研究生課質(zhì)粒dna的提取與酶切鑒定

1、汪建成汪建成 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室干細(xì)胞與組織工程中心干細(xì)胞與組織工程中心實(shí)驗(yàn)內(nèi)容質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA提取提取質(zhì)粒的酶切與鑒定質(zhì)粒的酶切與鑒定（電泳檢測(cè)下次進(jìn)行）（電泳檢測(cè)下次進(jìn)行）實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆召|(zhì)粒提純的原理和方法掌握質(zhì)粒提純的原理和方法; ;掌握核酸內(nèi)切酶切割質(zhì)粒的原理掌握核酸內(nèi)切酶切割質(zhì)粒的原理并學(xué)會(huì)運(yùn)用內(nèi)切酶并學(xué)會(huì)運(yùn)用內(nèi)切酶. .DNADNA克隆技術(shù)操作過(guò)程：克隆技術(shù)操作過(guò)程： 重組重組DNADNA技術(shù)技術(shù)/ /分子克隆分子克隆/DNA/DNA克隆技術(shù)克隆技術(shù)/ /基因工程基因工程DNA克隆技術(shù)示意圖克隆技術(shù)示意圖 載體DNA(限制性內(nèi)切酶切開)目的基因宿

2、主細(xì)胞重組體已轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞陽(yáng)性克隆株繁殖表達(dá)重組重組DNADNA技術(shù)的一般過(guò)程技術(shù)的一般過(guò)程2. 2.目的基因目的基因 和質(zhì)粒載體和質(zhì)粒載體 的連接的連接 3. 3.將重組將重組DNADNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞分子導(dǎo)入受體細(xì)胞 4. 4.選擇選擇5. 5.目的基因表達(dá)目的基因表達(dá) 1. 1.目的基因的獲取目的基因的獲取基因載體（gene vector）(1)質(zhì)粒的定義 質(zhì)粒是存在于細(xì)菌體內(nèi)、獨(dú)立于染色體的、可以自主復(fù)制的一類雙鏈環(huán)狀DNA，在細(xì)胞內(nèi)它們常以共價(jià)閉環(huán)的超螺旋(supercoiled)形式存在。 1-200kb(2)(2)質(zhì)粒的三種構(gòu)型質(zhì)粒的三種構(gòu)型 超螺旋超螺旋DNA(SC DNA

3、)DNA(SC DNA) 開環(huán)開環(huán)DNA(OC DNA) 線狀線狀DNA(L DNA)(3)(3)質(zhì)粒的拷貝數(shù)質(zhì)粒的拷貝數(shù)高拷貝數(shù)的質(zhì)粒稱為松弛型質(zhì)粒(relaxed plasmid)，獨(dú)立于細(xì)菌細(xì)胞而自主復(fù)制；低拷貝數(shù)的質(zhì)粒一般是嚴(yán)緊型質(zhì)粒(stringent plasmid)，它們的復(fù)制隨細(xì)菌染色體的復(fù)制同步進(jìn)行。第第1 1個(gè)字母：（小寫）個(gè)字母：（小寫）p p代表代表plasmidplasmid；第第2 2，3 3個(gè)字母：（大寫）代表人名、實(shí)驗(yàn)室名、表型性狀或其他特征的個(gè)字母：（大寫）代表人名、實(shí)驗(yàn)室名、表型性狀或其他特征的英文縮寫；英文縮寫；編號(hào)：（阿拉伯?dāng)?shù)字）區(qū)別同一類型的不同質(zhì)粒編

4、號(hào)：（阿拉伯?dāng)?shù)字）區(qū)別同一類型的不同質(zhì)粒(4)(4)質(zhì)粒的命名質(zhì)粒的命名(5)(5)質(zhì)粒的發(fā)展質(zhì)粒的發(fā)展分離純化質(zhì)粒DNA 的三個(gè)主要步驟培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增（DNA的擴(kuò)增與選擇）細(xì)菌的收集與裂解 收集高速離心的方法質(zhì)粒DNA的提取純化 （SDS-堿裂解法） 所有提取純化方法都是利用了質(zhì)粒DNA相對(duì)較小及共價(jià)閉合環(huán)狀的性質(zhì)。實(shí)驗(yàn)原理在有在有EDTAEDTA及去污劑（及去污劑（SDSSDS）存在的條件下，用堿處理細(xì)菌，可以使細(xì)菌的）存在的條件下，用堿處理細(xì)菌，可以使細(xì)菌的細(xì)胞壁破裂，釋放出細(xì)胞內(nèi)容物（染色體細(xì)胞壁破裂，釋放出細(xì)胞內(nèi)容物（染色體DNADNA、質(zhì)粒、質(zhì)粒DNADNA、蛋白質(zhì)和、蛋白質(zhì)和

