環(huán)境毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)

1、海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院 蘇增建環(huán)境毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)授課教師：蘇增建試驗(yàn)地點(diǎn)：環(huán)境毒理實(shí)驗(yàn)室適用專業(yè)：環(huán)境科學(xué)相關(guān)專業(yè)海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院 蘇增建實(shí)驗(yàn)一 蚯蚓急性毒性實(shí)驗(yàn)一、目的與要求一、目的與要求（1 1）學(xué)習(xí)和掌握濾紙接觸毒性實(shí)驗(yàn)和人）學(xué)習(xí)和掌握濾紙接觸毒性實(shí)驗(yàn)和人工土壤實(shí)驗(yàn)的基本原理和方法。工土壤實(shí)驗(yàn)的基本原理和方法。（2 2）初步了解評(píng)價(jià)環(huán)境中化學(xué)物質(zhì)對(duì)土）初步了解評(píng)價(jià)環(huán)境中化學(xué)物質(zhì)對(duì)土壤中動(dòng)物急生傷害的標(biāo)準(zhǔn)和基本步驟。壤中動(dòng)物急生傷害的標(biāo)準(zhǔn)和基本步驟。海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院 蘇增建二、原理二、原理濾紙接觸法毒性實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單易行，可對(duì)受濾紙接觸法毒性實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單易行，可對(duì)受試物毒性進(jìn)行初

2、篩。將蚯蚓與濕潤(rùn)的濾紙上試物毒性進(jìn)行初篩。將蚯蚓與濕潤(rùn)的濾紙上的受試物接觸，測(cè)定土壤中受試物對(duì)蚯蚓的的受試物接觸，測(cè)定土壤中受試物對(duì)蚯蚓的潛在影響。潛在影響。人工土壤實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)將蚯蚓置于含不同濃人工土壤實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)將蚯蚓置于含不同濃度受試物的人工土壤中，飼養(yǎng)度受試物的人工土壤中，飼養(yǎng)7d7d和和14d14d，評(píng)價(jià)評(píng)價(jià)其死亡率，評(píng)價(jià)受試物對(duì)蚯蚓的急性毒性作其死亡率，評(píng)價(jià)受試物對(duì)蚯蚓的急性毒性作用。用。實(shí)驗(yàn)一 蚯蚓急性毒性實(shí)驗(yàn)海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院 蘇增建實(shí)驗(yàn)一 蚯蚓急性毒性實(shí)驗(yàn)三、設(shè)備與材料三、設(shè)備與材料1 1、主要儀器和設(shè)備主要儀器和設(shè)備玻璃容器：平底玻璃管（玻璃容器：平底玻璃管（3cm3cm8

3、cm8cm）培養(yǎng)裝置：光強(qiáng)培養(yǎng)裝置：光強(qiáng)400-800 400-800 lx的溫控培養(yǎng)箱的溫控培養(yǎng)箱中性濾紙：中性濾紙：80-85g/m2移液器、塑料薄膜、烘箱、電吹風(fēng)移液器、塑料薄膜、烘箱、電吹風(fēng)海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院 蘇增建實(shí)驗(yàn)一 蚯蚓急性毒性實(shí)驗(yàn)2 2、試驗(yàn)生物試驗(yàn)生物選用二月齡以上，體重選用二月齡以上，體重300-500mg300-500mg左右的左右的健康赤子愛勝蚓。健康赤子愛勝蚓。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)在實(shí)驗(yàn)室條件下馴養(yǎng)實(shí)驗(yàn)前應(yīng)在實(shí)驗(yàn)室條件下馴養(yǎng)2 2周以上。周以上。海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院 蘇增建實(shí)驗(yàn)一 蚯蚓急性毒性實(shí)驗(yàn)3 3、人工土壤人工土壤人工土壤基質(zhì)組成（干重）：人工土壤基質(zhì)組成（

4、干重）：（1 1）10%10%干牛糞（干牛糞（PHPH為為5.5-6.05.5-6.0，磨細(xì)，磨細(xì)，風(fēng)干，測(cè)定含水量）；風(fēng)干，測(cè)定含水量）；（2 2）20%20%高嶺黏土（含高嶺黏土（含50%50%以上高嶺土）；以上高嶺土）；（3 3）70%70%石英沙（石英沙（0.05-0.2mm0.05-0.2mm粒徑的石顆粒徑的石顆粒粒50%50%以上）；以上）；（4 4）混合人工土壤的組成成分，加入蒸）混合人工土壤的組成成分，加入蒸餾水使其含水量為干重的餾水使其含水量為干重的25%-42%25%-42%，混合均勻?；旌暇鶆?。海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院 蘇增建實(shí)驗(yàn)一 蚯蚓急性毒性實(shí)驗(yàn)四、方法和步驟四、方

