辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記ppt課件

1、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)志辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)志抗體技術(shù)及運(yùn)用進(jìn)展抗體技術(shù)及運(yùn)用進(jìn)展8310023283100232王偉航王偉航實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理1免疫標(biāo)志技術(shù) 免疫標(biāo)志技術(shù)是將一些既易測(cè)定又具有高度敏感性的物質(zhì)標(biāo)志到特異性抗原或抗體分子上，經(jīng)過(guò)這些標(biāo)志物的加強(qiáng)放大效應(yīng)來(lái)顯示反響系統(tǒng)中抗原或抗體的性質(zhì)與含量。常用的標(biāo)志物包括熒光素、酶和放射性核素等，用這3種標(biāo)志物進(jìn)展標(biāo)志的免疫檢測(cè)技術(shù)被稱(chēng)為3大免疫標(biāo)志技術(shù)。目前，運(yùn)用的免疫標(biāo)志物還有化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、鐵蛋白和膠體金等。2辣根過(guò)氧化物酶辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)志抗體的原理標(biāo)志抗體的原理a. 辣根過(guò)氧化物酶辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish Peroxida

2、se, HRP HRP廣泛分布于植物界，它是由無(wú)色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結(jié)廣泛分布于植物界，它是由無(wú)色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結(jié)合而成的糖蛋白，糖含量合而成的糖蛋白，糖含量18。HRP由多個(gè)同功酶組成，分子量為由多個(gè)同功酶組成，分子量為40,000,等電點(diǎn)為等電點(diǎn)為pH39，酶催化的最適，酶催化的最適PH因供氫體不同而稍有差因供氫體不同而稍有差別，但多在別，但多在pH5左右。酶溶于水和左右。酶溶于水和58以下的硫酸銨溶液。以下的硫酸銨溶液。HRP的輔的輔基和酶蛋白最大吸收光譜分別為基和酶蛋白最大吸收光譜分別為403nm和和275nm，普通以，普通以O(shè)D403nm OD275nm的比值的比值RZ(

3、德文德文Reinheit Zahl)表示酶的純表示酶的純度。度。 HRP的催化反響需求底物過(guò)氧化氫的催化反響需求底物過(guò)氧化氫(H2O2)和供氫體和供氫體(DH2)。供氫。供氫體多為無(wú)色的復(fù)原型染料，經(jīng)過(guò)反響可生成有色的氧化型染料體多為無(wú)色的復(fù)原型染料，經(jīng)過(guò)反響可生成有色的氧化型染料(D)。 HRP DH2H2O2D2H2Ob. 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)志方法辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)志方法 酶標(biāo)志抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過(guò)碘酸鹽氧化酶標(biāo)志抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過(guò)碘酸鹽氧化法。法。 辣根過(guò)氧化物酶的標(biāo)志常用過(guò)碘酸鹽氧化法，這種方法法只適用于辣根過(guò)氧化物酶的標(biāo)志常用過(guò)碘酸鹽氧化

4、法，這種方法法只適用于含糖量較高的酶。過(guò)碘酸鈉將含糖量較高的酶。過(guò)碘酸鈉將HRP分子外表的多糖氧化為醛基，醛基與分子外表的多糖氧化為醛基，醛基與抗體分子上的氨基構(gòu)成抗體分子上的氨基構(gòu)成Schiff堿而結(jié)合。后者可進(jìn)一步用堿而結(jié)合。后者可進(jìn)一步用NaBH(或乙醇或乙醇胺胺)復(fù)原生成穩(wěn)定的酶標(biāo)志抗體。復(fù)原生成穩(wěn)定的酶標(biāo)志抗體。 在酶標(biāo)過(guò)程中普通都混有未結(jié)合的酶和抗體。游離酶實(shí)際上不影響最終的顯色。但游離的抗體那么不同，它會(huì)與酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)固相抗原，從而減少了結(jié)合到固相上的酶標(biāo)抗體的量。因此需求對(duì)制備的酶結(jié)合物進(jìn)展純化，去除游離的酶和抗體。純化的方法很多，硫酸銨鹽析法最為簡(jiǎn)便，但效果并不理想。用離子交

