第三章 原核生物的基因表達調控

1、原核生物的基因表達調控原核生物的基因表達調控一、原核生物基因表達調控概述 基因表達(gene expression) 是指儲存遺傳信息的基因經(jīng)過一系列步驟表現(xiàn)出其生物功能的整個過程。典型的基因表達是基因經(jīng)過轉錄、翻譯，產生有生物活性的蛋白質的過程。 既然從DNA到蛋白質的過程稱為基因表達，對這個過程的調節(jié)就稱為基因表達調控（gene regulation或gene control）?；虮磉_調控是現(xiàn)階段分子生物學研究的中心課題。（一）基因表達調控的意義 基因組(genome) 是指含有一個生物體生存、發(fā)育、活動和繁殖所需要的全部遺傳信息的整套核酸。 但生物基因組的遺傳信息并不是同時全部都表達出

2、來的，大腸桿菌基因組含有約4000個基因，一般情況下只有510%在高水平轉錄狀態(tài)，其它基因有的處于較低水平的表達，有的就暫時不表達。 不同組織細胞中不僅表達的基因數(shù)量不相同，而且基因表達的強度和種類也各不相同，這就是基因表達的組織特異性(tissue specificity)。 例如肝細胞中涉及編碼鳥氨酸循環(huán)酶類的基因表達水平高于其它組織細胞，合成的某些酶(如精氨酸酶)為肝臟所特有；胰島細胞合成胰島素；甲狀腺濾泡旁細胞(C細胞)專一分泌降血鈣素等。 細胞分化發(fā)育的不同時期，基因表達的情況是不相同的，這就是基因表達的階段特異性(stagespecificity)。 一個受精卵含有發(fā)育成一個成熟個

3、體的全部遺傳信息，在個體發(fā)育分化的各個階段，各種基因極為有序地表達，一般在胚胎時期基因開放的數(shù)量最多，隨著分化發(fā)展，細胞中某些基因關閉(turn off)、某些基因轉向開放(turn on)，胚胎發(fā)育不同階段、不同部位的細胞中開放的基因及其開放的程度不一樣，合成蛋白質的種類和數(shù)量都不相同，顯示出基因表達調控在空間和時間上極高的有序性，從而逐步生成形態(tài)與功能各不相同、極為協(xié)調、巧妙有序的組織臟器。從上所述，不難看出：生物的基因表達不是雜亂無章的，而是受著嚴密、精確調控的，不僅生命的遺傳信息是生物生存所必需的，而且遺傳信息的表達調控也是生命本質所在。 改變基因表達的情況以適應環(huán)境，在原核生物、單細

4、胞生物中尤其顯得突出和重要，因為細胞的生存環(huán)境經(jīng)常會有劇烈的變化。 例如：周圍有充足的葡萄糖，細菌就可以利用葡萄糖作能源和碳源，不必更多去合成利用其它糖類的酶類，當外界沒有葡萄糖時，細菌就要適應環(huán)境中存在的其它糖類(如乳糖、半乳糖、阿拉伯糖等)，開放能利用這些糖的酶類基因，以滿足生長的需要。 即使是內環(huán)境保持穩(wěn)定的高等哺乳類，也經(jīng)常要變動基因的表達來適應環(huán)境，例如與適宜溫度下生活相比較，在冷或熱環(huán)境下適應生活的動物，其肝臟合成的蛋白質圖譜就有明顯的不同。所以，基因表達調控是生物適應環(huán)境生存的必需。（二）基因表達的模式 生物體內的基因調控各不相同，基因表達隨環(huán)境變化的情況，可以大致把基因表達分成

5、兩類： 組成性表達(constitutive expression)指不大受環(huán)境變動而變化的一類基因表達。其中某些基因表達產物是細胞或生物體整個生命過程中都持續(xù)需要而必不可少的，這類基因可稱為看家基因(housekeeping gene)，這些基因中不少是在生物個體其它組織細胞、甚至在同一物種的細胞中都是持續(xù)表達的，可以看成是細胞基本的基因表達。組成性基因表達也不是一成不變的，其表達強弱也是受一定機制調控的。 適應性表達(adaptive expression)指環(huán)境的變化容易使其表達水平變動的一類基因表達。 應環(huán)境條件變化基因表達水平增高的現(xiàn)象稱為誘導(induction)，這類基因被稱為可

6、誘導的基因(inducible gene)； 相反，隨環(huán)境條件變化而基因表達水平降低的現(xiàn)象稱為阻遏(repression)，相應的基因被稱為可阻遏的基因(repressible gene)。 （三） 原核基因表達調控的特點與方式基因表達調控主要表現(xiàn)在以下兩方面：基因表達調控主要表現(xiàn)在以下兩方面：1轉錄水平上的調控（轉錄水平上的調控（transcriptional regulation）；）；2轉錄后水平上的調控（轉錄后水平上的調控（post-transcriptional regulation），包括），包括mRNA加工成熟水平上的調控加工成熟水平上的調控（differential proce