5、法和步驟1 1、清腸清腸用蒸餾水清洗蚯蚓，然后置于鋪有濾紙用蒸餾水清洗蚯蚓，然后置于鋪有濾紙的磁盤上清腸的磁盤上清腸24h24h，用去離子水沖洗后，濾紙用去離子水沖洗后，濾紙吸干稱重，供試。吸干稱重，供試。注：清腸過程用薄膜包緊磁盤，防止蚯注：清腸過程用薄膜包緊磁盤，防止蚯蚓爬出磁盤死亡。蚓爬出磁盤死亡。海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院 蘇增建實(shí)驗(yàn)一 蚯蚓急性毒性實(shí)驗(yàn)2 2、濾紙實(shí)驗(yàn)濾紙實(shí)驗(yàn)在平底試管內(nèi)壁襯濾紙，鋪滿不重疊；在平底試管內(nèi)壁襯濾紙，鋪滿不重疊；設(shè)設(shè)5 5個(gè)濃度梯度（見附表）及對(duì)照共個(gè)濃度梯度（見附表）及對(duì)照共6 6組組試管，每組試管，每組1010個(gè)重復(fù)，每個(gè)試管內(nèi)首先移個(gè)重復(fù)，每個(gè)試管

6、內(nèi)首先移取取1ml1ml對(duì)應(yīng)濃度的受試物溶液，用潔凈空氣吹對(duì)應(yīng)濃度的受試物溶液，用潔凈空氣吹干，然后每個(gè)試管加入干，然后每個(gè)試管加入1ml1ml去離子水，然后加去離子水，然后加入入1 1條蚯蚓，用薄膜封口，在黑暗、條蚯蚓，用薄膜封口，在黑暗、202022環(huán)境培養(yǎng)環(huán)境培養(yǎng)48h48h，每每24h24h觀察一次，記錄死亡情觀察一次，記錄死亡情況，同時(shí)還有蚯蚓的病理癥狀和行為。況，同時(shí)還有蚯蚓的病理癥狀和行為。海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院 蘇增建實(shí)驗(yàn)一 蚯蚓急性毒性實(shí)驗(yàn)選擇濃度范圍的預(yù)試驗(yàn)選擇濃度范圍的預(yù)試驗(yàn)受試物在濾紙的沉積量受試物在濾紙的沉積量（mg/cmmg/cm2 2）受試物濃度受試物濃度（g

7、/mlg/ml）1.0710-20.1710-30.01710-40.001710-50.0001710-6注：受試物溶于水（1000mg/l）或丙酮等助溶劑，配成系列濃度海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院 蘇增建實(shí)驗(yàn)一 蚯蚓急性毒性實(shí)驗(yàn)3 3、人工土壤試驗(yàn)人工土壤試驗(yàn)正式試驗(yàn)前，需進(jìn)行濃度范圍選擇實(shí)驗(yàn)。正式試驗(yàn)前，需進(jìn)行濃度范圍選擇實(shí)驗(yàn)。最終設(shè)定至少最終設(shè)定至少5 5個(gè)濃度梯度級(jí)及空白組，濃度個(gè)濃度梯度級(jí)及空白組，濃度范圍應(yīng)包括最大耐受濃度和致死濃度兩組濃范圍應(yīng)包括最大耐受濃度和致死濃度兩組濃度，每組至少有度，每組至少有4 4個(gè)平行樣。個(gè)平行樣。受試蚯蚓需在人工土壤中先馴養(yǎng)受試蚯蚓需在人工土壤中先馴

8、養(yǎng)24h24h，實(shí)實(shí)驗(yàn)前沖洗干凈。驗(yàn)前沖洗干凈。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行14d14d，每每7d7d觀察蚯蚓的病理癥狀觀察蚯蚓的病理癥狀及行為、死亡。測(cè)定介質(zhì)中的含水量。及行為、死亡。測(cè)定介質(zhì)中的含水量。海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院 蘇增建實(shí)驗(yàn)一 蚯蚓急性毒性實(shí)驗(yàn)4 4、質(zhì)量控制質(zhì)量控制可在實(shí)驗(yàn)中加入陽性對(duì)照組（氯乙?？稍趯?shí)驗(yàn)中加入陽性對(duì)照組（氯乙酰胺），空白組用去離子水代替受試物，實(shí)驗(yàn)胺），空白組用去離子水代替受試物，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后空白對(duì)照組死亡率應(yīng)不超過結(jié)束后空白對(duì)照組死亡率應(yīng)不超過10%10%。海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院 蘇增建實(shí)驗(yàn)一 蚯蚓急性毒性實(shí)驗(yàn)五、結(jié)果及實(shí)驗(yàn)報(bào)告五、結(jié)果及實(shí)驗(yàn)報(bào)告記錄不同受試物濃

