兩大實驗：質(zhì)粒DNA 提取,質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和篩選

1、DNA重組技術(shù)重組技術(shù)DNA recombination technology 基本策略目的基因的獲取目的基因的獲取質(zhì)粒的提取制備質(zhì)粒的提取制備重組子（雜化重組子（雜化DNADNA）體外重組（連接）體外重組（連接）轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞篩選陽性轉(zhuǎn)化子篩選陽性轉(zhuǎn)化子獲得子代重組獲得子代重組DNADNA篩選篩選擴增擴增實驗一實驗一 堿裂解法小量提取堿裂解法小量提取質(zhì)質(zhì)粒粒 DNA質(zhì)粒質(zhì)粒 (plasmid)(plasmid)定義定義：是存在于細菌染色體外的雙鏈環(huán)狀：是存在于細菌染色體外的雙鏈環(huán)狀DNA。具有可自主復制、傳給子代、也可丟失及在具有可自主復制、傳給子代、也可丟失及在細菌之間轉(zhuǎn)移等

2、特性，與細菌的遺傳變異有細菌之間轉(zhuǎn)移等特性，與細菌的遺傳變異有關(guān)。關(guān)。作用：作用：攜帶外源基因進入細菌中擴增或表達的攜帶外源基因進入細菌中擴增或表達的主要載體，在基因克隆、表達中具有重要作主要載體，在基因克隆、表達中具有重要作用。用。 在在堿性環(huán)境堿性環(huán)境中，細菌膜破裂釋放內(nèi)容物。染中，細菌膜破裂釋放內(nèi)容物。染色體色體DNA變性分開變性分開，而質(zhì)粒，而質(zhì)粒DNA雖雖變性變性但仍處于但仍處于纏繞狀態(tài)纏繞狀態(tài)。將。將pH調(diào)至中性調(diào)至中性并有并有高鹽高鹽存在及存在及低溫低溫的的條件下，染色體條件下，染色體DNA、大分子量的、大分子量的RNA和蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)在在SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒的作用下形

3、成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍然為仍然為可可溶狀態(tài)溶狀態(tài)。通過離心，可除去大部分細胞碎片、染。通過離心，可除去大部分細胞碎片、染色體色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，最后用酚、氯仿抽提及蛋白質(zhì)，最后用酚、氯仿抽提純化得到純化得到質(zhì)粒質(zhì)粒DNA。堿裂解法提取質(zhì)粒堿裂解法提取質(zhì)粒DNA實驗原理實驗原理 1.細菌的培養(yǎng)細菌的培養(yǎng) 2.細菌的收集和裂解細菌的收集和裂解 3.質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分離和純化的分離和純化 4.質(zhì)粒的鑒定質(zhì)粒的鑒定堿裂解法提取質(zhì)粒DNA主要步驟1. 取單克隆細菌至培養(yǎng)液中，取單克隆細菌至培養(yǎng)液中，37、200 rpm 搖搖床培養(yǎng)過夜。床培養(yǎng)過夜。2. 取取1.5 ml過夜培養(yǎng)菌液放于過夜培養(yǎng)菌

4、液放于EP管中，管中，12 000 r/min離心離心30s，棄去上清液。，棄去上清液。3. 加加100 l 溶液溶液，劇烈震蕩使菌體，劇烈震蕩使菌體懸浮均勻懸浮均勻，室溫放置室溫放置5min。4. 加加200 l 溶液溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用現(xiàn)配現(xiàn)用），輕柔顛倒混勻），輕柔顛倒混勻46次，室溫放置次，室溫放置4min。操作過程5. 加入加入150l預冷的預冷的溶液溶液 ，輕柔顛倒混勻，輕柔顛倒混勻46次次，冰上放置，冰上放置10分鐘。分鐘。6. 12 000 r/m離心離心10 分鐘分鐘(如果上清液仍然渾濁，如果上清液仍然渾濁，可將上清液移出，再次離心可將上清液移出，再次離心5分鐘分鐘）。將上清液。將

