/2W=Cd對(duì)數(shù)式為：lgW=lgC3/2lgd細(xì)胞系的應(yīng)用細(xì)胞系的分類和性質(zhì)腫瘤

7、細(xì)胞系轉(zhuǎn)化細(xì)胞系：小鼠3T3細(xì)胞系；因子依賴細(xì)胞系干細(xì)胞系誘導(dǎo)干細(xì)胞系(iPS)LCL轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系或EBV-LCL(Lymphoblastoid的腫瘤細(xì)胞系,以CellLine)為例I型II型III型EBERs, BARTs EBNA1 EBERs, BARTs EBNA1LMP1, LMP2A, LMP2BEBERs, BARTs多數(shù)EBV+Burkitt淋巴瘤所有EBV+Hodgkin淋巴瘤部分NK/T淋巴瘤，鼻咽癌大多數(shù)移植后淋巴增殖病EBNA1,EBNA2,EBNA-3A,-3B,-3C,EBNALP, LMP1, LMP2A, LMP2BLCLEBERs與LCL生長的關(guān)系

8、EBER2>EBER1常用血源細(xì)胞系的分類和性質(zhì) 人白血病細(xì)胞系（LL）-是我們應(yīng)用最多的細(xì)胞系，源自白血病、淋巴瘤患者的腫瘤細(xì)胞，通常引自其他或購自細(xì)胞厙。液氮保存積累形成本的小細(xì)胞厙。 目前通用的是按其來源和細(xì)胞系的性質(zhì)分類。 如HL-60為髓系白血病細(xì)胞系；NH4為早幼粒白血病細(xì)胞系。常用白血病細(xì)胞系(LL)舉例Raji(1964)Burkitt Lym.成熟B細(xì)胞不成熟T細(xì)胞紅系;非T非B; 單核細(xì)胞B,單核細(xì)胞髓細(xì)胞紅系巨核細(xì)胞髓細(xì)胞髓細(xì)胞EBV t(8;14,MYC-IGH)CCRF-CEMK-562(1973)ALLCML-BCCD2Tt(9,22),Ph+,BCR-ABL

9、單核細(xì)胞系HHV-6,EBV雙髓細(xì)胞系紅白血病細(xì)胞系因子依賴系 M2b細(xì)胞系早幼粒細(xì)胞系U937(1976) 組織細(xì)胞瘤J6-1(1976) HL-60(1977) HEL(1982) M-07e (1988)Kasumi-1NB4(1991)AML？AML AML M6 AML M7 AML M2AML M3血源細(xì)胞系的建立 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選擇病例和取材。 根據(jù)細(xì)胞性質(zhì)及其體內(nèi)微環(huán)境選擇或設(shè)計(jì)配制培養(yǎng)液和培養(yǎng)方法。 收集和保存原始資料。 細(xì)胞培養(yǎng)-渡過期（適應(yīng)期）。 明顯增殖后液氮保存部分細(xì)胞。 規(guī)律增殖后大量保存細(xì)胞。 細(xì)胞系性質(zhì)的鑒定細(xì)胞系應(yīng)用的若干具體問題細(xì)胞系的選擇根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇適宜

10、的細(xì)胞系。引進(jìn)或從細(xì)胞庫。引進(jìn)的細(xì)胞系應(yīng)該先進(jìn)行培養(yǎng)鑒定，驗(yàn)證與原始文獻(xiàn)的主要數(shù)據(jù)和性狀是否一致，差異有多大？熟悉細(xì)胞系性狀后（活細(xì)胞形態(tài)、生長曲線測(cè)定- 掌握倍增時(shí)、到達(dá)對(duì)數(shù)生長期和平臺(tái)期的時(shí)間；能達(dá)到最高濃度等）再進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。細(xì)胞系成分均一的相對(duì)性多數(shù)細(xì)胞系是單克隆源的，也有隆源的（如LCL）；細(xì)胞群體不可能絕對(duì)同步；作為群體,細(xì)胞系可以無限繁衍；單個(gè)細(xì)胞則可以出現(xiàn)凋亡（apoptosis）（senescence），突變，與別的細(xì)胞融合產(chǎn)生重新編程（reprogramming）等,使群體（細(xì)胞系）產(chǎn)生遺傳漂變。細(xì)胞系的衰老細(xì)胞(senescence)二倍體細(xì)胞株的細(xì)胞。新鮮組織來源的培養(yǎng)細(xì)

