肝炎的分子診斷與臨床應(yīng)用

1、 肝炎分子診斷項(xiàng)目開展介紹肝炎分子診斷項(xiàng)目開展介紹 -艾迪康市場部目目 錄錄1、了解肝炎分子診斷2、分子診斷在HBV中的臨床應(yīng)用3、分子診斷在HCV中的臨床應(yīng)用4、ADICON已開展的肝炎分子診斷項(xiàng)目 我國乙肝病毒感染率概況我國乙肝病毒感染率概況 2006200620102010年全國乙型病毒性肝炎防治規(guī)劃年全國乙型病毒性肝炎防治規(guī)劃顯示，中國是乙型肝炎病毒感染和發(fā)病人數(shù)最多的國顯示，中國是乙型肝炎病毒感染和發(fā)病人數(shù)最多的國家，全國有家，全國有6.96.9億億人曾感染過乙肝病毒，其中人曾感染過乙肝病毒，其中1.21.2億億人人長期攜帶乙肝病毒。長期攜帶乙肝病毒。目前全國慢性乙肝病人目前全國慢性

2、乙肝病人20002000萬萬人，每年死于與乙人，每年死于與乙肝相關(guān)的肝病患者達(dá)肝相關(guān)的肝病患者達(dá)2828萬萬例，發(fā)病率和死亡率都位居例，發(fā)病率和死亡率都位居前三位。每年造成的直接經(jīng)濟(jì)損失約達(dá)前三位。每年造成的直接經(jīng)濟(jì)損失約達(dá)36003600億億元人民元人民幣。幣。我國乙肝病毒感染率概況我國乙肝病毒感染率概況什么是分子診斷什么是分子診斷 在臨床上應(yīng)用核酸（在臨床上應(yīng)用核酸（DNA/RNA) DNA/RNA) 和分子生物和分子生物學(xué)技術(shù)學(xué)技術(shù), , 在基因水平診斷和監(jiān)控疾病情況在基因水平診斷和監(jiān)控疾病情況和療效，評估疾病的檢測方法。和療效，評估疾病的檢測方法。分子技術(shù)在乙肝診斷與治療中應(yīng)用分子技術(shù)

3、在乙肝診斷與治療中應(yīng)用HBV HBV 分子診斷的分子診斷的臨床應(yīng)用臨床應(yīng)用高靈敏度高靈敏度HBV DNAHBV DNA定量定量HBV 感染監(jiān)測藥物療效檢測感染早期檢測HBV HBV 基因分型基因分型病情預(yù)后發(fā)展檢測抗病毒藥物效果預(yù)測P P區(qū)耐藥檢測區(qū)耐藥檢測抗藥性監(jiān)測治療藥物選擇S S 區(qū)變異區(qū)變異確定隱覓性病毒變異判斷疫苗效果判斷肝炎預(yù)后C C區(qū)啟動子變異區(qū)啟動子變異確定病毒變異類型判斷治療效果確定治療方案高靈敏度乙肝DNA檢測 高精度病毒載量檢測系統(tǒng)（ COBAS AmpliPrep/Cobas TaqMan ）高靈敏度乙肝DNA檢測優(yōu)勢定量PCR技術(shù)檢測患者的血清HBVDNA含量，能更準(zhǔn)

4、確地反映病毒復(fù)制程度，對HBV相關(guān)疾病的診斷、治療、判斷預(yù)后意義重大。QF-PCR是國內(nèi)常用的定量檢測血清HBVDNA水平的方法，COBAS 系統(tǒng)是美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)用于血清HBVDNA定量檢測的方法。它具有靈敏度高，線性范圍廣，實(shí)時監(jiān)控，重復(fù)性好，可檢測A、B、C、D、E、F、G、前C區(qū)變異等多基因型DNA載量優(yōu)點(diǎn)。由于本QF-PCR試劑盒的線性范圍為1.0 x 103 copiesmL1.0 x 108 copiesmL，對于低于1.0 x 103 copiesmL標(biāo)本的檢測結(jié)果不能給出具體拷貝值，有存在漏檢的可能。 而COBAS 系統(tǒng)線性范圍為20-1.7108 IU/

5、mL，因此， COBAS 系統(tǒng)更能準(zhǔn)確反映血清HBV DNA含量。COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0檢測靈敏度20 IU/mL 線性范圍20 1.7 x 108 IU/mL檢測基因型A-H檢測樣本量650 mLSample Type血清或EDTA抗凝血漿SFDA注冊證Q3Cobas高靈敏度高靈敏度乙肝：乙肝：20 IU/mL準(zhǔn)確判斷治療起點(diǎn)準(zhǔn)確判斷治療起點(diǎn)/ /終點(diǎn)終點(diǎn)線性范圍線性范圍乙肝：乙肝：20-1.720-1.710108 8 IU/mLIU/mL極

