植物中C1半胱氨酸蛋白酶的研究進(jìn)展

1、植物中C1半胱氨酸蛋白酶的研究進(jìn)展蛋白酶幾乎參與到所有的生物現(xiàn)象，它不僅僅是將蛋白質(zhì)水解成氨基酸以便機(jī)體循環(huán)，還可以激活蛋白質(zhì)或使蛋白質(zhì)失活。不僅如此，蛋白酶已經(jīng)成為現(xiàn)代食品和飼料工業(yè)消費(fèi)中不可或缺的部分，為人類和動物的消費(fèi)創(chuàng)造出龐大而多元化的產(chǎn)品。從植物中提取的酶制劑已用于工業(yè)消費(fèi)中很長一段時間，盡管關(guān)于酶的性質(zhì)和特性還不清楚。很多商業(yè)用酶都來源與微生物，但是植物來源的酶因其在工業(yè)、生物工程和制藥領(lǐng)域的應(yīng)用而變得越來越重要。已有研究在菊科、木瓜科、?？啤⑻}呮科、夾竹桃科的乳液中別離出蛋白酶，這些蛋白酶大多屬于C1半胱氨酸蛋白酶，因其在很寬的溫度和pH范圍內(nèi)都有活性而得到了人們廣泛關(guān)注，比方木

2、瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶和無花果蛋白酶等被廣泛應(yīng)用于不同領(lǐng)域的工業(yè)和制藥領(lǐng)域。1 半胱氨酸蛋白酶的定義半胱氨酸蛋白酶，也被稱為硫醇蛋白酶，是生物體中蛋白水解酶的一大類。目前，國際上通用的蛋白酶分類方法是根據(jù)酶的活性中心組成來分類，半胱氨酸蛋白酶在其活性中心含有親核Cys殘基，同其他兩個關(guān)鍵氨基酸組成了Cys-His-Asn/Glu的催化三聯(lián)體催化相應(yīng)的蛋白水解。2 植物中半胱氨酸蛋白酶的分類植物中的半胱氨酸蛋白酶主要分為木瓜蛋白酶(C1)家族或者豆類天冬氨酸蛋白內(nèi)切酶(C13)家族兩大類。其中木瓜蛋白酶家族是最大的家族，因?yàn)檩^廣的底物選擇性和熱穩(wěn)定性而被應(yīng)用于很多領(lǐng)域，成為人們研究的熱點(diǎn)。此外，也

3、有研究發(fā)現(xiàn)還包括天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶亞家族(C14)、鈣依賴半胱氨酸蛋白酶亞家族(C2)等。3 植物中C1半胱氨酸蛋白酶的純化和性質(zhì)表征19世紀(jì)40年代以來，已有多種半胱氨酸蛋白酶從灌呮、牛角瓜屬、阿魯藤屬、獼猴桃屬等植物中被別離鑒定。其中C1家族半胱氨酸蛋白酶的相關(guān)研究最多，比方木瓜蛋白酶、獼猴桃素、蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶和菠蘿蛋白酶，對這些蛋白酶進(jìn)展酶學(xué)性質(zhì)表征研究，對其在飲料、食品和制藥領(lǐng)域具有非常重要的意義。從番木瓜乳液中別離得到的木瓜蛋白酶是最先發(fā)現(xiàn)的C1半胱氨酸蛋白酶，該酶的分子量為23.4 kDa，最適pH 5.57.0，在中性pH和高溫下穩(wěn)定。其他幾種木瓜蛋白酶類半胱

4、氨酸蛋白酶也逐漸被發(fā)現(xiàn)，Actinidin是從獼猴桃果實(shí)中提取的一種類似木瓜蛋白酶的水解酶，Carne和Moore曾經(jīng)在中華獼猴桃果實(shí)中將其別離并且獲得了該酶的氨基酸序列。張敏等在涼薯的種子中別離得到了蛋白酶SPE31，從木瓜屬的多種植物中別離得到了木瓜蛋白酶，但是卻表現(xiàn)出了不同的蛋白水解活性，鳳梨屬植物中也別離得到了多種該家族蛋白酶，在醫(yī)學(xué)上被廣泛用于驅(qū)蟲藥，并且具有良好的熱穩(wěn)定性，在65 條件有最適活性。在狗牙花屬植物的乳液中發(fā)現(xiàn)了3種半胱氨酸蛋白酶，分別命名為Ervatamins A，B和C，這三種酶在構(gòu)造和功能上都有很大的不同。研究發(fā)現(xiàn)Ervatamin-C最為穩(wěn)定，在pH 212，溫

