實(shí)驗(yàn)2RT-PCR擬南芥葉片

1、實(shí)驗(yàn)二 半定量RT-PCR分析擬南芥葉片PPH基因表達(dá)田亞楠田亞楠實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解植物葉綠素酶基因的功能2、掌握半定量RT-PCR操作方法3、掌握基因定量分析的方法實(shí)驗(yàn)原理 RT-PCR(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction)是以RNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，由人工合成引物介導(dǎo)生成cDNA第一鏈，以此再作為聚合酶鏈反應(yīng)的模板，在TaqDNA聚合酶作用下，擴(kuò)增產(chǎn)生大量DNA片斷。該方法理論上有一個(gè)單拷貝cDNA模板即可完成擴(kuò)增，因此它比較適合作基因表達(dá)的定量研究，是一種常用的具有很高靈敏度和特異性的基因表達(dá)檢測方法。RT-PCR方法有定量R

2、T-PCR和半定量RT-PCR法，定量PCR法對實(shí)驗(yàn)儀器和樣本處理的要求較高，而半定量PCR法對試驗(yàn)條件的要求不高，它的主要特點(diǎn)是選擇一個(gè)比較標(biāo)準(zhǔn)(control)又稱為內(nèi)參基因，以消除試驗(yàn)誤差，樣本間用于比較的值不是絕對值，而是相對值，因此稱半定量RT-PCR法。內(nèi)參基因的設(shè)定GAPDH GAPDH （3-3-磷酸甘油醛脫氫酶）、磷酸甘油醛脫氫酶）、-Actin-Actin（-肌動(dòng)蛋肌動(dòng)蛋白白）、）、UBQUBQ（泛蛋白）（泛蛋白）關(guān)于PPH基因提取質(zhì)量較好的RNA：28 S和18 SRNA帶型完整，無明顯拖尾現(xiàn)象，無明顯的降解。一般情況下，用于基因表達(dá)檢測的RNA樣品，必須DNase A去

3、除基因組后使用，避免基因組DNA干擾。RNA純品:OD260 /OD280 2.0(1.8-2.0)，OD260 /OD230 2.0 若OD260/OD280小于1.8，說明樣品中還可能含有蛋白質(zhì)或酚，應(yīng)再用酚/氯仿抽提，以乙醇沉淀純化RNA。若OD260/OD280大于2.0，則提示可能有異硫氰酸殘存或RNA降解。OD260/OD230比值小于2.0時(shí)表明有小分子及鹽存在。PCR BufferPCR Buffer2.52.5 L LdNTPsdNTPs2 2 L LTemplateTemplate1 1 L L上游引物上游引物 (10 (10 M)M)1 1 L L下游引物下游引物 (10

4、 (10 M)M)1 1 L LrTaqrTaq0.25L0.25LRNaseRNase Free H2O Free H2O17.25 17.25 L L總體積總體積25L25L取取0.2 ml PCR0.2 ml PCR反應(yīng)管一只，用微量加樣槍按下述順序分別加入各試劑反應(yīng)管一只，用微量加樣槍按下述順序分別加入各試劑( (注意每換一種試注意每換一種試劑換一個(gè)新吸頭劑換一個(gè)新吸頭) )： 如配好的反應(yīng)液較多沾到管壁上，可將如配好的反應(yīng)液較多沾到管壁上，可將PCRPCR反應(yīng)管置臺式離心機(jī)中瞬時(shí)離心，使反應(yīng)液集中于管底，然后將反反應(yīng)管置臺式離心機(jī)中瞬時(shí)離心，使反應(yīng)液集中于管底，然后將反應(yīng)管放到基因擴(kuò)增儀應(yīng)管放到基因擴(kuò)增儀(PCR(PCR儀儀) )上上 . 98預(yù)變性3分鐘后開始以下循環(huán) 98 30 sec Tm 30 sec 26 循環(huán)（PPH） 72 1 min 72 5 min 4 保溫PCR過程約1小時(shí)20分鐘24 循環(huán)（ACT2）取 5-