6、佳的重復(fù)性，結(jié)果可靠極佳的重復(fù)性，結(jié)果可靠正確指導(dǎo)抗病毒治療正確指導(dǎo)抗病毒治療每批試劑均使用每批試劑均使用WHOWHO標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)保證定量結(jié)果的準(zhǔn)確性保證定量結(jié)果的準(zhǔn)確性和可溯源性和可溯源性每個樣本使用同每個樣本使用同源性內(nèi)標(biāo)定量源性內(nèi)標(biāo)定量避免結(jié)果不準(zhǔn)確避免結(jié)果不準(zhǔn)確采用采用AmpEraseAmpErase酶酶減少交叉污染減少交叉污染目前在目前在國內(nèi)唯一國內(nèi)唯一滿足治療指南和專家共識的滿足治療指南和專家共識的HBV HBV DNADNA和和 HCV RNAHCV RNA檢測試劑檢測試劑HBV DNA 監(jiān)測的重要性 口服核苷（酸）類似物療效評估部分病毒學(xué)應(yīng)答部分病毒學(xué)應(yīng)答60 2,00

7、0 IU/mL加其他藥物治療每3個月監(jiān)測HBV DNA開始治療開始治療- - 基于基于 HBV DNAHBV DNA、 ALTALT水平和疾病發(fā)展階段水平和疾病發(fā)展階段治療第治療第1212周評估是否存在原發(fā)性無應(yīng)答周評估是否存在原發(fā)性無應(yīng)答 (較基線下降1 log)治療第治療第2424周評估周評估完全病毒學(xué)應(yīng)答完全病毒學(xué)應(yīng)答 2,000 IU/mL改用或加用更強(qiáng)藥物每6個月監(jiān)測HBV DNA*Keefe, E. Clin Gastro Hepatology. 2007; (5):890-897. 抗病毒治療應(yīng)將HBV DNA降至盡可能低的濃度，理想是低于實(shí)時定量 PCR方法（靈敏度靈敏度10-

8、15 IU/mL10-15 IU/mL）的最低檢出限1 1. EASL HBV Guidelines. J Hepatology. 2009;50:277-242CHB疾病管理:治療目標(biāo)HBsAgHBsAg清除及血清學(xué)轉(zhuǎn)換清除及血清學(xué)轉(zhuǎn)換治療終點(diǎn)治療終點(diǎn)ALTALT正常正常組織學(xué)改善組織學(xué)改善HBV DNAHBV DNA降低降低/ /消失消失HBeAgHBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換血清學(xué)轉(zhuǎn)換HBeAgHBeAg消失消失cccDNA cccDNA 清除清除*Lok, A.S.F et.al. “Chronic Hepatitis B: Update 2009.” HEPATOLOGY, Vol 50, N

9、o. 3, 2009, pgs 8-9 治療終點(diǎn)治療終點(diǎn) 20092009年年EASLEASL指南提出的治療終點(diǎn)：指南提出的治療終點(diǎn)： 最最理想的理想的治療終點(diǎn)：持續(xù)的治療終點(diǎn)：持續(xù)的HBsAg HBsAg 消失，伴消失，伴或不伴抗或不伴抗HBs HBs 抗體出現(xiàn)?？贵w出現(xiàn)。 滿意的滿意的治療終點(diǎn)：在治療終點(diǎn)：在HBe Ag HBe Ag 陽性患者中，出陽性患者中，出現(xiàn)持續(xù)的現(xiàn)持續(xù)的HBeAg HBeAg 血清轉(zhuǎn)換血清轉(zhuǎn)換 次級的滿意次級的滿意治療終點(diǎn)：盡可能降低病毒治療終點(diǎn)：盡可能降低病毒DNADNA水平（降至實(shí)時定量水平（降至實(shí)時定量 PCRPCR檢測限以下：檢測限以下：10-10-15I

10、U/ml15IU/ml）HBVHBV基因分型基因分型根據(jù)根據(jù)HBVHBV全基因核苷酸序列的差異，分為不同全基因核苷酸序列的差異，分為不同基因型基因型: :A.B.C.D.E.F.G.H共8個型 不同的基因型具有不同地域分布不同的基因型具有不同地域分布 我國主要是BC型為主，偶有A型 北方C型HBV基因分型檢測臨床意義特征基因型基因型B B型型C C型型感染性感染性低高HbeAgHbeAg陽性率陽性率低高HbeAgHbeAg自然清除時間自然清除時間短長HBV DNAHBV DNA載量載量低高致病性致病性輕重HCCHCC發(fā)生率發(fā)生率低（低年齡組高）高（高年齡組高）干擾素治療完全應(yīng)答率干擾素治療完全