5、上清液轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)移至EP管中加管中加等體積等體積Tris飽和飽和酚酚抽提一次，抽提一次，12 000r/min離心離心10分鐘，取上清轉(zhuǎn)移至分鐘，取上清轉(zhuǎn)移至EP管中管中7. 加加等體積等體積氯仿：異戊醇（氯仿：異戊醇（24：1）抽提一次，取）抽提一次，取上清轉(zhuǎn)移至上清轉(zhuǎn)移至EP管中。管中。9.9. 吸出上清液，加吸出上清液，加2.52.5倍體積倍體積的無水乙醇，混勻，的無水乙醇，混勻，室溫放置室溫放置1010分鐘，分鐘，12 000r/min12 000r/min離心離心1010分鐘，沉分鐘，沉淀淀DNADNA。10.10.棄上清棄上清70%70%乙醇洗滌沉淀乙醇洗滌沉淀2 2次，自然揮干。次

6、，自然揮干。11.11.所得所得DNADNA溶于溶于30-50 l30-50 l TETE中，用于后續(xù)試驗。中，用于后續(xù)試驗。若長期不用可置于若長期不用可置于-20-20保存。保存。溶液溶液I： 50 mmol/L葡萄糖葡萄糖 25 mmol/L Tris-Cl pH 8.0 10 mmol/L EDTA pH 8.0溶液溶液II： 0.2 mol/L NaOH 1% SDS (十二烷基硫酸鈉十二烷基硫酸鈉)溶液溶液III：29.4g乙酸鉀乙酸鉀 11.5ml冰乙酸冰乙酸 H2O至至100ml TE溶液溶液：10 mmol/L Tris-Cl, pH 8.0 1 mmol/L EDTA, pH

7、 8.0pGEMpGEM-T Easy Vector Plot-T Easy Vector Plot實驗二實驗二 氯化鈣法進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及篩選氯化鈣法進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及篩選細菌處于細菌處于0 ，在，在CaCl2低滲溶液（低滲溶液（0.1M）中，菌）中，菌體細胞膨脹成球形，體細胞膨脹成球形，DNA則與則與CaCl2形成抗形成抗Dnase的羥基磷酸鈣復合物粘附于細胞表面，的羥基磷酸鈣復合物粘附于細胞表面，經(jīng)經(jīng)42 短時間熱沖擊處理，促進細胞吸收短時間熱沖擊處理，促進細胞吸收DNA復合物，在豐富培養(yǎng)基上生長數(shù)小時后，球狀細復合物，在豐富培養(yǎng)基上生長數(shù)小時后，球狀細胞復原并分裂增殖，重組子的基因在被轉(zhuǎn)化的細

8、胞復原并分裂增殖，重組子的基因在被轉(zhuǎn)化的細菌中得到表達，在選擇性培養(yǎng)基平板上，可選出菌中得到表達，在選擇性培養(yǎng)基平板上，可選出所需的轉(zhuǎn)化子。所需的轉(zhuǎn)化子。一、原理一、原理1. 氯化鈣（二價鈣離子）的作用：提高細胞壁（膜）氯化鈣（二價鈣離子）的作用：提高細胞壁（膜）的通透性；的通透性；2. 熱激后迅速轉(zhuǎn)移到冰上：促使質(zhì)粒熱激后迅速轉(zhuǎn)移到冰上：促使質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移進入轉(zhuǎn)移進入胞內(nèi)；胞內(nèi)；3. 這種轉(zhuǎn)化方法適用于雙鏈環(huán)狀這種轉(zhuǎn)化方法適用于雙鏈環(huán)狀DNA（質(zhì)粒），線（質(zhì)粒），線型型DNA不能采用此法。（在自然界自然發(fā)生的轉(zhuǎn)化不能采用此法。（在自然界自然發(fā)生的轉(zhuǎn)化過程中，進入細菌細胞中的為單鏈過程中，進入