5、RNARNA等）；等）；處理過(guò)程中，染色體處理過(guò)程中，染色體DNADNA斷裂成不同長(zhǎng)度的雙鏈斷裂成不同長(zhǎng)度的雙鏈DNADNA。強(qiáng)堿環(huán)境（強(qiáng)堿環(huán)境（pH12.0-12.5）時(shí)：宿主菌的線性雙鏈）時(shí)：宿主菌的線性雙鏈DNA片段中的氫鍵斷裂，片段中的氫鍵斷裂，雙鏈解離變性，而質(zhì)粒雙鏈解離變性，而質(zhì)粒DNA共價(jià)閉合環(huán)狀的雙鏈并不完全分離；共價(jià)閉合環(huán)狀的雙鏈并不完全分離；當(dāng)加入高濃度酸性鹽，當(dāng)加入高濃度酸性鹽，pH值恢復(fù)至中性時(shí)：變性的染色體值恢復(fù)至中性時(shí)：變性的染色體DNA與變性與變性的蛋白質(zhì)以及細(xì)胞碎片凝聚成網(wǎng)絡(luò)狀大分子不溶性沉淀物；而質(zhì)粒的蛋白質(zhì)以及細(xì)胞碎片凝聚成網(wǎng)絡(luò)狀大分子不溶性沉淀物；而質(zhì)粒D

6、NA又恢復(fù)天然構(gòu)型，能溶解在上清液中，這樣通過(guò)離心可以把染色體又恢復(fù)天然構(gòu)型，能溶解在上清液中，這樣通過(guò)離心可以把染色體DNA、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起除去。復(fù)合物等一起除去。如果要提高如果要提高DNA的純度，則可以用的純度，則可以用RNA酶消化除去酶消化除去RNA，并用酚抽提法，并用酚抽提法除去殘留的蛋白質(zhì)。除去殘留的蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)主要試劑3.Tris3.TrisClCl能使溶菌液維持溶菌作用的最適能使溶菌液維持溶菌作用的最適PHPH范圍范圍( (緩沖作用緩沖作用) )實(shí)驗(yàn)主要試劑實(shí)驗(yàn)主要試劑變性的蛋白質(zhì)與變性的蛋白質(zhì)與SDSSDS和和K+K+形成的復(fù)合物也形形成的復(fù)合物也形成沉淀；成

7、沉淀；小分子的質(zhì)粒小分子的質(zhì)粒DNADNA卻呈天然構(gòu)型，能溶解在卻呈天然構(gòu)型，能溶解在bufferbuffer中；中； 通過(guò)離心可以把線粒體通過(guò)離心可以把線粒體DNADNA、不穩(wěn)定的大分子、不穩(wěn)定的大分子RNARNA、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)-SDS-SDS復(fù)合物等一起除去復(fù)合物等一起除去實(shí)驗(yàn)步驟：加加1ml1ml培養(yǎng)物于培養(yǎng)物于EPEP管，管，12000rpm12000rpm30s30s（重復(fù)一次）（重復(fù)一次） 去上清（除凈），加入去上清（除凈），加入100ul 100ul 溶液溶液I I，充分重懸，充分重懸加入加入200ul 200ul 溶液溶液IIII，立即、輕柔振蕩數(shù)次，立即、輕柔振蕩數(shù)次加入加入

8、150ul 150ul 冰溶液冰溶液IIIIII，震蕩，震蕩10s10s，冰浴，冰浴35min35min，12000rpm12000rpm10min10min注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)： 1、加樣槍正確使用；、加樣槍正確使用； 2、廢液倒在水池中，槍頭、廢液倒在水池中，槍頭扔到垃圾桶中；扔到垃圾桶中； 3、加不同溶液要換槍頭；、加不同溶液要換槍頭； 4、離心前把管擦干；、離心前把管擦干； 5、轉(zhuǎn)移上清時(shí)不要吸到沉、轉(zhuǎn)移上清時(shí)不要吸到沉淀；淀； 6、吸取酚時(shí)槍頭伸到下層、吸取酚時(shí)槍頭伸到下層溶液中，注意不要沾到溶液中，注意不要沾到 皮膚。皮膚。實(shí)驗(yàn)二限制性內(nèi)切酶切割重組質(zhì)粒（雙酶切）限制性核酸內(nèi)切酶定義

