基礎(chǔ)科學(xué)TB技術(shù)用于輔助診斷結(jié)核臨床病例報(bào)道

1、T SPOT TB技術(shù)用于輔助診斷結(jié)核臨床病例報(bào)道莫凌，孟成艷，張舒，金嘉琳，張文宏作者單位：200040 上海，復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院感染科通訊作者：張文宏，Email：zhangwenhong退修稿：0074基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（2005CB523102）近年來(lái)，我國(guó)結(jié)核病的發(fā)病率有上升趨勢(shì)，臨床上經(jīng)常會(huì)遇到一些癥狀不典型的結(jié)核病和肺外結(jié)核病，而目前可用于診斷結(jié)核病的方法有限，同時(shí)又缺乏快速敏感的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)，為結(jié)核病的早期診斷與治療帶來(lái)困難。ELISPOT（enzyme-linked immunospot assay,酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法）技術(shù)是一種新型的免疫酶技術(shù)，它是從單細(xì)胞水平

2、檢測(cè)分泌抗體細(xì)胞或分泌細(xì)胞因子細(xì)胞1。由ELISPOT發(fā)展來(lái)的T SPOT TB（結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)）技術(shù)就是通過(guò)檢測(cè)結(jié)核感染后T淋巴細(xì)胞分泌的特異性的細(xì)胞因子IFN-來(lái)診斷是否存在結(jié)核感染。1ELISPOT技術(shù)原理該方法源于Mahairas等在1996年發(fā)現(xiàn)的一段存在結(jié)核分枝桿菌中名為“RD1”的基因序列2，而在卡介苗菌株和大部分環(huán)境中的分枝桿菌基因中則缺乏RD1序列。RD1編碼產(chǎn)生兩種蛋白：ESAT-6和CFP-10（culture filtrate protein），ESAT-6和CFP-10作為特異性抗原刺激機(jī)體T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性的細(xì)胞因子IFN-。 根據(jù)這一原理，T SPOT技

3、術(shù)利用結(jié)核桿菌感染者外周血單核細(xì)胞中存在結(jié)核特異的活化T淋巴細(xì)胞，這些淋巴細(xì)胞在受到結(jié)核桿菌特異抗原刺激后分泌干擾素而設(shè)計(jì)的T細(xì)胞免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)。外周血單核細(xì)胞，結(jié)核特異的混合抗原A和混合抗原B（分別為ESAT-6和CFP-10的部分多肽片斷），對(duì)照試劑一起加入預(yù)先包被抗干擾素抗體的微孔培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)外周血單核細(xì)胞中存在針對(duì)結(jié)核桿菌的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞時(shí)，培養(yǎng)液中加入的結(jié)核桿菌特異混合抗原多肽A和B將刺激這些效應(yīng)T淋巴細(xì)胞分泌干擾素。分泌的干擾素被微孔板上的抗體捕獲，再次加入的堿性磷酸酶標(biāo)記并針對(duì)干擾素不同表位的抗體與被捕獲的干擾素結(jié)合，滯留在微孔板表面。顯色底物溶液在反應(yīng)部位被酶分解形成不溶性

4、色素沉淀斑點(diǎn)。每一個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)干擾素分泌細(xì)胞（結(jié)核特異的效應(yīng)T細(xì)胞）。通過(guò)對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)可以推測(cè)體內(nèi)是否存在對(duì)結(jié)核桿菌反應(yīng)的效應(yīng)T細(xì)胞，從而對(duì)結(jié)核桿菌感染進(jìn)行輔助診斷。2ELISPOT操作方法采集8ml患者的血液加入含檸檬酸鈉的CPT采血管，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），加入細(xì)胞培養(yǎng)液，輕輕重懸細(xì)胞。在已包被抗IFN-抗體的微量板的4個(gè)孔中，分別加入細(xì)胞培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照，植物血凝素PHA作為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)核分枝桿菌特異混合多肽A和B，分別含ESAT-6與CFP-10（Oxford Immunote Ltd., Oxford, UK）。然后在每個(gè)孔中加入含250000個(gè)細(xì)胞的上述懸液。把微

5、量板放在37培養(yǎng)16-20小時(shí)后，用PBS液洗板4次，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的小鼠抗人IFN-單抗，在2-8下孵育1小時(shí)。孵育后再用PBS液洗板4次。最后每孔加入顯色底物液BCIP/NBTPLUS，室溫中靜置7分鐘后觀察結(jié)果，并用計(jì)算機(jī)輔助成像分析系統(tǒng)進(jìn)行斑點(diǎn)閱讀與統(tǒng)計(jì)（ELISPOT試劑盒由上海復(fù)星科技有限公司提供）。第一孔為陰性對(duì)照孔，第二孔為陽(yáng)性對(duì)照孔，如出現(xiàn)斑點(diǎn)，說(shuō)明試驗(yàn)成功。第三，四孔為實(shí)驗(yàn)孔，當(dāng)測(cè)試孔A或B達(dá)到以下標(biāo)準(zhǔn)則判定為陽(yáng)性結(jié)果：（1） 如果陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)為0-5個(gè)，測(cè)試孔斑點(diǎn)數(shù)減去陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)6。（2） 如果陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)6個(gè)，測(cè)試孔斑點(diǎn)數(shù)必須2倍的陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)。3