11、胞呈有限的傳代次數(shù)。細(xì)胞系的培養(yǎng)（？）細(xì)胞系的漂變 漂變是群體遺傳學(xué)現(xiàn)象 引起細(xì)胞系漂變的分析環(huán)境變化-培養(yǎng)液，血清，溫度，器皿，操作習(xí)慣漂變和衰老的對(duì)策 應(yīng)對(duì)細(xì)胞系的遺傳漂變和細(xì)胞株（如人二倍體細(xì)胞株）的衰老，必須足夠份額的細(xì)胞液氮保存。保證實(shí)驗(yàn)在盡少傳代范圍內(nèi)(<5代)完成。復(fù)蘇細(xì)胞必須在生長、增殖穩(wěn)定后才能用于實(shí)驗(yàn)。共培養(yǎng)（co-culture）競(jìng)爭(zhēng)排斥原理（competitiveexclusionprinciple）位（niche）相同的兩物種不能在同一棲息地生存，它們互相排斥，優(yōu)勢(shì)者排斥劣勢(shì)者。在兩個(gè)細(xì)胞糸共培養(yǎng)時(shí)，往往將其中的一系用電離輻射處理失去增殖能力，成為飼養(yǎng)層細(xì)胞?；?/p>

12、者用半透膜（transwell）隔開。這種方法的缺點(diǎn)不能觀察細(xì)胞間直接接觸的相互作用，只能研究因子。細(xì)胞系應(yīng)用的若干技術(shù)問題細(xì)胞生長不佳的常見-污染-支原體、細(xì)菌溶原狀態(tài)（長期添抗菌素時(shí)）、真菌（快速傳代時(shí)）、原蟲、細(xì)胞。血清不合適；營養(yǎng)液配制或保存不佳加（谷氨酰胺分解）；培養(yǎng)溫度或二氧化碳濃度不適合；器皿等。細(xì)胞系應(yīng)用的若干技術(shù)問題 對(duì)策：熟練操作，嚴(yán)格無菌術(shù)和操作規(guī)程。營養(yǎng)液、血清小量分裝，一次用完，避免重復(fù)使用。嚴(yán)格培養(yǎng)箱管理，盡量減少開箱次數(shù)，有條件時(shí)將傳代培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)。細(xì)胞系的液氮保存生物化學(xué)反應(yīng)速率與其他化學(xué)反應(yīng)一樣，環(huán)境溫度升高10代謝速率增加一倍即：Q10=2根據(jù)這個(gè)規(guī)律推算

13、溫度降至-79以下細(xì)胞代謝基本停止，細(xì)胞可以長期保存，現(xiàn)在普遍采用的液氮貯存（-196），理論上可以保存一千年。細(xì)胞系的液氮保存對(duì)“”的要求-選取確認(rèn)無污染的對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞保存。細(xì)胞濃度-1瓶細(xì)胞存1個(gè)安瓿。（復(fù)蘇時(shí)按原瓶量）逐步降溫-1-5/分細(xì)胞保存的兩個(gè)技術(shù)問題-液氮保存中兩個(gè)可能造成嚴(yán)重事故的錯(cuò)誤 二甲基亞砜（DMSO）溶于水是放熱反應(yīng)。必須先配制保存液，等溫度下降至常溫 后再加細(xì)胞液。否則能嚴(yán)重?fù)p傷細(xì)胞， 明顯降低復(fù)蘇率，甚至造成細(xì)胞系丟失。 保存細(xì)胞的容器泄漏，復(fù)蘇時(shí)取出可以引起。PV=nRT對(duì)策：仔細(xì)檢查；預(yù)凍時(shí)倒置安瓿， 以液體封住縫隙。思考題：液氮保存的關(guān)鍵試劑是什么？原理是什么？嚴(yán)格操作規(guī)程，提高操作技能無菌（害）術(shù)的作用和意義是實(shí)驗(yàn)順利完成的基礎(chǔ)和保障。是自我保護(hù)的基礎(chǔ)和保障。是環(huán)境保護(hù)的基礎(chǔ)和保障。是實(shí)驗(yàn)水平的標(biāo)準(zhǔn)之一。關(guān)于“細(xì)胞碎片(celldebris)”死細(xì)胞、凋亡細(xì)胞“碎片”活細(xì)胞產(chǎn)物：膜囊泡、外閱讀資料1. 吳克復(fù)：造血細(xì)胞的體外培養(yǎng)。（先,