9、能在特異位點(diǎn)（酶切位點(diǎn)）上催化雙鏈DNA分子的磷酸二酯鍵斷裂,產(chǎn)生相應(yīng)的限制性DNA片段。主要存在于細(xì)菌體內(nèi)。分類、（基因工程技術(shù)中常用（基因工程技術(shù)中常用型）型）第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫斜體；第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫斜體；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫斜體；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫斜體；第四個(gè)字母代表細(xì)菌的特定菌株，用大寫或小寫；第四個(gè)字母代表細(xì)菌的特定菌株，用大寫或小寫；（有時(shí)無(wú)）（有時(shí)無(wú)）用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名Hin d 屬屬 種種 株株 序序Haemophilus influenzae d株

10、株流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌d株的第三種酶株的第三種酶型限制性內(nèi)切酶的共性與特性型限制性內(nèi)切酶的共性與特性類酶識(shí)別序列特點(diǎn)類酶識(shí)別序列特點(diǎn) 回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu)(palindrome)(palindrome)切口切口 ：平端切口、粘端切口：平端切口、粘端切口反向重復(fù)序列Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口實(shí)驗(yàn)原理利用限制性內(nèi)切酶特異的識(shí)別DNA特異的核苷酸序列，并切割DNA,產(chǎn)生一定長(zhǎng)度的DNA片段，通過(guò)電泳對(duì)酶切前后產(chǎn)物分析可以鑒別目的基因（重組質(zhì)粒DNA） 重組質(zhì)粒; BamHI 、H

11、ind 限制性內(nèi)切酶;反應(yīng)緩沖液;瓊脂糖凝膠電泳所需試劑和設(shè)備實(shí)驗(yàn)材料重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒BamHIHind III雙酶切雙酶切電泳檢測(cè)電泳檢測(cè)5-GAATTC-33-CTTAAG-5BamHI5-AAGCTT-33-TTCGAA-5Hind III 質(zhì)粒DNA 10l 10M buffer 2l BamH 1l Hind 1l ddH2O 6l 合計(jì)合計(jì)20l準(zhǔn)備室準(zhǔn)備室老師已老師已加好加好同學(xué)自同學(xué)自己加己加加完輕吹數(shù)次混勻，加完輕吹數(shù)次混勻，37，1-3h雙酶切反應(yīng)體系實(shí)驗(yàn)操作酶切反應(yīng)液（包含酶切反應(yīng)液（包含BamH I, Hind III, Buffer, BamH I, Hind III

12、, Buffer, H2O H2O ）已由準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)的老師配好）已由準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)的老師配好每人一份，每份每人一份，每份10ul10ul將酶切底物（質(zhì)粒）與反應(yīng)液混合將酶切底物（質(zhì)粒）與反應(yīng)液混合充分混勻，瞬時(shí)離心充分混勻，瞬時(shí)離心3737C C，1-31-3小時(shí)小時(shí)電泳檢測(cè)（下次進(jìn)行，請(qǐng)回收酶切前后的質(zhì)粒）電泳檢測(cè)（下次進(jìn)行，請(qǐng)回收酶切前后的質(zhì)粒）載體構(gòu)建總論 載體構(gòu)建的基本流程 載體的特征、分類與選擇 酶切連接 同源重組 重組質(zhì)粒的表達(dá)1.載體構(gòu)建的基本流程目的基因片段的獲取重組質(zhì)粒的構(gòu)建重組質(zhì)粒的篩選與驗(yàn)證重組質(zhì)粒的表達(dá)酶切連接同源重組目的片段獲取前先根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇相應(yīng)的載體類型，構(gòu)建方法、篩

13、選方法等2.載體的四個(gè)主要特征多克隆位點(diǎn) 復(fù)制起始位點(diǎn)遺傳標(biāo)記基因載體大小3.載體的分類（一）按來(lái)源：1.質(zhì)粒載體：多使用大腸桿菌質(zhì)粒為載體。2.噬菌體載體：多是感染大腸桿菌的噬菌體。3.病毒載體：多用于真核生物。（二）按功能：1.克隆載體：可插入外源基因，酶切位點(diǎn)多。2.表達(dá)載體：用于外源基因的表達(dá)（原核和真核）。（三）按進(jìn)入受體細(xì)胞類型：1.原核載體。2.真核載體。3.穿梭載體：穿梭往返兩種生物之間。4.質(zhì)粒載體選擇的三點(diǎn)思考【1】構(gòu)建DNA重組體的目的克隆擴(kuò)增/基因表達(dá)？【2】質(zhì)粒載體的類型真核/原核？【3】質(zhì)粒載體的具體圖譜信息大小/啟動(dòng)子/MCS/抗性特征?質(zhì)?；咎卣鞯恼J(rèn)識(shí)酶切位點(diǎn)