9、細菌細胞中的為單鏈DNA。）。）原理原理二、材料與儀器二、材料與儀器1. 體外重組質(zhì)粒體外重組質(zhì)粒2. CaCl2法制備的感受態(tài)細胞（法制備的感受態(tài)細胞（Competent cells） 3. 水浴鍋水浴鍋4. 培養(yǎng)基培養(yǎng)基LB5. 移液器移液器6. 搖床搖床7. 冰盒（制冰機）冰盒（制冰機）感受態(tài)細胞及特點感受態(tài)細胞及特點 感受態(tài)是指細胞處于最適于攝取和容忍外來感受態(tài)是指細胞處于最適于攝取和容忍外來DNADNA的生理狀態(tài)。感受態(tài)細胞特點為：的生理狀態(tài)。感受態(tài)細胞特點為： 細胞表面暴露出一些可接受外來細胞表面暴露出一些可接受外來DNADNA的位點（以的位點（以溶菌酶處理，可促使受體細胞的接受位

10、點充分溶菌酶處理，可促使受體細胞的接受位點充分暴露）。暴露）。 細胞膜通透性增加（用鈣離子處理，可使膜通細胞膜通透性增加（用鈣離子處理，可使膜通透性增加，使透性增加，使DNADNA直接穿過質(zhì)膜進入細胞）。直接穿過質(zhì)膜進入細胞）。感受態(tài)細胞及特點感受態(tài)細胞及特點 受體細胞的修飾酶活性最高，而限制酶活性最受體細胞的修飾酶活性最高，而限制酶活性最低，使轉(zhuǎn)入的低，使轉(zhuǎn)入的DNA分子不易被切除或破壞。分子不易被切除或破壞。 受體細胞本身處于非生長繁殖階段（即受體細受體細胞本身處于非生長繁殖階段（即受體細胞染色體相對穩(wěn)定）。胞染色體相對穩(wěn)定）。 不存在載體的篩選基因，多采用限制酶陰性、不存在載體的篩選基因

11、，多采用限制酶陰性、修飾酶陽性的大腸桿菌作為受體細胞。修飾酶陽性的大腸桿菌作為受體細胞。三、方法1. 將大腸桿菌將大腸桿菌DH5 在在 LB 平板上劃線，平板上劃線，37 培養(yǎng)培養(yǎng)1620hr（或過夜）（或過夜）2. 從平板上挑取一個從平板上挑取一個23 mm大小的單菌落移至大小的單菌落移至25 ml LB液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基中，37 強烈振蕩過夜強烈振蕩過夜3. 取取1個三角瓶將菌液按個三角瓶將菌液按1100稀釋接種，稀釋接種，37 強強烈振蕩培養(yǎng)烈振蕩培養(yǎng)3 hr，此時細菌，此時細菌OD600= 0.20.4,為對為對數(shù)生長期或?qū)?shù)生長期前期數(shù)生長期或?qū)?shù)生長期前期I 感受態(tài)的制備4.

12、 將培養(yǎng)物置冰上將培養(yǎng)物置冰上10 min 后轉(zhuǎn)移置離心管中后轉(zhuǎn)移置離心管中, 4000 rpm, 4 離心離心 5 min5. 棄上清，加入棄上清，加入10 ml ( 50 ml 原培養(yǎng)物原培養(yǎng)物)冰浴冷的冰浴冷的0.1M CaCl2溶液溶液,致敏懸浮細胞，置于冰上致敏懸浮細胞，置于冰上10 min6. 4000 rpm, 4離心離心 5 min 回收細胞，棄上清，每回收細胞，棄上清，每50ml 原培養(yǎng)物再加入原培養(yǎng)物再加入2 ml 冰冷的冰冷的0.1 M CaCl2溶液，溶液，懸浮細胞懸浮細胞7. 按每份按每份200ul分裝細胞，若不分裝細胞，若不24小時內(nèi)進行轉(zhuǎn)小時內(nèi)進行轉(zhuǎn)化化,可在感受