11、應(yīng)答率高低抗病毒治療效果抗病毒治療效果高低肝癌手術(shù)治療預(yù)后肝癌手術(shù)治療預(yù)后好差癌栓栓塞治療效果癌栓栓塞治療效果好好差HBV變異的基礎(chǔ)變異的基礎(chǔ) 乙肝病毒:高變異性 1/105 24h 一萬億-十萬億拷貝*變異：一千萬一億 復(fù)制過程:DNA-RNA-DNA HBV逆轉(zhuǎn)錄酶:缺乏嚴(yán)格的校正機(jī)制 變異:自然變異,免疫壓力等等原本有效的藥物原本有效的藥物對發(fā)生耐藥變異后的病毒束手無策對發(fā)生耐藥變異后的病毒束手無策變異前，藥物有效抑制病毒變異后，藥物對病毒束手無策乙肝病毒乙肝病毒P P區(qū)耐藥區(qū)耐藥P P區(qū)耐藥位點(diǎn)檢測區(qū)耐藥位點(diǎn)檢測HBVHBV病毒耐藥性檢測病毒耐藥性檢測 長期使用抗病毒藥物可引起HBV耐

12、藥，引起耐藥的基因突變位點(diǎn)主要集中于P區(qū) 原因：抗病毒藥物作用在病毒P區(qū)藥物靶點(diǎn)上，引起相關(guān)基因變異，使得藥物與相關(guān)靶點(diǎn)作用下降，進(jìn)而產(chǎn)生耐藥?？共《局委熀罂共《局委熀驢BV從病毒變異到臨從病毒變異到臨床耐藥床耐藥原發(fā)無應(yīng)答原發(fā)無應(yīng)答病毒學(xué)（部分）病毒學(xué)（部分）應(yīng)答應(yīng)答臨床耐藥抗病毒治療后抗病毒治療后HBV從病毒變異到臨床耐藥從病毒變異到臨床耐藥病 毒 耐 藥 的 臨 床 影 響病 毒 耐 藥 的 臨 床 影 響 耐藥病毒的出現(xiàn)使后續(xù)治療的藥物療效降低耐藥病毒的出現(xiàn)使后續(xù)治療的藥物療效降低 耐藥病毒的出現(xiàn)抵消了之前獲得的臨床益處耐藥病毒的出現(xiàn)抵消了之前獲得的臨床益處病毒反彈病毒反彈, , 血清

13、轉(zhuǎn)氨酶升高血清轉(zhuǎn)氨酶升高, HBeAg, HBeAg血清轉(zhuǎn)換率降低血清轉(zhuǎn)換率降低肝臟病理進(jìn)展肝臟病理進(jìn)展肝硬化病人出現(xiàn)肝功能失代償和死亡肝硬化病人出現(xiàn)肝功能失代償和死亡肝移植后肝炎復(fù)發(fā)率增高肝移植后肝炎復(fù)發(fā)率增高 公共衛(wèi)生危害公共衛(wèi)生危害耐藥病毒株的傳播耐藥病毒株的傳播免疫逃逸免疫逃逸病毒的水平越低，耐藥發(fā)生的幾率越低病毒的水平越低，耐藥發(fā)生的幾率越低初治患者耐藥發(fā)生率初治患者耐藥發(fā)生率拉米夫定拉米夫定, ,阿德福韋阿德福韋, ,恩替卡韋為基因型耐藥發(fā)生率恩替卡韋為基因型耐藥發(fā)生率, ,替比夫定為因耐藥發(fā)生的病毒學(xué)反彈發(fā)生率替比夫定為因耐藥發(fā)生的病毒學(xué)反彈發(fā)生率P區(qū)耐藥位點(diǎn)檢測區(qū)耐藥位點(diǎn)檢測

14、長期使用抗病毒藥物可引起HBV耐藥，引起耐藥的基因突變位點(diǎn)主要集中于P區(qū) 耐藥基因分析在臨床藥物選擇上的應(yīng)用 目前最常見P區(qū)耐藥位點(diǎn)11個（169、173、180、181、184、194、202、204、233、236、250） 拉米夫定 M204I/V L180M V173L 恩曲他濱 V173L L180M M204I/V 阿德福韋 A181V N236T 恩替卡韋 T184A（G/I/S) M250V 特比夫定 M204I/V常用抗病毒藥物的耐藥位點(diǎn)常用抗病毒藥物的耐藥位點(diǎn)常見變異的交叉耐藥性敏感敏感界于中間界于中間耐藥耐藥抗病毒藥物的選擇和使用抗病毒藥物的選擇和使用1.一種藥物產(chǎn)生耐藥