7、ssing of RNA transcript）；）；翻譯水平上的調控翻譯水平上的調控（differential translation of mRNA）。）。 原核生物原核生物中，中，營養(yǎng)狀況營養(yǎng)狀況（nutritionalstatus）和和環(huán)境因素環(huán)境因素（environmentalfactor）對基因）對基因表達起著舉足輕重的影響。表達起著舉足輕重的影響。 真核生物真核生物尤其是高等真核生物中，尤其是高等真核生物中，激素水平激素水平（ h o r m o n e l e v e l ） 和） 和 發(fā) 育 階 段發(fā) 育 階 段（developmentalstage）是基因表達調控的是基因表

8、達調控的最主要手段，營養(yǎng)和環(huán)境因素的影響力大為下最主要手段，營養(yǎng)和環(huán)境因素的影響力大為下降。降。 在轉錄水平上對基因表達的調控決定于在轉錄水平上對基因表達的調控決定于DNA的的結構結構、RNA聚合酶的功能聚合酶的功能、蛋白因子及其他小蛋白因子及其他小分子配基分子配基的相互作用。的相互作用。 因為細菌因為細菌mRNA在形成過程中與核糖體混合在一在形成過程中與核糖體混合在一起，所以，細菌的轉錄與翻譯過程幾乎發(fā)生在同一時起，所以，細菌的轉錄與翻譯過程幾乎發(fā)生在同一時間間隔內，轉錄與翻譯相耦聯(lián)（間間隔內，轉錄與翻譯相耦聯(lián)（coupled transcription and translation）。）

9、。 真核生物中，轉錄產物（真核生物中，轉錄產物（primary transcript）只有從核內運轉到核外，才能被核糖體翻譯成蛋白質。只有從核內運轉到核外，才能被核糖體翻譯成蛋白質。二、 操縱子學說操縱子學說 法國巴斯德研究院的法國巴斯德研究院的FrancoisJacob與與JacquesMonod于于1960年在法國科學院院報年在法國科學院院報(ProceedingoftheFrenchAcademyofSciences)上發(fā)表了一篇論文，提出乳糖代謝中的上發(fā)表了一篇論文，提出乳糖代謝中的兩個基因被一靠近它們的遺傳因子所調節(jié)。這二個基因為兩個基因被一靠近它們的遺傳因子所調節(jié)。這二個基因為-半

10、半乳糖苷酶乳糖苷酶(-galactosidase)和半乳糖苷透過酶和半乳糖苷透過酶(galactosidepermease)。在此文中他們首先提出了在此文中他們首先提出了操縱子操縱子(operon)和操縱基因和操縱基因(operator)的概念的概念，他們的操縱子學說，他們的操縱子學說(theoryofoperon)使我使我們得以從分子水平認識基因表達的調控，是一個劃時代的突破，們得以從分子水平認識基因表達的調控，是一個劃時代的突破，因此他們二人于因此他們二人于1965年榮獲諾貝爾生理學獎。年榮獲諾貝爾生理學獎。（一）操縱子(operon) 細菌能隨環(huán)境的變化，迅速改變某些基因表達的狀態(tài)，這就

11、是很好的基因表達調控的實驗模型。人們就是從研究這種現(xiàn)象開始，打開認識基因表達調控分子機理的窗口的。1.操縱子的提出 大腸桿菌可以利用葡萄糖、乳糖、麥芽糖、阿拉伯糖等作為碳源而生長繁殖，當培養(yǎng)基中含有葡萄糖和乳糖時，細菌優(yōu)先利用葡萄糖，當葡萄糖耗盡，細菌停止生長，經(jīng)過短時間的適應，就能利用乳糖，細菌繼續(xù)呈指數(shù)式繁殖增長。 大腸桿菌利用乳糖至少需要兩個酶：促使乳糖進入細菌的半乳糖透過酶(lactose permease)和催化乳糖分解第一步的 半乳糖苷酶( -galactosidase)。 在環(huán)境中沒有乳糖或其他 -半乳糖苷時，大腸桿菌合成 -半乳糖苷酶量極少，加入乳糖2-3分鐘后，細菌大量合成