6、ELISPOT的臨床應(yīng)用我院傳染科首次將T SPOT TB技術(shù)用于臨床，輔助診斷疑似結(jié)核患者，為結(jié)核病的診斷提供了一項(xiàng)新的技術(shù)，并取得一定成效?，F(xiàn)將一例經(jīng)T SPOT TB 技術(shù)鑒別診斷后得到有效治療反應(yīng)的病例報(bào)道如下。31病例報(bào)道患者，男，62歲。入院前3月無(wú)誘因下出現(xiàn)頸部疼痛,一月前出現(xiàn)左上肢麻木,進(jìn)行性乏力，伴發(fā)熱，體溫在38度左右，無(wú)畏寒，寒戰(zhàn)，無(wú)咳嗽，咳痰，無(wú)消瘦，盜汗等。入院查體，精神較萎，左側(cè)頸部可捫及腫大淋巴結(jié)，質(zhì)軟，無(wú)壓痛。心肺無(wú)特殊，腹軟，肝脾肋下未及。頸軟，克氏征（-），布氏征（-），余病理征均陰性。左上肢肌力3級(jí)，肌張力可，余肢體肌力，肌張力正常。輔助檢查，血常規(guī)：白細(xì)

7、胞9.42×109/L,中性粒細(xì)胞72%。腦脊液：白細(xì)胞 2×106/L，總蛋白 983mg/L,葡萄糖3.9mmol/L,氯化物 120mmol/L。腦脊液抗酸染色，細(xì)菌涂片培養(yǎng)，真菌涂片培養(yǎng)均陰性。頸椎MRI：多發(fā)椎體異常信號(hào)伴硬膜增厚（圖1）。頭顱MRI示：雙側(cè)額葉、側(cè)腦室旁多發(fā)斑點(diǎn)狀異常信號(hào)（圖2）。高度懷疑頸部與顱內(nèi)異常信號(hào)為轉(zhuǎn)移性腫瘤可能大，但骨髓穿刺，腹部B超，腹部CT，頸部淋巴結(jié)活檢均未發(fā)現(xiàn)異常。PPD（-）。圖1：A圖為該患者治療前頸椎MRI：在頸2-4椎體之間有異常信號(hào)，并有硬脊膜增厚。B圖為治療后同一部位的MRI：可見(jiàn)原先的異常信號(hào)降低，硬脊膜增厚略有

8、減輕。圖2：該患者頭顱MRI?？梢?jiàn)側(cè)腦室旁有圓形異常信號(hào)。32結(jié)果用T SPOT TB檢測(cè)該患者血液標(biāo)本，結(jié)果陽(yáng)性（圖3）。于是對(duì)該患者行診斷性抗癆治療，方案為四聯(lián)（異煙肼，利福平，吡嗪酰胺，乙胺丁醇），同時(shí)加用甲強(qiáng)龍30mg。治療3天后，患者體溫平，治療一周后，患者頸部疼痛好轉(zhuǎn)，左上肢肌力逐漸恢復(fù)，兩周后，患者左上肢肌力基本恢復(fù)正常。復(fù)查頸部MRI示：原先異常信號(hào)減弱，硬脊膜增厚減輕（圖1-B）?；颊叱鲈簳r(shí)仍維持四聯(lián)抗癆治療，激素減為強(qiáng)的松20mg ，囑患者隨訪。從該病人的治療反應(yīng)診斷該患者為結(jié)核性腦脊髓膜炎和椎體結(jié)核。圖3：該病例的ELISPOT結(jié)果。其中第一行為陰性對(duì)照孔，第二行為陽(yáng)性對(duì)

9、照孔，第三，四行為實(shí)驗(yàn)孔。圖中可見(jiàn)第3孔中出現(xiàn)大量斑點(diǎn)，為陽(yáng)性結(jié)果。每個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)分泌INF- 的T細(xì)胞。用計(jì)算機(jī)輔助成像技術(shù)進(jìn)行斑點(diǎn)計(jì)數(shù)得到4個(gè)孔的斑點(diǎn)數(shù)分別為2，832，401，0。33討論該患者是肺外結(jié)核感染，缺乏典型的結(jié)核中毒癥狀，如消瘦，盜汗等，影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)頸椎，頭顱有異常信號(hào)，從形態(tài)學(xué)上傾向于轉(zhuǎn)移性腫瘤，但對(duì)常見(jiàn)腫瘤的篩查未發(fā)現(xiàn)原發(fā)腫瘤的跡象，腦脊液檢查只有蛋白較高，細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯升高。常見(jiàn)的結(jié)核檢查，如PPD試驗(yàn)，腦脊液抗酸染色，涂片均為陰性，淋巴結(jié)活檢也未發(fā)現(xiàn)結(jié)核感染病灶。在這種情況下，我們用ELISPOT技術(shù)對(duì)其血液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果提示陽(yáng)性。當(dāng)然，ELISPOT不是診斷結(jié)核的