15、時，需要用具有不同耐藥位點(diǎn)藥物代替2.為減少耐藥情況，建議從治療開始就使用具有兩種不同耐藥位點(diǎn)藥物一起治療3.由于抗病毒藥物的耐藥以及治療的長期性，在治療過程中應(yīng)該定期檢查，或是在發(fā)現(xiàn)藥物治療效果不佳時需排除產(chǎn)生耐 藥的可能藥物治療慢性乙肝患者管理路線藥物治療慢性乙肝患者管理路線圖圖檢測檢測檢測檢測耐藥檢測項(xiàng)目 目前檢測的變異位點(diǎn)： P區(qū)耐藥位點(diǎn)11個（169、173、180、181、184、194、202、204、 233、236、250） 專門檢測LAM變異位點(diǎn)：180，181，204，173 專門檢測ADV變異位點(diǎn)：181，233，236艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心P P區(qū)基因變

16、異檢驗(yàn)報(bào)告單區(qū)基因變異檢驗(yàn)報(bào)告單樣張樣張 丙型肝炎病毒丙型肝炎病毒l傳播途徑傳播途徑: :主要血液主要血液/ /體液傳播體液傳播( (似似HBV)HBV)l是引起輸血后慢性肝炎和肝硬化主要原因是引起輸血后慢性肝炎和肝硬化主要原因l無癥狀無癥狀HCVHCV攜帶者和慢性丙肝者多見攜帶者和慢性丙肝者多見l感染感染HCVHCV后，慢性化的比例高達(dá)后，慢性化的比例高達(dá)50%50%以上以上l免疫力不牢固免疫力不牢固黃病毒科黃病毒科 丙型肝炎病毒屬丙型肝炎病毒屬球形有包膜的球形有包膜的RNARNA病毒，直徑病毒，直徑50nm50nm病毒基因?yàn)閱喂烧湶《净驗(yàn)閱喂烧淩NARNA，鏈全，鏈全 長約長約10K

17、b10Kb HCV RNA HCV RNA 檢測檢測 確定引起病毒性肝炎的直接原因 通過病毒數(shù)量變化來監(jiān)測治療效果實(shí)時熒光實(shí)時熒光PCRPCR法：法：檢測三個基因型（檢測三個基因型（1 1型、型、2 2型、型、3 3型）型）PCRPCR產(chǎn)物直接測序法：產(chǎn)物直接測序法：1-61-6型及亞型型及亞型1a,1b,1c,2a,2b,2c,2i,2k,3a,3b,4a,5a,6a,1a,1b,1c,2a,2b,2c,2i,2k,3a,3b,4a,5a,6a,6b,6k6b,6kHCVHCV基因分型基因分型專用申請單專用申請單病程，病史病程，病史目前用藥情況，服目前用藥情況，服藥時間藥時間 肝 炎肝 炎

18、分 子 診 斷 綜 合 檢 查 申 請 單分 子 診 斷 綜 合 檢 查 申 請 單 姓名 必填 性別（必填） 男 / 女 年齡 必填 門診號 科別 住院號 病房 床號 送檢醫(yī)院 送檢醫(yī)生 必填 醫(yī)生聯(lián)系電話 必填 采集時間（必填） 年 月 日 時 送檢時間（必填） 年 月 日 時 臨床印象：臨床印象： 乙肝 丙肝 混合性肝炎 肝硬化 肝癌 肝纖維化 現(xiàn)病史現(xiàn)病史（臨床表現(xiàn)以及病程） 抗病毒藥物使用情況： 拉米夫定(賀普丁)_ 年 月至_ 年 月 阿德福韋(賀維力)_ 年 月至_ 年 月 恩替卡韋_ 年 月至_ 年 月 替比夫定_ 年 月至_ 年 月 替諾福韋_年 月至_ 年 月 干擾素_ 年 月至_ 年 月 恩曲他濱_年 月至_ 年 月 檢測項(xiàng)目（注意：請?jiān)谝獧z測的項(xiàng)目前打“檢測項(xiàng)目（注意：請?jiān)谝獧z測的項(xiàng)目前打“”確認(rèn)”確認(rèn) ） 核苷類似藥藥物敏感性核苷類似藥藥物敏感性 HBV P 區(qū)耐藥檢測 拉米夫定耐藥檢測 阿德福韋酯耐藥檢測 e e 抗原陰性抗原陰性 HBV 前 C 區(qū)和 C 區(qū)變異檢測 HBV 前 C 區(qū) 1896 位點(diǎn)檢測(熒光定量 PCR 法) HBV