12、-半乳糖苷酶，其量可提高千倍以上，在以乳糖作為唯一碳源時，菌體內的 -半乳糖苷酶量可占到細菌總蛋白量的3%。 在上述二階段生長細菌利用乳糖再次繁殖前，也能測出細菌中 -半乳糖苷酶活性顯著增高的過程。這種典型的誘導現(xiàn)象，是研究基因表達調控極好的模型。針對大腸桿菌利用乳糖的適應現(xiàn)象，法國的Jocob和Monod等人做了一系列遺傳學和生化學研究實驗，于1961年提出乳糖操縱子（lac operon）學說。2. 操縱子的基本組成 乳糖操縱子模型已被許多研究實驗所證實，對其有了更深入的認識，并且發(fā)現(xiàn)其他原核生物基因調控也有類似的操縱子組織，操縱子是原核基因表達調控的一種重要的組織形式，大腸桿菌的基因多數(shù)

13、以操縱子的形式組成基因表達調控的單元。 下面就以乳糖操縱子為例子說明操縱子的最基本的組成元件（elements）。(1) 結構基因群 操縱子中被調控的編碼蛋白質的基因可稱為結構基因(structural gene, SG)。一個操縱子中含有2個以上的結構基因，多的可達十幾個。每個結構基因是一個連續(xù)的開放閱讀框(open reading frame), 5端有起始密碼ATG，3端有終止密碼TAA、TGA或TAG。各結構基因頭尾銜接、串連排列，組成結構基因群。 至少在第一個結構基因5側具有核糖體結合位點(ribosome binding site, RBS)，因而當這段含多個結構基因的DNA被轉錄

14、成多順反子mRNA，就能被核糖體所識別結合、并起始翻譯。核糖體沿mRNA移動，在合成完第一個編碼的多肽后，核糖體可以不脫離mRNA而繼續(xù)翻譯合成下一個基因編碼的多肽，直至合成完這條多順反子mRNA所編碼的全部多肽。 乳糖操縱子含有、和3個結構基因。 基因長3510bp，編碼含1170個氨基酸、分子量為135,000的多肽，以四聚體形式組成有活性的-半乳糖苷酶，催化乳糖轉變?yōu)榘肴樘?allolactose)，再分解為半乳糖和葡萄糖； 基因長780bp，編碼有260個氨基酸、分子量為30,000的半乳糖透過酶，促使環(huán)境中的乳糖進入細菌； 基因長825bp，編碼275氨基酸、分子量為32,000的轉

15、乙酰基酶，以二聚體活性形式催化半乳糖的乙酰化。 基因5側具有大腸桿菌核糖體識別結合位點（RBS）特征的Shine-Dalgarno(SD)序列，因而當乳糖操縱子開放時，核糖體能結合在轉錄產生的mRNA上。 由于、三個基因頭尾相接，上一個基因的翻譯終止密碼靠近下一個基因的翻譯起始密碼，因而同一個核糖體能沿此轉錄生成的多順反子（polycistron）mRNA移動，在翻譯合成了上一個基因編碼的蛋白質后，不從mRNA上掉下來而繼續(xù)沿mRNA移動合成下一個基因編碼的蛋白質，一氣依次合成這基因群所編碼所有的蛋白質。(2) (2) 啟動子啟動子 啟動子(promoter, P)是指能被RNA聚合酶識別、結

16、合并啟動基因轉錄的一段DNA序列。操縱子至少有一個啟動子，一般在第一個結構基因5側上游，控制整個結構基因群的轉錄。用RNA聚合酶與分離的一段DNA雙鏈混合，再加入外切核酸酶去水解DNA，結果只有被RNA聚合酶識別結合而被保護的那段DNA不被水解，由此可以測出啟動子的范圍及其序列。雖然不同的啟動子序列有所不同，但比較已經(jīng)研究過的上百種原核生物的啟動子的序列，發(fā)現(xiàn)有一些共同的規(guī)律，它們一般長40-60bp，含A-T bp較多，某些段落很相似的，有保守性，稱為共有性序列(consensus sequences)。 啟動子一般可分為識別(R，recognition)、結合(B，binding)和起始(

17、I，initiation)三個區(qū)段。 轉錄起始第一個堿基（通常標記位置為+1）最常見的是A；在-10bp附近有TATAAT一組共有序列，因為這段共有序列是Pribnow首先發(fā)現(xiàn)的，稱為Pribnow盒（Pribnow box）；在-35bp處又有TTGACA一組共有序列。不同的啟動子序列不同，與RNA聚合酶的親和力不同、啟動轉錄的頻率高低不同，即不同的啟動子起動基因轉錄的強弱不同，例如：PL、PR、PT7屬強啟動子，而Plac則是較弱的啟動子。色氨酸啟動子（Trp） 色氨酸啟動子（ Trp）的阻遏蛋白在有色氨酸時，二者結合，阻遏蛋白變構激活而與啟動子結合，阻止RNA聚合酶的轉錄。無色氨酸時，阻