13、態(tài)細胞中加入終濃度為可在感受態(tài)細胞中加入終濃度為10%的滅的滅菌甘油菌甘油,置于置于-70 冰箱保存。冰箱保存。 不同的轉(zhuǎn)化方法，感受態(tài)的制備也略有不同！不同的轉(zhuǎn)化方法，感受態(tài)的制備也略有不同！重復重復5-6 的操作，以使反應更完全，增加成功率！的操作，以使反應更完全，增加成功率！1.加加10 l 含含40 ng 的的DNA溶液至溶液至200 l 感受態(tài)細感受態(tài)細胞中，溫和混勻，置于冰上胞中，溫和混勻，置于冰上30 min2.42 熱沖擊熱沖擊90s，迅速放回冰上，將細胞冷卻，迅速放回冰上，將細胞冷卻12 min，加入，加入500 l LB（或者（或者SOC）培養(yǎng)基。）培養(yǎng)基。3.將轉(zhuǎn)化后細菌

14、放置將轉(zhuǎn)化后細菌放置37 ，200 rpm 振蕩培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)45 min，讓細菌中的質(zhì)粒表達抗生素抗性蛋白。，讓細菌中的質(zhì)粒表達抗生素抗性蛋白。 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化1.取取200 l 轉(zhuǎn)化混合物鋪于轉(zhuǎn)化混合物鋪于LB+Amp（含有誘導（含有誘導物物 IPTG 及生色底物及生色底物 X-gal）平板上，室溫放置）平板上，室溫放置至液體被瓊脂全部吸收，倒置平板于至液體被瓊脂全部吸收，倒置平板于37培養(yǎng)培養(yǎng)1216 h(過夜過夜)2.取出平板，觀察平板上菌落的顏色和形狀，挑取出平板，觀察平板上菌落的顏色和形狀，挑選白色克隆進行選白色克隆進行PCR和質(zhì)粒酶切驗證。和質(zhì)粒酶切驗證。 涂板篩選白色克隆特點：白色克隆

15、特點：灰白，扁平，濕潤灰白，扁平，濕潤藍白篩選篩選的原理 載體上攜帶一段細菌載體上攜帶一段細菌lacZlacZ基因的基因的肽編碼序肽編碼序列，其編碼產(chǎn)物為列，其編碼產(chǎn)物為-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的肽。當無外肽。當無外源源DNADNA插入時，質(zhì)粒表達插入時，質(zhì)粒表達肽。突變型肽。突變型Lac-Lac-E.coliE.coli 可表達該酶的可表達該酶的肽。單獨存在的肽。單獨存在的及及肽均無肽均無-半乳糖苷酶活性，只有宿主細胞與克隆載體同時半乳糖苷酶活性，只有宿主細胞與克隆載體同時共表達這兩個肽時，宿主細胞內(nèi)才有共表達這兩個肽時，宿主細胞內(nèi)才有-半乳糖苷半乳糖苷酶活性，這種現(xiàn)象稱為酶活性，這種現(xiàn)象稱為互補?；パa。1.1.互補互補 當載體中當載體中-半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（lacZlacZ）的）的-肽編碼肽編碼區(qū)內(nèi)具有多克隆區(qū)域時，如果在重組質(zhì)粒中插入片區(qū)內(nèi)具有多克隆區(qū)域時，如果在重組質(zhì)粒中插入片段使段使-肽失活，肽失活， 則宿主細胞內(nèi)則不表達有功能的則宿主細胞內(nèi)則不表達有功能的-半乳糖苷酶，則得到白色菌落。半乳糖苷酶，則得到白色菌落。 2.2. 在宿主菌內(nèi)，在誘導劑在宿主菌內(nèi)，在誘導劑IPTGIPTG（異丙基硫代（異丙基硫代 D D半乳糖苷）條件下，半乳糖苷）條件下，-半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（-肽加