9、度對(duì)應(yīng)的死亡情況，記錄不同受試物濃度對(duì)應(yīng)的死亡情況，實(shí)驗(yàn)報(bào)告就包括以下內(nèi)容：實(shí)驗(yàn)報(bào)告就包括以下內(nèi)容：受試物的基本物化性質(zhì)；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼受試物的基本物化性質(zhì)；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)條件等；試驗(yàn)條件包括溫度、濕度、光照養(yǎng)條件等；試驗(yàn)條件包括溫度、濕度、光照條件、實(shí)驗(yàn)介質(zhì)的成分級(jí)成和制備條件；實(shí)條件、實(shí)驗(yàn)介質(zhì)的成分級(jí)成和制備條件；實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告。驗(yàn)結(jié)果報(bào)告。海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院 蘇增建實(shí)驗(yàn)一 蚯蚓急性毒性實(shí)驗(yàn)六、注意事項(xiàng)六、注意事項(xiàng)1 1、牛糞與其他人工土壤成分混合前應(yīng)充牛糞與其他人工土壤成分混合前應(yīng)充分磨細(xì)風(fēng)干、烘干，測(cè)定含水量；分磨細(xì)風(fēng)干、烘干，測(cè)定含水量；2 2、蚯蚓馴養(yǎng)條件：溫度蚯蚓馴養(yǎng)條件：溫

10、度18-22 18-22 ，持續(xù)持續(xù)光照（強(qiáng)度光照（強(qiáng)度400-800 400-800 lx ），保證濕度；），保證濕度；海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院 蘇增建實(shí)驗(yàn)一 蚯蚓急性毒性實(shí)驗(yàn)3 3、實(shí)驗(yàn)中管口或瓶口必須用薄膜封緊并實(shí)驗(yàn)中管口或瓶口必須用薄膜封緊并保證通氣，防止蚯蚓鉆出；保證通氣，防止蚯蚓鉆出；4 4、根據(jù)根據(jù)LC50LC50值可將農(nóng)藥對(duì)蚯蚓的毒性劃值可將農(nóng)藥對(duì)蚯蚓的毒性劃分三個(gè)等級(jí)：分三個(gè)等級(jí)：1ppm10ppm10ppm的為低毒農(nóng)藥的為低毒農(nóng)藥海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院 蘇增建實(shí)驗(yàn)二 有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶活性的抑制一、目的與要求一、目的與要求1 1、了解有機(jī)磷殺蟲劑共同的特性，即對(duì)了解

11、有機(jī)磷殺蟲劑共同的特性，即對(duì)昆蟲或高等動(dòng)物體內(nèi)膽堿酯酶的活性能起抑昆蟲或高等動(dòng)物體內(nèi)膽堿酯酶的活性能起抑制作用，而引起動(dòng)物中毒死亡。制作用，而引起動(dòng)物中毒死亡。2 2、利用這一原理測(cè)定各種有機(jī)磷殺蟲劑利用這一原理測(cè)定各種有機(jī)磷殺蟲劑在動(dòng)、植物體內(nèi)的殘留毒性，為安全使用農(nóng)在動(dòng)、植物體內(nèi)的殘留毒性，為安全使用農(nóng)藥提供依據(jù)。藥提供依據(jù)。海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院 蘇增建實(shí)驗(yàn)二 有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶的抑制實(shí)驗(yàn)二、原理二、原理當(dāng)高等動(dòng)物或昆蟲被有機(jī)磷殺蟲劑作用當(dāng)高等動(dòng)物或昆蟲被有機(jī)磷殺蟲劑作用之后，體內(nèi)膽堿酯酶就受抑制，不能繼續(xù)起之后，體內(nèi)膽堿酯酶就受抑制，不能繼續(xù)起水解作用，因此，它們體內(nèi)的乙酰膽堿大

12、量水解作用，因此，它們體內(nèi)的乙酰膽堿大量積累，而導(dǎo)致中毒死亡積累，而導(dǎo)致中毒死亡海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院 蘇增建實(shí)驗(yàn)二 有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶的抑制實(shí)驗(yàn)三、設(shè)備與材料三、設(shè)備與材料1 1、設(shè)備：可見光分光光度計(jì)；試管設(shè)備：可見光分光光度計(jì)；試管1313支，支，移液器；振蕩水浴鍋，燒杯，研缽。移液器；振蕩水浴鍋，燒杯，研缽。2 2、試劑：試劑：（1 1）0.004M0.004M溴化或氯化乙酰膽堿；（溴化或氯化乙酰膽堿；（2 2）2M2M鹽酸羥胺溶液；（鹽酸羥胺溶液；（3 3）3.5N 3.5N NaOHNaOH；（4 4）4N4N鹽酸溶液；（鹽酸溶液；（5 5）0.37M0.37M三氯化鐵溶液。