18、遏解除，因-吲哚丙烯酸是色氨酸的競爭性抑制劑，常用作誘導劑，誘發(fā)色氨酸啟動子轉錄。同時，衰減子對Trp轉錄也有調節(jié)作用。乳糖啟動子（Lac） 無乳糖時，調節(jié)基因（I）產生阻遏蛋白與操縱基因結合，阻止RNA聚合酶結合進而阻止轉錄；有乳糖時，乳糖能與阻遏蛋白結合，使其變構解離而行使轉錄功能。 而LacZ基因可由IPTG（異丙基硫代- -D-半乳糖）誘導轉錄。Tac啟動子是由Trp啟動子和Lac啟動子構建而成的雜合啟動子，-35區(qū)為Trp啟動子順序，-10為LacUV5啟動子順序，二者之間距離為16bp者為pTrc，17bp者為pTac。該啟動子只需用IPTG誘導轉錄即可。Tac啟動子噬菌體的PL和

19、PR啟動子 PL為噬菌體左向啟動區(qū)，PR為右向轉錄啟動區(qū)，與阻遏基因CI編碼的阻遏蛋白結合，可抑制操縱基因OL或OR 轉錄，但CI在42被滅活， PL或PR啟動下游基因轉錄。脂蛋白啟動子（LPP） 脂蛋白為細胞外膜蛋白，細菌中含量高，該啟動子表達效率高，由信號肽可將基因表達產物分泌到胞外，常用來構建分泌型表達載體。(3) (3) 操縱區(qū)操縱區(qū) 操縱區(qū)（operator）是指能被調控蛋白特異性結合的一段DNA序列，常與啟動子鄰近或與啟動子序列重疊，當調控蛋白結合在操縱子序列上，會影響其下游基因轉錄的強弱。 以前將操縱區(qū)稱為操縱基因（operator gene）。但現(xiàn)在基因定義是為蛋白質或RNA編

20、碼的核酸序列，而操縱序列并不是編碼蛋白質的基因，卻是起著調控基因表達強弱的作用，正如啟動序列不叫啟動基因而稱為啟動子一樣，操縱序列就可稱為操縱區(qū)。operon譯為操縱子，即基因表達操縱的單元之意。以乳糖操縱子中的操縱區(qū)為例，其操縱區(qū)（o）序列位于啟動子（p）與被調控的基因之間，部分序列與啟動子序列重疊。 仔細分析操縱區(qū)序列，可見這段雙鏈DNA具有回文（palindrome）樣的對稱性一級結構，能形成十字形的莖環(huán)（stem loop）構造。不少操縱區(qū)都具有類似的對稱性序列，可能與特定蛋白質的結合相關。阻遏蛋白與操縱區(qū)結合，就妨礙了RNA聚合酶與啟動子的結合及其后 -半乳糖苷酶等基因的轉錄起始，從

21、而阻遏了這群基因的表達。 最早只把與阻遏蛋白結合、起阻遏作用的序列稱為操縱區(qū)，但其后發(fā)現(xiàn)有的操縱子中同一操縱序列與不同構像的蛋白質結合，可以分別起阻遏或激活基因表達的作用，阿拉伯糖操縱子中的操縱序列就是典型的例子。因而凡能與調控蛋白特異性結合、從而影響基因轉錄強弱的序列，不論其對基因轉錄的作用是減弱、阻止或增強、開放，都可稱為操縱區(qū)。（4） 調控基因 調控基因(regulatory gene)是編碼能與操縱序列結合的調控蛋白的基因。調控蛋白有： 阻遏蛋白(repressive protein)：與操縱區(qū)結合后能減弱或阻止其調控的基因轉錄，其介 導 的 調 控 方 式 為 負 調 控 ( n e

22、 g a t i v e regulation)； 激活蛋白(activating protein)：與操縱區(qū)結合后能增強或起動其調控的基因轉錄，所介導的調控方式為正調控(positive regulation)。某些特定的物質能與調控蛋白結合，使調控蛋白的空間構像發(fā)生變化，從而改變其對基因轉錄的影響，這些特定物質可稱為效應物（effector）。有兩種：誘導劑(inducer)：能引起誘導發(fā)生的分子；阻遏劑或輔助阻遏劑(corepressor)：能導致阻遏發(fā)生的分子。例如在乳糖操縱子中，調控基因lac I位于Plac鄰近，有其自身的啟動子和終止子，轉錄方向和結構基因群的轉錄方向一致，編碼產生

