硫酸銨純化抗體

1、.1.兔抗人IgG抗體的初步純化 ( 硫酸銨沉淀法） 一、 基本原理 硫酸銨沉淀法可用于從大量粗制劑中濃縮和部分純化蛋白質。用此方法可以將主要的免疫球從樣品中分離，是免疫球蛋白分離的常用方法。高濃度的鹽離子在蛋白質溶液中可與蛋白質競爭水分子，從而破壞蛋白質表面的水化膜，降低其溶解度，使之從溶液中沉淀出來。各種蛋白質的溶解度不同，因而可利用不同濃度的鹽溶液來沉淀不同的蛋白質。這種方法稱之為鹽析。鹽濃度通常用飽和度來表示。硫酸銨因其溶解度大，溫度系數(shù)小和不易使蛋白質變性而應用最廣。二、 試劑及儀器 1 . 組織培養(yǎng)上清液、血清樣品或腹水等 2. 硫酸銨(NH4)2SO4 3. 飽和硫酸銨溶液4.

2、蒸餾水 5. PBS( 含 0.2g /L 疊氮鈉 ) 6. 透析袋 7. 超速離心機 8. pH 計 9. 磁力攪拌器 三， 操作步驟 以腹水或組織培養(yǎng)上清液為例來介紹抗體的硫酸銨沉淀。各種不同的免疫球蛋白鹽析所需硫酸銨的飽和度也不完全相同。通常用來分離抗體的硫酸銨飽和度為 33% 50% 。 （一）配制飽和硫酸銨溶液 1.將 767g (NH4)2SO4 邊攪拌邊慢慢加到 1 升 蒸餾水中。用氨水或硫酸調到硫酸pH7.0 。此即飽和度為 100% 的硫酸銨溶液(SAS)（ 4.1 mol/L, 25 ° C ）.（二）沉淀 1.樣品（如腹水） 20 000 g 離心 30 min

3、 ，除去細胞碎片； 2.保留上清液并測量體積； 3.邊攪拌邊慢慢加入等體積的 SAS 到上清液中，終濃度為 1 ： 1 。4.將溶液放在磁力攪拌器上攪拌 6 小時或攪拌過夜（ 4 ° C ），使蛋白質充分沉淀。 （三）透析 1.蛋白質溶液 10 000 g 離心 30 min （ 4 ° C ）。棄上清保留沉淀； 2.將沉淀溶于少量（ 10-20ml ） PBS -0.2g /L 疊氮鈉中。沉淀溶解后放入透析袋對 PBS -0.2g /L 疊氮鈉透析 24-48 小時（ 4 ° C ），每隔 3-6 小時換透析緩沖液一次，以徹底除去硫酸氨； 3.透析液離心，測定上

4、清液中蛋白質含量。 四，應用提示 （一） 先用較低濃度的硫酸氨預沉淀，除去樣品中的雜蛋白。 1.邊攪拌邊慢慢加 SAS 到樣品溶液中，使?jié)舛葹?0.5:1 (v/v) ； 2.將溶液放在磁力攪拌器上攪拌 6 小時 或過夜（ 4 ° C ）；3.3000 g 離心 30 min （ 4 ° C ），保留上清液；上清液再加 SAS 到 0.5:1(v/v) ，再次離心得到沉淀。將沉淀溶于 PBS ，同前透析，除去硫酸氨； 4.上清液再加 SAS 到 0.5:1 (v/v) ，再次離心得到沉淀。將沉淀溶于 PBS ，同前透析，除去硫酸氨； 5.雜蛋白與欲純化蛋白在硫酸氨溶液中溶解

5、度差別很大時，用預沉淀除雜蛋白是非常有效 （二） 為避免體積過大，可用固體硫酸氨進行鹽析；硫酸氨沉淀法與層析技術結合使用，可得到更進一步純化的抗體。純化產物 的鑒定： （1）效價測定 : 采 用間接ELISA法 (3 mg / L抗原包被 , 1 1 000 開始倍比稀釋)檢測抗體的效價 。 （2）Ig亞類 ( 型 ) 的鑒定 : 用小鼠 Ig亞類檢測試劑盒鑒定雜交瘤細胞培養(yǎng)上 清中 mA b 的 類和亞類 。（3）westernblot 鑒定抗體特 異性 : 取 5 g 人 IgG 經(jīng) SDS-PAGE后 , 轉移至硝酸纖維素膜上 , 用 5 0 g/L 脫脂奶粉室溫封閉1 h。依次滴加封閉液稀釋的 5 mg/L純化 抗體 (室溫孵育2 h或 4過夜 ,洗膜3次)及11 000 稀釋的 HRP 標記的羊抗鼠 Ig G(室溫孵育1 h, 洗膜 3次)。最后加 DAB顯色 ,觀察結果 。（4） 相對親和力測定 : 以 IgG與抗體結合曲線上部趨于平坦的一段(平臺期)的吸光度值(A)為100%, 查出 A值為 50%點的抗體的濃度,以此來表示各株的相對親和力 。1.為什么需要用透析袋透析？用透析袋透析以徹底除去硫酸氨；2.純度如何簡單鑒定？用BSA試劑盒測定抗體濃度，也可以用考馬斯法、紫外法、雙縮脲法等測定。3.為什么要進行活性鑒定？進行活性測定可以判定抗體效價，初步確定抗體的稀