13、三氯化鐵溶液。海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院 蘇增建實(shí)驗(yàn)二 有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶的抑制實(shí)驗(yàn)四、步驟與方法四、步驟與方法1 1、將臺(tái)面的大試管進(jìn)行編號(hào)將臺(tái)面的大試管進(jìn)行編號(hào)1-91-9（其中（其中6 6號(hào)管為空白管，號(hào)管為空白管，9 9號(hào)管為對(duì)照管），另有一支號(hào)管為對(duì)照管），另有一支2ml2ml有蓋管；有蓋管；2.2.2 2、每一排所有組將芽蟲放在一起，加入每一排所有組將芽蟲放在一起，加入5 5倍左右的冷凍蒸餾水，進(jìn)行研磨，然后將漿倍左右的冷凍蒸餾水，進(jìn)行研磨，然后將漿液全部倒入離心管中，在液全部倒入離心管中，在2500rpm2500rpm離心離心15min15min，取離心管中上清液作為正常蟲漿，

14、共用；取離心管中上清液作為正常蟲漿，共用；海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院 蘇增建實(shí)驗(yàn)二 有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶的抑制實(shí)驗(yàn)3 3、各小組向各小組向2ml2ml管加入管加入0.5ml0.5ml正常蟲漿，然正常蟲漿，然后由老師幫忙加入后由老師幫忙加入20l0.1%20l0.1%敵百蟲液，放置敵百蟲液，放置1515分鐘；分鐘；4 4、向向1-61-6號(hào)管分別添加號(hào)管分別添加0.20.2、0.40.4、0.60.6、0.80.8、1.01.0、1.0ml1.0ml試劑（試劑（1 1），再分別加入），再分別加入1.31.3、1.11.1、0.90.9、0.70.7、0.50.5、0.50.5磷酸鹽緩沖液，搖勻；

15、向磷酸鹽緩沖液，搖勻；向7 7號(hào)管中分別加入號(hào)管中分別加入0.5ml0.5ml無處理的正常蟲漿，向無處理的正常蟲漿，向8 8號(hào)管中加入號(hào)管中加入0.5ml0.5ml敵百蟲處理過的蟲漿，然后分?jǐn)嘲傧x處理過的蟲漿，然后分別向別向7-97-9號(hào)管加入號(hào)管加入1ml1ml試劑（試劑（1 1），搖勻；），搖勻；海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院 蘇增建實(shí)驗(yàn)二 有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶的抑制實(shí)驗(yàn)5 5、將將6-96-9號(hào)管放入號(hào)管放入3737振蕩水浴鍋中，振蕩水浴鍋中，40min40min后取出；后取出；6 6、向向6 6號(hào)管中加入號(hào)管中加入1ml1ml試劑（試劑（4 4），搖勻），搖勻后；后；7 7、分別向分別向1

16、-91-9號(hào)管中加入號(hào)管中加入2ml2ml試劑（試劑（2 2）與試劑（與試劑（3 3）的混合液（）的混合液（1 1：1 1臨時(shí)配用），大臨時(shí)配用），大力搖動(dòng)力搖動(dòng)1min1min以上；以上；海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院 蘇增建實(shí)驗(yàn)二 有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶的抑制實(shí)驗(yàn)8 8、向向9 9號(hào)管中加入號(hào)管中加入0.5ml0.5ml正常蟲漿；正常蟲漿；9 9、除除6 6號(hào)管外，分別向各管（號(hào)管外，分別向各管（1-51-5號(hào)、號(hào)、7-7-9 9號(hào)）加入號(hào)）加入1ml1ml試劑（試劑（4 4），搖勻；），搖勻；1010、向向1-91-9號(hào)管加入號(hào)管加入1ml1ml試劑（試劑（5 5），各管），各管即呈現(xiàn)深淺不同的紅棕色，用可見光光度計(jì)即呈現(xiàn)深淺不同的紅棕色，用可見光光度計(jì)（540nm540nm進(jìn)行測(cè)定）。進(jìn)行測(cè)定）。海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院 蘇增建實(shí)驗(yàn)二 有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶的抑制實(shí)驗(yàn)五、結(jié)果與報(bào)告五、結(jié)果與報(bào)告要求作出乙酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)這條要求作出乙酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)這條標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣本所含的乙酰膽堿量，從而標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣本所含的乙酰膽堿量，從而計(jì)算出