23、由347個氨基酸組成的調控蛋白R。 在環(huán)境沒有乳糖存在的情況下，R形成分子量為152,000的活性四聚體，能特異性與操縱區(qū)緊密結合，從而阻止利用乳糖的酶類基因的轉錄，所以R是乳糖操縱子的阻遏蛋白； 當環(huán)境中有足夠的乳糖時，乳糖與R結合，使R的空間構像變化，四聚體解聚成單體，失去與操縱區(qū)特異性緊密結合的能力，從而解除了阻遏蛋白的作用，使其后的基因得以轉錄合成利用乳糖的酶類。 在這過程中乳糖就是誘導劑，與R結合起到去阻遏作用(derepression)，誘導了利用乳糖的酶類基因轉錄開放。 許多調控蛋白都是變構蛋白（allosteric protein），通過與上述類似的方式與效應物結合改變空間構像

24、，從而改變活性，起到調節(jié)基因轉錄表達的作用。（5）結構基因 編碼蛋白質的基因。（二）乳糖操縱子的表達調控 大腸桿菌能以乳糖為唯一碳源生長，這是由于它能產生一套利大腸桿菌能以乳糖為唯一碳源生長，這是由于它能產生一套利用乳糖的酶。用乳糖的酶。這些酶受這些酶受乳糖操縱子乳糖操縱子的控制。大腸桿菌乳糖操縱子是大腸桿的控制。大腸桿菌乳糖操縱子是大腸桿菌菌DNA的一個特定區(qū)段，由的一個特定區(qū)段，由調節(jié)基因調節(jié)基因I，啟動基因，啟動基因P，操縱基因，操縱基因O和結構基因和結構基因Z、Y、A組成。組成。P區(qū)是轉錄起始時區(qū)是轉錄起始時RNA聚合酶的結合部位。聚合酶的結合部位。O區(qū)是阻遏蛋白的結合部位，其功能是控

25、制結構基因的轉錄。區(qū)是阻遏蛋白的結合部位，其功能是控制結構基因的轉錄。平時平時I基因經(jīng)常進行轉錄和翻譯，產生有活性的阻遏蛋白?；蚪?jīng)常進行轉錄和翻譯，產生有活性的阻遏蛋白。 Z編碼編碼-半乳糖苷酶；半乳糖苷酶；Y編碼編碼-半乳糖苷透過酶；半乳糖苷透過酶；A編碼編碼-半乳糖苷乙酰基轉移酶。半乳糖苷乙?；D移酶。 -半乳糖苷酶是一種半乳糖苷酶是一種-半乳糖苷鍵的專一性酶，除半乳糖苷鍵的專一性酶，除能將乳糖水解成葡萄糖和半乳糖。能將乳糖水解成葡萄糖和半乳糖。 -半乳糖苷透過酶的作用是使外界的半乳糖苷透過酶的作用是使外界的-半乳糖苷半乳糖苷（如乳糖）能透過大腸桿菌細胞壁和原生質膜進入細（如乳糖）能透過

26、大腸桿菌細胞壁和原生質膜進入細胞內。胞內。 -半乳糖苷乙?；D移酶的作用是把乙酰輔酶半乳糖苷乙酰基轉移酶的作用是把乙酰輔酶A上上的乙?；D到的乙?；D到-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。RNA聚合酶結合部位聚合酶結合部位阻遏物結合部位阻遏物結合部位1. 阻遏蛋白的負調控 當大腸桿菌在沒有乳糖的環(huán)境中生存時，lac操縱子處于阻遏狀態(tài)。此基因在其自身的啟動子Pi控制下，低水平、組成性表達產生阻遏蛋白R，每個細胞中僅維持約10個分子的阻遏蛋白。R以四聚體形式與操縱子結合，阻礙了RNA聚合酶與啟動子Plac的結合，阻止了基因的轉錄起動。R的阻遏作用不是絕對的，R與偶爾解離，使細

27、胞中還有極低水平的半乳糖苷酶及透過酶的生成。 當有乳糖存在時，乳糖受 半乳糖苷酶的催化轉變?yōu)閯e乳糖，與R結合，使R構象變化，R四聚體解聚成單體，失去與的親和力，與解離，基因轉錄開放，使 半乳糖苷酶在細胞內的含量可增加1000倍。這就是乳糖對lac操縱子的誘導作用。 乳糖操縱子的控制模型，其主要內容如下：乳糖操縱子的控制模型，其主要內容如下：Z、Y、A基因的產物由同一條多順反子的基因的產物由同一條多順反子的mRNA分子所編碼。分子所編碼。這個這個mRNA分子的啟動子緊接著分子的啟動子緊接著O區(qū)，而位于區(qū)，而位于I與與O之間的啟之間的啟動子區(qū)（動子區(qū)（P），不能單獨起動合成），不能單獨起動合成-半