14、酶切位點(diǎn)酶切位點(diǎn)酶切位點(diǎn)啟動(dòng)子啟動(dòng)子質(zhì)粒大小質(zhì)粒大小原核抗性原核抗性多克隆位點(diǎn)多克隆位點(diǎn)復(fù)制起始點(diǎn)復(fù)制起始點(diǎn)閱讀質(zhì)粒圖譜的四步法第一步：首先看Ori的位置及類型，了解質(zhì)粒的類型。（原核/真核/穿梭質(zhì)粒）第二步：再看篩選標(biāo)記，如抗性，決定使用什么篩選標(biāo)記。（Amp水解內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。）第三步：看多克隆位點(diǎn)（MCS），決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。（1）應(yīng)具有多個(gè)限制酶的單一切點(diǎn)。（2）便于外源基因的插入。（3）如果在這些位點(diǎn)外有外源基因的插入，會(huì)導(dǎo)致某種標(biāo)志基因的失活，而便于篩選。（抗性篩選、藍(lán)白斑篩選）PS：看外源DNA插入片段大小。質(zhì)粒一般只能容納小于10Kb的外源DN

15、A片段。一般來(lái)說(shuō)，外源DNA片段越長(zhǎng)，越難插入，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率越低。第四步：是否含有其他元件：標(biāo)簽蛋白元件、表達(dá)系統(tǒng)元件，即啟動(dòng)子核糖體結(jié)合位點(diǎn)克隆位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。復(fù)制起點(diǎn)（Origin of replication）質(zhì)粒的篩選標(biāo)記抗性基因的篩選1、菌的篩選標(biāo)記Amp(氨芐霉素)Kana(卡那霉素)Tet (四環(huán)素)Cm (氯霉素) 2、真核表達(dá)的篩選標(biāo)記Neo (新霉素，G418)Puro（嘌呤霉素）Hygro(潮霉素)Zeo(博來(lái)霉素)案例分析標(biāo)記蛋白的篩選是否是融合蛋白是否會(huì)影響蛋白構(gòu)象 紅色熒光和綠色熒光質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)克隆位點(diǎn)的篩選1）：基因片段與片段連接片段A片段B2）：基因

16、片段與載體連接載體片段A1、A/B上都沒(méi)有2、A沒(méi)有，載體上有真核生物的基因結(jié)構(gòu)啟動(dòng)子核糖體結(jié)合位點(diǎn)克隆位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)(1)啟動(dòng)子:促進(jìn)DNA 轉(zhuǎn)錄的DNA 序列,這個(gè)DNA 區(qū)域常在基因或操縱子編碼序列的上游,是DNA 分子上可以與RNApol 特異性結(jié)合并使之開始轉(zhuǎn)錄的部位,但啟動(dòng)子本身不被轉(zhuǎn)錄。（lac、trp、T7）(2)核糖體結(jié)合位點(diǎn):mRNA 有核糖體的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn),對(duì)于原核而言是AUG(起始密碼)和SD 序列。(3)轉(zhuǎn)錄終止序列:轉(zhuǎn)錄終止序列有助于使RNApol重點(diǎn)轉(zhuǎn)錄克隆的外源基因，控制所轉(zhuǎn)錄RNA的長(zhǎng)度，提高RNA的穩(wěn)定性。重點(diǎn)思考題1：基因工程中有克隆載體和表達(dá)載體，克隆

17、載體可以在受體菌中大量復(fù)制，表達(dá)載體用于表達(dá)目的蛋白，那么實(shí)際應(yīng)用中，我們的最終目的是要得到目的蛋白，克隆載體不能完成表達(dá)，有何用呢？參考解釋：參考解釋：克隆的目的比較單一，就是將你感興趣的克隆的目的比較單一，就是將你感興趣的DNADNA片段片段重組進(jìn)入載體，然后在宿主細(xì)胞中大量繁殖，主要重組進(jìn)入載體，然后在宿主細(xì)胞中大量繁殖，主要用于各種文庫(kù)的建立，比如人類基因組計(jì)劃；同時(shí)用于各種文庫(kù)的建立，比如人類基因組計(jì)劃；同時(shí)由于載體所能容納的目的片段的長(zhǎng)度是有限的，而由于載體所能容納的目的片段的長(zhǎng)度是有限的，而克隆載體沒(méi)有表達(dá)所需的各種片段，所以可以容納克隆載體沒(méi)有表達(dá)所需的各種片段，所以可以容納更