5、換層析、分子篩法可得到最正確的分別效果，但費(fèi)用較貴。 四 操作步驟 1稱(chēng)取5mgHRP溶解于0.5ml蒸餾水中。2向溶液中參與0.5ml新配的0.1M NaIO溶液，混勻， 4靜置30分鐘。3參與0.16M乙二醇水溶液0.5ml，混勻， 靜置30分鐘。4參與含5mg抗體的水溶液1ml，混勻裝入透析袋，pH9.5 碳酸鹽緩沖液透析，4過(guò)夜。5加加0.2 mL 新配的新配的5 mg/mL NaBH液，混勻，再置液，混勻，再置4 , 2h。6在攪拌下逐滴參與等體積飽和硫酸銨，置在攪拌下逐滴參與等體積飽和硫酸銨，置4 1h。73000 r/min 離心半小時(shí)，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗離心半小時(shí)，

6、棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量二次，最后沉淀物溶于少量0.15moL/L pH7.4 的的PBS中。中。8 將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)0.15 moL/L pH7.4的的PB緩沖緩沖鹽水透析，去除銨離子后鹽水透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測(cè)用萘氏試劑檢測(cè))，10,000 r/min 離心離心30 min 去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，冰凍保管。去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，冰凍保管。酶制劑及其底物 凡無(wú)毒性又能呈現(xiàn)有色化學(xué)反響的酶，原那么上均可作為標(biāo)志用。但作為標(biāo)志抗體用的 酶應(yīng)滿(mǎn)足以下要求：(1)來(lái)源方便，易于純化；(2)比

7、活性高，性質(zhì)穩(wěn)定；(3)酶活性和量能 用簡(jiǎn)一方法測(cè)定。目前在免疫酶技術(shù)中常用的酶為辣根過(guò)氧化物酶(HRP)和鹼性磷酸酶 (AP)，其次還有葡萄糖氧化酶，-半乳糖苷酶、溶菌酶和蘋(píng)果酸脫氫酶等。由于辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，穩(wěn)定，分子量小，純酶容易制備，所以最常用。HRP廣泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由無(wú)色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結(jié)合而成的糖蛋白，糖含量18。HRP由多個(gè)同功酶組成，分子量為40,000,等電點(diǎn)為PH39,酶催化的最適PH因供氫體不同而稍有差別，但多在PH5左右。酶溶于水和58以下飽和度硫酸銨溶液。HRP的輔基和酶蛋白最大

8、吸收光譜分別為403nm和275nm，一般以O(shè)D403nm OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的純度。高純度的酶RZ值應(yīng)在3.0左右(最高可達(dá)3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得留意的是，純度并不表示酶活性，如當(dāng)酶變性后，RZ值仍可不變。HRP的催化反響需求底物過(guò)氧化氫(H2O2)和供氫體(DH2)。供氫體多為無(wú)色的復(fù)原型染料，經(jīng)過(guò)反響可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反響的過(guò)程如下:HRPDH2H2O2D2H2O供氫體的種類(lèi)很多，構(gòu)成的產(chǎn)物特點(diǎn)不一。如DAB(3.3二氨基聯(lián)苯胺)的反響產(chǎn)物為不溶性沉淀物，并有電子密度，故適宜于做免疫酶染色或電鏡察看。5AS

9、(5-氨基水楊酸)早期曾用于ELISA，但其溶解度不夠大，且空白孔不易控制到無(wú)色，現(xiàn)已很少運(yùn)用。OT(鄰聯(lián)甲苯胺)的特點(diǎn)是能產(chǎn)生艷麗的藍(lán)綠色產(chǎn)物且靈敏度較高，但反響中受溫度影響較大，而且由于產(chǎn)物不穩(wěn)定，需求在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)展測(cè)定。目前用得較廣泛和較稱(chēng)心的供氫體是：OPD(鄰苯二胺)和TMB(四甲基聯(lián)苯胺)。前者構(gòu)成的產(chǎn)物為深桔黃色或棕色，后者產(chǎn)物為藍(lán)綠色，二者的可溶性均好，在避光處顏色穩(wěn)定，空白可近于無(wú)色，靈敏度上據(jù)報(bào)道后者比前者可高4倍以上。 另外，還有一種供氫體稱(chēng)ABTS2, 2-邊氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺 酸)，其反響產(chǎn)物呈藍(lán)綠色，且靈敏度和穩(wěn)定性均好。尤其是在致癌的潛在能夠性方