28、乳糖苷酶和透過酶的生理過半乳糖苷酶和透過酶的生理過程。程。操縱基因是操縱基因是DNA上的一小段序列（僅為上的一小段序列（僅為26bp），是阻遏物的），是阻遏物的結合位點。結合位點。當阻遏物與操縱基因結合時，當阻遏物與操縱基因結合時，lacmRNA的轉錄起始受到抑制。的轉錄起始受到抑制。誘導物通過與阻遏物結合，改變它的三維構象，使之不能與操誘導物通過與阻遏物結合，改變它的三維構象，使之不能與操縱基因結合，從而激發(fā)縱基因結合，從而激發(fā)lacmRNA的合成。當有誘導物存在時，操的合成。當有誘導物存在時，操縱基因區(qū)沒有被阻遏物占據(jù)，所以啟動子能夠順利起始縱基因區(qū)沒有被阻遏物占據(jù)，所以啟動子能夠順利起始

29、mRNA的合的合成。成。 當一個當一個mRNA含有編碼一個以上蛋白質的編碼信含有編碼一個以上蛋白質的編碼信息，而且這些蛋白質都是以獨立的多肽被翻譯時，這息，而且這些蛋白質都是以獨立的多肽被翻譯時，這樣的樣的mRNA稱之多順反子稱之多順反子mRNA。多順反子。多順反子mRNA在在細菌中是很普遍的。細菌中是很普遍的。 多順反子多順反子lacmRNA中的中的lacZ，lacY，lacA經(jīng)翻經(jīng)翻譯生成的產物分別為譯生成的產物分別為LacZ（-半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（-galactosidase）、）、LacY（-半乳糖苷通透酶（半乳糖苷通透酶（-galactosidepermease）和）和LacA（

30、-半乳糖苷轉半乳糖苷轉乙?；福ㄒ阴；福╰hiogalactosidetransacetylase）。）。 半乳糖是半乳糖是lac操縱子轉錄的活性誘導物，人們發(fā)現(xiàn)操縱子轉錄的活性誘導物，人們發(fā)現(xiàn)一個合成的、結構上類似于別乳糖、不能被一個合成的、結構上類似于別乳糖、不能被-半乳糖苷半乳糖苷酶水解的酶水解的-半乳糖苷異丙基硫代半乳糖苷（半乳糖苷異丙基硫代半乳糖苷（isopropylthiogalactoside：IPTG）起著）起著lac操縱子的一個誘導物操縱子的一個誘導物的作用，所以的作用，所以IPTG常用于誘導含有使用了常用于誘導含有使用了lac啟動子的啟動子的質粒載體的細菌中的重組蛋白的表

31、達。質粒載體的細菌中的重組蛋白的表達。 一些化學合成的乳糖類似物，不受 半乳糖苷酶的催化分解，卻也能與R特異性結合使R構象變化，誘導lac操縱子的開放。例如異丙基硫代半乳糖苷(isopropylthiog-alactoside，IPTG)就是很強的誘導劑；不被細菌代謝而十分穩(wěn)定。X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷）也是一種人工化學合成的半乳糖苷，可被 半乳糖苷酶水解產生蘭色化合物，因此可以用作 半乳糖苷酶活性的指示劑。IPTG和X-gal都被廣泛應用在分子生物學和基因工程的工作中。 lac操縱子受操縱子受LacI阻遏蛋白調控。阻遏蛋白調控。在沒有誘導劑（乳在沒有誘導劑（乳糖或糖或I

32、PTG）存在時，）存在時，LacI阻遏蛋白與阻遏蛋白與lac操縱子操縱子DNA序序列結合得非常緊密，列結合得非常緊密，lac基因不能進行轉錄。當基因不能進行轉錄。當IPTG存存在時，在時，IPTG與與LacI阻遏蛋白相互作用，形成阻遏蛋白相互作用，形成LacI阻遏蛋阻遏蛋白白IPTG復合物，體外研究表明，該復合物對復合物，體外研究表明，該復合物對lac操縱操縱基因的親和性為單獨基因的親和性為單獨LacI阻遏蛋白的親和性的千分之一。阻遏蛋白的親和性的千分之一。所以所以IPTG作為作為lac基因表達的一個誘導劑，起著轉錄去基因表達的一個誘導劑，起著轉錄去阻遏作用。就象（下圖）表示的那樣，阻遏作用。

33、就象（下圖）表示的那樣，RNA聚合酶的結聚合酶的結合部位（合部位（lac操縱基因）也是操縱基因）也是LacI阻遏蛋白的結合部位，阻遏蛋白的結合部位，實驗表明實驗表明RNA聚合酶和聚合酶和LacI阻遏蛋白對操縱基因序列的阻遏蛋白對操縱基因序列的結合是相互排斥的。結合是相互排斥的。原核生物基因表達的調控原核生物基因表達的調控乳糖代謝基因表達調控圖解：乳糖代謝基因表達調控圖解：(沒有乳糖時沒有乳糖時) lacZ lacY lacA 調節(jié)基因調節(jié)基因啟動子啟動子 操縱基因操縱基因結構基因結構基因RNA聚合酶聚合酶信使信使RNA轉錄轉錄翻譯翻譯阻抑物與阻抑物與操縱基因操縱基因結合，結結合，結構基因轉構基