5、度70 ，高濃度化學(xué)變性劑存在的條件下仍能維持二級和三級構(gòu)造保持活性。4 植物中C1半胱氨酸蛋白酶的催化機(jī)理研究木瓜蛋白酶家族中的很多蛋白的3D構(gòu)造都已經(jīng)被解析，包括木瓜蛋白酶、獼猴桃素、木瓜蛋白酶IV、組織蛋白酶B等。通過底物類似物抑制劑和酶晶體構(gòu)造研究可證實(shí)該酶的底物特異性。盡管該家族酶的一級構(gòu)造和三級構(gòu)造具有很高的同源性，但是在穩(wěn)定性、活性和底物特異性上有很大差異。C1家族蛋白酶通常以酶原的形式存在，大多數(shù)為內(nèi)切酶，少數(shù)為外切酶。含有1026個氨基酸殘基組成的前導(dǎo)肽，前導(dǎo)肽結(jié)合到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后，通過分子內(nèi)或分子間蛋白水解而激活酶的活性區(qū)域。木瓜蛋白酶是典型的C1半胱氨酸蛋白酶。木瓜蛋白酶是一條

6、多肽鏈，其在空間折疊形成兩個構(gòu)造域，而在構(gòu)造域間會形成一個內(nèi)含有酶的活性位點(diǎn)的縫隙，催化三聯(lián)體由Cys25-His159-Asn175組成。木瓜蛋白酶的催化機(jī)制其實(shí)就是酰基化和去?；慕M合。即在His159作用下，Cys25去質(zhì)子化，親核性增強(qiáng)，而His159成為帶正電荷的共軛酸。Asn175通過氫鍵幫助His159擺放咪唑環(huán)，使去質(zhì)子化得以發(fā)生，然后Cys25親核攻擊主肽鏈上的羰基碳，并與之共價連接形成?；?酶的中間體，進(jìn)而水分子進(jìn)入活性中心，在一個水分子的作用下，酶發(fā)生去?；?，并釋放肽鏈的羰基末端。5 植物中C1半胱氨酸蛋白酶的分子生物學(xué)研究多種C1家族的基因在pET 28a，pET

7、22a等原核表達(dá)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)，并對重組蛋白的分子量、酶學(xué)特征等進(jìn)展分析。Michael T等在大腸桿菌中異源表達(dá)了來自萌芽的大豆種子中的半胱氨酸蛋白酶前體proEP-B2，重組蛋白的表達(dá)產(chǎn)物多為包涵體，表達(dá)量可到達(dá)50 mg/L，酶原在酸性條件下很快自激活成為成熟酶EP-B2。Sruti Dutta等使用pET28a (+)和 pET 39b(+)載體構(gòu)建了ErvC前體的重組載體，并在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)，重組酶跟天然酶相比，同樣與底物的P2位點(diǎn)特異性結(jié)合，在熱穩(wěn)定性方面也一樣，都可以在溫度到達(dá)70 的時候保持75%以上的活力。半胱氨酸蛋白酶參與植物器官的衰老過程，其中參與

8、衰老細(xì)胞基因上調(diào)表達(dá)的基因SAGS大多屬于C1家族。已有研究發(fā)現(xiàn)大麥中的HvSF、擬南芥中的SAG12，玉米中的See1，多花黑麥草中的See1，油菜中的BnSAG12-2，番茄的Cyp-3和煙草的NT CP-23等基因參與了植物葉的衰老過程。通過構(gòu)建玉米cDNA文庫發(fā)現(xiàn)了有兩個不同的克隆編碼玉米種子半胱氨酸蛋白酶的基因序列，分別命名為CCP1和CCP2各編碼371個和360個氨基酸，CCP2與oryzain和aleurain在構(gòu)造上表現(xiàn)出高度的構(gòu)造上的相似性(同源性分別為87%和89%)。CCP1和CCP2編碼的半胱氨酸蛋白酶在玉米種子的發(fā)芽與成熟過程中都扮演著不同的角色。6 展望因?yàn)橹参飦碓吹拿冈谄桨残陨弦獌?yōu)于微生物來源，所以從植物中提取的酶制劑已被應(yīng)用于工業(yè)消費(fèi)中很長一段時間。C1半胱氨酸蛋白酶因?yàn)槠湓诿笇W(xué)特性上的優(yōu)異表現(xiàn)而受到人們的廣泛關(guān)注。同時，工業(yè)消費(fèi)對酶制劑提出了越來越高的要求，因此通過分子生物學(xué)的方法改變C1半胱氨酸蛋白酶的催化活性、熱穩(wěn)定性及耐酸堿性等就顯得尤為重要。因此，今后的研究重點(diǎn)