實(shí)驗(yàn)四 感受態(tài)細(xì)胞的制備

1、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)四大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)v1 1、掌握大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備原理。掌握大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備原理。v2 2、學(xué)習(xí)學(xué)習(xí)CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的方法和技術(shù)。的方法和技術(shù)。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理1、感受態(tài)細(xì)胞制備原理：、感受態(tài)細(xì)胞制備原理：受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)一些特受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)一些特殊方法殊方法(如電擊法、如電擊法、CaCl2、RbCl等化學(xué)試劑法等化學(xué)試劑法)處處理后，理后，細(xì)菌會(huì)膨脹成球形，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生細(xì)菌會(huì)膨脹成球形，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變了暫時(shí)性的改變，成為允許

2、外源成為允許外源DNA分子進(jìn)入的分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞(Compenent cells)。u（Ca2+會(huì)使細(xì)胞膜磷脂雙分子層形成液晶結(jié)構(gòu)，促使細(xì)胞會(huì)使細(xì)胞膜磷脂雙分子層形成液晶結(jié)構(gòu)，促使細(xì)胞外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶解離開(kāi)來(lái)，離開(kāi)所在區(qū)域外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶解離開(kāi)來(lái)，離開(kāi)所在區(qū)域）分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)2、感受態(tài)轉(zhuǎn)化原理：、感受態(tài)轉(zhuǎn)化原理：細(xì)菌處于細(xì)菌處于0的的CaCl2低滲溶低滲溶液中，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，同時(shí)轉(zhuǎn)化混合液中，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，同時(shí)轉(zhuǎn)化混合物中的質(zhì)粒物中的質(zhì)粒DNA會(huì)形成抗會(huì)形成抗DNase的羥基的羥基-鈣磷酸復(fù)鈣磷酸復(fù)合物黏附于細(xì)胞表面，經(jīng)過(guò)

3、合物黏附于細(xì)胞表面，經(jīng)過(guò)42短時(shí)間的熱激處短時(shí)間的熱激處理，促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收理，促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物，在培養(yǎng)液復(fù)合物，在培養(yǎng)液中生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增殖，在中生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增殖，在選擇培養(yǎng)基上可獲得所需的轉(zhuǎn)化子。選擇培養(yǎng)基上可獲得所需的轉(zhuǎn)化子。實(shí)驗(yàn)儀器實(shí)驗(yàn)儀器超凈工作臺(tái)超凈工作臺(tái)離心設(shè)備離心設(shè)備臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)制冰機(jī)制冰機(jī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)1、實(shí)驗(yàn)材料：、實(shí)驗(yàn)材料：E. coli JM109。2、實(shí)驗(yàn)試劑：、實(shí)驗(yàn)試劑：(1)LB液體培養(yǎng)基：稱取胰蛋白胨液體培養(yǎng)基：稱取胰蛋白胨10 g，酵母提取物，酵母提取物 5 g，NaC

4、l 10 g，加雙蒸水至總體積，加雙蒸水至總體積1L，高壓下蒸氣滅菌。，高壓下蒸氣滅菌。(2) 0.1mol/L CaCl2溶液：稱取溶液：稱取1.1098g CaCl2(無(wú)水無(wú)水,分析純分析純)，溶于溶于90mL重蒸水中，定容至重蒸水中，定容至100mL，高壓滅菌。，高壓滅菌。(3) 30%甘油：量取甘油：量取30mL甘油，加入甘油，加入70 mL雙蒸水，雙蒸水， 混勻，混勻，定容至定容至100mL ，高壓滅菌。，高壓滅菌。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)1. 菌體的培養(yǎng)菌體的培養(yǎng)(事先已做事先已做) 受體菌的培養(yǎng)受體菌的培養(yǎng)從從 LB平板上挑取新活化的平板上挑取新活化的E. coli JM10

5、9單菌落單菌落，接種于接種于35 mL LB液體培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)基中，37下振蕩培養(yǎng)下振蕩培養(yǎng) 12 hr 左右左右，直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后后期。期。 將該菌懸液以將該菌懸液以 1: 1001: 50 的比例接種于的比例接種于50mL LB液體培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)23 hr，至至OD600為為0.30.4。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 取取2個(gè)個(gè)1.5mL離心管離心管，分別，分別轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)入1mL菌菌液液，4 12000 rpm，離心離心2 min。 棄去上清棄去上清，每管加入，每管加入1mL預(yù)冷的預(yù)冷的 0.1 mol/L CaCl2 溶溶液液，懸浮細(xì)胞懸浮細(xì)胞，冰上放

6、置冰上放置 30 min。 4 ，12000 rpm，離心離心2 min。 棄去上清棄去上清，每管，每管加入加入50L預(yù)冷預(yù)冷的的0.1 mol/LCaCl2 溶溶液液，輕輕緩緩懸浮細(xì)胞懸浮細(xì)胞,50L預(yù)冷的預(yù)冷的30%甘油甘油，冰上放置冰上放置5 min，即即為為感受態(tài)細(xì)胞懸液。感受態(tài)細(xì)胞懸液。 將將感受態(tài)細(xì)胞懸液感受態(tài)細(xì)胞懸液，放置于，放置于-80，可保存半年?？杀４姘肽?。2. 感受態(tài)細(xì)胞的制備感受態(tài)細(xì)胞的制備 (CaCl2 法，超凈臺(tái)內(nèi)法，超凈臺(tái)內(nèi))分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)第二天，第二天， CaCl2 法法前一天晚上，前一天晚上，第二天早上第二天早上分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分

7、子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1.1.細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和密度：不要用經(jīng)過(guò)多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)于細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和密度：不要用經(jīng)過(guò)多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)于的培養(yǎng)菌，最好從的培養(yǎng)菌，最好從-80-80甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。2.2.細(xì)胞生長(zhǎng)密度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)為宜，可通過(guò)監(jiān)細(xì)胞生長(zhǎng)密度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)為宜，可通過(guò)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液的測(cè)培養(yǎng)液的ODOD600600來(lái)控制。來(lái)控制。JM109JM109菌株的菌株的ODOD600600為為0.30.30.40.4密度比較合適，密度過(guò)高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。密度比較合適，密度過(guò)高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。3.3.實(shí)驗(yàn)操作時(shí)要格外小心，懸浮細(xì)胞時(shí)要輕柔，以免造實(shí)驗(yàn)操作時(shí)要格外小心，懸浮細(xì)胞時(shí)要輕柔，以免造成菌體破裂，影響轉(zhuǎn)化。成菌體破裂，影響轉(zhuǎn)化。4.4.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要注意無(wú)菌操作，