34、因轉錄受阻錄受阻阻抑物阻抑物原核生物基因表達的調控原核生物基因表達的調控乳糖代謝基因表達調控圖解：乳糖代謝基因表達調控圖解：(有乳糖時有乳糖時) lacZ lacY lacA 調節(jié)基因調節(jié)基因啟動子啟動子 操縱基因操縱基因結構基因結構基因RNA聚合酶聚合酶信使信使RNA轉錄轉錄翻譯翻譯阻抑物與乳糖結合后構象發(fā)生了改變，阻抑物與乳糖結合后構象發(fā)生了改變，因而不能與操縱基因結合，使得結構因而不能與操縱基因結合，使得結構基因進行轉錄?；蜻M行轉錄。阻抑物阻抑物乳糖乳糖轉錄轉錄半乳糖苷酶半乳糖苷酶酶酶酶酶乳糖分解代乳糖分解代謝調控過程謝調控過程是一個自我是一個自我調控過程調控過程2. CAP的正調控

35、細菌中的cAMP含量與葡萄糖的分解代謝有關，當細菌利用葡萄糖分解產生能量時，cAMP生成少而分解多，cAMP含量低；相反，當環(huán)境中無葡萄糖可供利用時，cAMP含量就升高。細菌中有一種能與cAMP特異結合的cAMP受體蛋白CRP(cAMP receptor protein)，當CRP未與cAMP結合時它是沒有活性的，當cAMP濃度升高時，CRP與cAMP結合并發(fā)生空間構象的變化而活化，稱為CAP(CRP-cAMP activated protein)，能以二聚體的方式與特定的DNA序列結合。在lac操縱子的啟動子Plac上游端有一段序列與Plac部分重疊的序列，能與CAP特異結合，稱為CAP結合

36、位點（CAP binding site）。CAP與這段序列結合時，可增強RNA聚合酶的轉錄活性，使轉錄提高50倍。相反，當有葡萄糖可供分解利用時，cAMP濃度降低，CRP不能被活化，lac操縱子的結構基因表達下降。由于Plac是弱啟動子，單純因乳糖的存在發(fā)生去阻遏使lac操縱子轉錄開放，還不能使細菌很好利用乳糖，必需同時有CAP來加強轉錄活性，細菌才能合成足夠的酶來利用乳糖。lac操縱子的強誘導既需要有乳糖的存在又需要沒有葡萄糖可供利用。通過這一機制，細菌是優(yōu)先利用環(huán)境中的葡萄糖，只有無葡萄糖而又有乳糖時，細菌才去充分利用乳糖。細菌對葡萄糖以外的其他糖（如阿拉伯糖、半乳糖、麥芽糖等）的利用上也

37、有類似對乳糖利用的情況，在含有編碼利用阿拉伯糖的酶類基因群的阿拉伯糖操縱子（ara operon）、半乳糖操縱子（gal operon）中也有CAP結合位點，CAP也起類似的正性調控作用。所以CAP的通用名稱是分解代謝基因激活蛋白（catabolic gene activator protein）。不難看出：CAP結合位點就是一種起正性調控作用的操縱子，CAP則是對轉錄起正性作用的調控蛋白激活蛋白，編碼CRP的基因也是一個調控基因，不過它并不在lac操縱子的附近，CAP可以對幾個操縱子都起作用。從上所述，乳糖操縱子屬于可誘導操縱子（inducible operon），這類操縱子通常使是關閉的，

38、當受效應物作用后誘導開放轉錄。這類操縱子使細菌能適應環(huán)境的變化，最有效地利用環(huán)境能提供的能源底物。乳糖操縱子的誘導乳糖操縱子的誘導 三、 色氨酸操縱子的表達調控 色氨酸是構成蛋白質的組分，一般的環(huán)境難以給細菌提供足夠的色氨酸，細菌要生存繁殖通常需要自己經(jīng)過許多步驟合成色氨酸，但是一旦環(huán)境能夠提供色氨酸時，細菌就會充分利用外界的色氨酸、減少或停止合成色氨酸，以減輕自己的負擔。細菌所以能做到這點是因為有色氨酸操縱子（trp operon）的調控。trp操縱子的結構操縱子的結構 trp操縱子的結構見下圖：五個結構基因（操縱子的結構見下圖：五個結構基因（E、D、C、B、A）分別編碼從分支氨酸起始合成色