10、面， ABTS與TMB皆是值得被優(yōu)選的供氫體。 由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制劑，因此酶促反響中運(yùn)用的H2O2不能過(guò)量。應(yīng) 控制在經(jīng)較短時(shí)間反響后呈色即達(dá)頂峰闡明HO已耗費(fèi)殆盡。這樣即使再延伸時(shí)間 也不會(huì)添加反響產(chǎn)物的顏色。HRP標(biāo)志抗體的方法 酶與抗體交聯(lián)的方法有許多種,根據(jù)酶的構(gòu)造不同可采用不同的方法。對(duì)于制備HRP結(jié) 合物，可用戊二醛二步法和過(guò)碘酸鈉法。尤以簡(jiǎn)易過(guò)碘酸鈉法更為常用。戊二醛二步法 1.原理：戊二醛為一種雙功能試劑，經(jīng)過(guò)其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共 價(jià)結(jié)合，構(gòu)成酶-戊二醛-免疫球蛋白結(jié)合物。2.標(biāo)志步驟： (1)稱(chēng)取HRP25mg溶于1.25戊二醛溶液中，于

11、室溫靜置過(guò)夜。 (2)反響后的酶溶液經(jīng)Sephadex G-25層析柱，用生理鹽水洗脫。流速控制在1ml1分 鐘，搜集棕色流出液。如體積大于5ml，那么以PEG濃縮至5ml。放置25ml小燒杯中，緩慢攪 拌。 (3)將待標(biāo)志的抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴參與酶溶液中。 (4)用1M PH9.5碳酸緩沖液0.25ml，繼續(xù)攪拌3?小時(shí)。 (5)加0.2M賴(lài)氨酸0.25ml，混勻后，置室溫2小時(shí)。 (6)在攪拌下逐滴參與等體積飽和硫酸銨，置41小時(shí)。 (7)3000rpm離心半小時(shí)，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于 少量0.15M PH7.4的PBS中。 (

12、8)將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)0.15M PH7.4的PB緩沖鹽水透析，去除銨離子后(用 萘氏試劑檢測(cè))，10,000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，冰凍保 存。3.結(jié)果斷定： (1)定性及效價(jià)滴定：用特異性抗原(或抗體)同酶標(biāo)志抗體(或抗免疫球蛋白抗體)作 雙向瓊脂分散實(shí)驗(yàn)或免疫電泳實(shí)驗(yàn)。然后用酶的底物使沉淀弧顯色，可初步鑒定其活性。 最后以直接ELISA法(或在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里)對(duì)酶結(jié)合物進(jìn)展滴定( 見(jiàn)本節(jié) (三)任務(wù)濃度的選 擇)。(2)定量和克分子比值測(cè)定： (2)定量和克分子比值測(cè)定：可用分光光度計(jì)測(cè)定(光程1cm)。 酶量(mgml)OD403nm0.4 IgG量(mgml)OD280nm-OD403nm0.42)0.940.62 酶量(mgml) IgG量(mgml) 酶量 克分子比值 4 40,000 160,000IgG量本卷須知1為提高標(biāo)志效率，應(yīng)嚴(yán)厲掌握整個(gè)反響體系中9的抗體含量。2碘酸鈉要新穎配制。3.室溫?cái)嚢钑r(shí)須避光，室內(nèi)溫度普通在25為宜。標(biāo)志物每次透析前，須仔細(xì)檢查，防止漏液本卷須知 4在具備高質(zhì)量HRP的條件下，所要標(biāo)志的抗體也要活性高,效價(jià)高(最低1 16)