18、長(zhǎng)的目的片段，即可以克隆足夠長(zhǎng)的基因，效率更長(zhǎng)的目的片段，即可以克隆足夠長(zhǎng)的基因，效率更高。更高。重點(diǎn)思考題2：實(shí)際工作中，構(gòu)建兼有克隆和表達(dá)雙重功能的載體有何困難？參考解釋：參考解釋： 表達(dá)載體的目的是多樣化的，由于實(shí)際工作的需要，不同的實(shí)表達(dá)載體的目的是多樣化的，由于實(shí)際工作的需要，不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康木托枰O(shè)計(jì)不同的載體，用表達(dá)載體克隆基因不是不可以，驗(yàn)?zāi)康木托枰O(shè)計(jì)不同的載體，用表達(dá)載體克隆基因不是不可以，實(shí)際工作重要考慮許多因素，因此更復(fù)雜。實(shí)際工作重要考慮許多因素，因此更復(fù)雜。 例如：細(xì)菌攝取能量的能力是一定的，如果用來(lái)合成大量蛋白例如：細(xì)菌攝取能量的能力是一定的，如果用來(lái)合成大量蛋白質(zhì)

19、，合成核酸就會(huì)相應(yīng)減少。另一方面，細(xì)菌承受的工作負(fù)荷也質(zhì)，合成核酸就會(huì)相應(yīng)減少。另一方面，細(xì)菌承受的工作負(fù)荷也是有限的。是有限的。 綜上：完全可以構(gòu)建雙重功能的載體，但是相對(duì)效率會(huì)低很多。綜上：完全可以構(gòu)建雙重功能的載體，但是相對(duì)效率會(huì)低很多。因此，我們一般的策略是：將目的片段克隆到非常因此，我們一般的策略是：將目的片段克隆到非常簡(jiǎn)單的克隆載體上，按照需要再克隆到可以滿足各簡(jiǎn)單的克隆載體上，按照需要再克隆到可以滿足各種要求的表達(dá)載體上。種要求的表達(dá)載體上。重點(diǎn)思考題3：請(qǐng)回答一下基本信息。載體類別載體類別哺乳動(dòng)物哺乳動(dòng)物表達(dá)載體表達(dá)載體細(xì)菌抗性Amp宿主大腸桿菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞真核啟動(dòng)子CMV、

20、SV40原核啟動(dòng)子T7、bla細(xì)胞篩選標(biāo)記新霉素原核復(fù)制起點(diǎn)f1、pUC真核復(fù)制起點(diǎn)SV40高拷貝測(cè)序bla重點(diǎn)思考題4：請(qǐng)分析下列質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果。參考解釋：參考解釋：5.酶切連接TATA克隆克隆重點(diǎn)思考題5：如何理解以下句子：“TA克隆載體可以直接克隆PCR產(chǎn)物，省去了兩端加裝識(shí)別位點(diǎn)的設(shè)計(jì)，PCR效率就更高?！眳⒖冀忉專簠⒖冀忉專篜CRPCR產(chǎn)物可以直接接入產(chǎn)物可以直接接入T T載體，而經(jīng)典的克載體，而經(jīng)典的克隆隆PCRPCR產(chǎn)物需要限制性內(nèi)切酶切割后接入載體，設(shè)計(jì)產(chǎn)物需要限制性內(nèi)切酶切割后接入載體，設(shè)計(jì)PCRPCR引物需要兩端加酶切位點(diǎn)，因此這部分序列與模引物需要兩端加酶切位點(diǎn)，因此這部分序列與模版不配對(duì)，自然版不配對(duì)，自然PCRPCR效率就低了。效率就低了。PSPS：如果：如果PCRPCR產(chǎn)物設(shè)計(jì)了酶切位點(diǎn)就可以直接克隆進(jìn)產(chǎn)物設(shè)計(jì)了酶切位點(diǎn)就可以直接克隆進(jìn)需要的載體，不必借助需要的載體，不必借助T T載體。因?yàn)楦弑Ｕ婷竿ǔ２划a(chǎn)載體。因?yàn)楦弑Ｕ婷竿ǔ２划a(chǎn)生生A A堿基，所以如果片段較長(zhǎng)時(shí)，必須使用高保真酶，堿基，所以如果片段較長(zhǎng)時(shí)，必須使用高保真酶，那么就不能使用那么就不能使用T T載，而需要設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)。載，而需要設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)。 轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)化：將質(zhì)粒DNA或以其為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)菌體內(nèi)使之獲得新的遺傳特性。轉(zhuǎn)染：將含有目的gene的載體轉(zhuǎn)到真核cell內(nèi)。傳統(tǒng)