39、氨酸途徑的酶或酶亞基。分別編碼從分支氨酸起始合成色氨酸途徑的酶或酶亞基。在結構基因之前為調控區(qū)域，包括啟動子區(qū)（在結構基因之前為調控區(qū)域，包括啟動子區(qū)（P）、操縱區(qū)）、操縱區(qū)（O）、前導肽編碼區(qū)（）、前導肽編碼區(qū)（L）和弱化子區(qū)（）和弱化子區(qū)（a）。）。 弱化子（衰減子）：在弱化子（衰減子）：在trpE與操縱基因之間有一段前導序與操縱基因之間有一段前導序列列L（162bp），它能編碼出一個內含兩個并連的），它能編碼出一個內含兩個并連的trp的的14肽，肽，由于這兩個由于這兩個trp的合成速度能控制核糖體在的合成速度能控制核糖體在mRNA上的移動，上的移動，使得前導序列的轉錄產物使得前導序列的轉

40、錄產物mRNA可形成特殊的結構，類似可形成特殊的結構，類似轉錄終止信號，因此編碼該結構區(qū)域的基因被稱為弱化子轉錄終止信號，因此編碼該結構區(qū)域的基因被稱為弱化子（衰減子）。（衰減子）。 在在trpA之后有兩個終止信號之后有兩個終止信號t和和t ，其中，其中t 為為 因子所識別，因子所識別，因此因此 因子也參與了調控。因子也參與了調控。 Trp操縱子的調節(jié)基因（操縱子的調節(jié)基因（trpR）產生輔阻遏蛋白，遠離）產生輔阻遏蛋白，遠離trp操操縱子?？v子。1.色氨酸操縱子的結構色氨酸操縱子的結構trp操縱子的調控：操縱子的調控：啟動子調控啟動子調控阻遏系統(tǒng)阻遏系統(tǒng)弱化子（衰減子）調控弱化子（衰減子）調

41、控2. 阻遏蛋白的負調控 合成色氨酸所需要酶類的基因E、D、C、B、A等頭尾相接串連排列組成結構基因群，受其上游的啟動子Ptrp和操縱子的調控，調控基因trpR的位置遠離P-結構基因群，在其自身的啟動子作用下，以組成性方式低水平表達其編碼分子量為47000的調控蛋白R，R并沒有與結合的活性，當環(huán)境能提供足夠濃度的色氨酸時，R與色氨酸結合后構象變化而活化，就能夠與特異性親和結合，阻遏結構基因的轉錄。色氨酸操縱子的可阻遏調控 因此色氨酸操縱子屬于一種負性調控的、可阻遏的操縱子（repressible operon），即這操縱子通常是開放轉錄的，有效應物（色氨酸為阻遏劑）作用時則阻遏關閉轉錄。細菌不

42、少生物合成系統(tǒng)的操縱子都屬于這種類型，其調控可使細菌處在生存繁殖最經(jīng)濟最節(jié)省的狀態(tài)。 3. 弱化子及其作用 實驗觀察表明：當色氨酸達到一定濃度、但還沒有高到能夠活化R使其起阻遏作用的程度時，產生色氨酸合成酶類的量已經(jīng)明顯降低，而且產生的酶量與色氨酸濃度呈負相關。仔細研究發(fā)現(xiàn)這種調控現(xiàn)象與色氨酸操縱子特殊的結構有關。在色氨酸操縱子Ptrp-與第一個結構基因trpE之間有162bp的一段先導序列（leading sequence，L），實驗證明當色氨酸有一定濃度時，RNA聚合酶的轉錄會終止在這里。 這段序列中含有編碼由14個氨基酸組成的短肽的開放閱讀框，其序列中有2個色氨酸相連，在此開放閱讀框前有核糖體識別結合位點（RBS）序列，提示這段短開放閱讀框在轉錄后是能被翻譯的。mRNA前導區(qū)序列分析 trp前導區(qū)的堿基序列已經(jīng)全部測定， 發(fā)現(xiàn)完整的前導序列可分為1、2、3、4區(qū)域，這四個區(qū)域的片段能以兩種不同的方式進行堿基配對（圖9-10），色氨酸操縱子的轉錄與翻譯調控色氨酸操縱子的轉錄與翻譯調控有時以1-2和3-4配對，有時只以2-3方式互補配對。核糖體經(jīng)過前導區(qū)繼續(xù)翻譯的能力控制著這兩種結構的轉換，它決定mRNA是否形成終止所需的結構。前導序列的終止區(qū)與一般的轉錄 終止位點特點相同，具有成串的 U和潛在的能形成莖環(huán)的二重對稱結構。通過RNaseT1降解實驗（此