10、金標(biāo)準(zhǔn)，所以我們不能就此確診為結(jié)核。于是對(duì)病人行診斷性抗癆治療，從抗癆治療的反應(yīng)來(lái)看，患者癥狀明顯好轉(zhuǎn)，由此判斷治療有效，證實(shí)該患者為結(jié)核感染診斷成立。目前，臨床診斷結(jié)核的方法有限。結(jié)核菌素試驗(yàn)（TST）是臨床常用篩查結(jié)核的免疫學(xué)方法，雖然操作簡(jiǎn)單，觀察結(jié)果方便，但由于其有較高的假陽(yáng)性和假陰性，對(duì)臨床結(jié)核病的診斷意義不大。細(xì)菌學(xué)是診斷結(jié)核的金標(biāo)準(zhǔn)，但培養(yǎng)需要兩個(gè)月的時(shí)間，而且陽(yáng)性率取決于采集標(biāo)本中細(xì)菌的數(shù)量，不利于早期診斷與治療。影像學(xué)作為輔助診斷方法，對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核診斷有一定價(jià)值，但對(duì)肺外結(jié)核診斷存在困難。ELISOPT法作為一種新的酶免疫檢測(cè)方法在國(guó)外（主要是英國(guó)與美國(guó)）新近剛開(kāi)始用于結(jié)核

11、桿菌感染的檢測(cè)，它不僅靈敏度高，特異性強(qiáng)3，而且操作簡(jiǎn)單，需時(shí)少，一般兩天就能看到結(jié)果。在國(guó)內(nèi)也已經(jīng)進(jìn)入試驗(yàn)性的診斷階段，但尚缺乏大規(guī)模的臨床實(shí)驗(yàn)及評(píng)價(jià)。Susan等在一項(xiàng)前瞻性、雙盲隊(duì)列研究中得到ELISPOT的敏感性為83%，顯著高于皮試的敏感性63%，同時(shí)，非結(jié)核病人不會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性。在小于3歲，合并HIV感染及營(yíng)養(yǎng)不良的兒童中，皮試的敏感性顯著下降，而ELISPOT的敏感性沒(méi)有顯著性改變4。另有研究得到ELISPOT在普通人群中的敏感性為96%，在健康人群中的特異性為100%，在HIV陽(yáng)性患者中的特異性為92%5。目前該技術(shù)已在國(guó)外廣泛用于活動(dòng)性結(jié)核病和結(jié)核潛伏感染者的診斷，HIV合并結(jié)

12、核感染的檢測(cè)，用于區(qū)別結(jié)核感染者與BCG接種以及耐藥結(jié)核菌感染的快速檢測(cè)。4總結(jié)綜上所述，ELISPOT作為一種新的檢測(cè)結(jié)核感染的酶免疫學(xué)方法,其敏感性與特異性顯著高于傳統(tǒng)的TST,而且所需時(shí)間少，有利于結(jié)核病的早期診斷與治療意義重大，對(duì)隱性結(jié)核感染也有診斷價(jià)值。但由于價(jià)格昂貴,不如TST操作簡(jiǎn)便易行,限制了該方法在臨床的推廣與應(yīng)用。我院首次將該方法試驗(yàn)性的用于輔助臨床診斷，并取得一定成效，在臨床癥狀不典型，PPD診斷不明確，涂片及培養(yǎng)均為陰性的疑似結(jié)核病患者中，輔以ELISPOT方法，可以幫助確診結(jié)核感染。參考文獻(xiàn)1侯世芳，許賢豪，劉廣志等，酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)（ELISPOT）技術(shù)的應(yīng)用. 中國(guó)神

13、經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志，2002;10（9）:200-202.2 Lalbani A.Spotting latent infection:the path to better tuberculosis control.Thorax 2003;58:916-9183 Philip C, Roger H, Annette F, et al. Large-scale evaluation of enzyme-linked immunospot assay and skin test for diagnosis of Mycobacterium tuberculosis infectection against a gradient of exposure in the Gambia.Clin Infect Dis.2004;38:966-973.4Liebeschuetz S, Bamber S, Ewer K,et al.Diagnosis of tuberculosis in South African children with a T-cell-based assay: a prospective cohort study. Lancet. 2004;364(9452):2196-2203.5