MTT實驗操作流程

1、MT位驗標(biāo)準(zhǔn)操作流程1. 原理活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTTa原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞碉（DMSO能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀在570nm波長處測定其光吸收值，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi),MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。根據(jù)測得的吸光度值（即ODfi）,來判斷活細(xì)胞數(shù)量,OD值越大，細(xì)胞活性越強（如果是測藥物毒性，則表示藥物毒性越?。?。2. 試劑及耗材CO2a胞培養(yǎng)箱、生物安全柜、倒置顯微鏡、低速離心機(jī)、酶標(biāo)儀、8道排槍、培養(yǎng)基胎牛血清、MTT、DMS、O96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、胰酶、血細(xì)胞計數(shù)板3. 注意事項MTT溶液的配制

2、，通常MTT配成的終濃度為5mg/ml,須用PBS或生理鹽水做溶劑。MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，0.22過濾后4c避光保存兩周內(nèi)，或配制成5mg/ml保存在-20長期保存,避免反復(fù)凍融,小劑量分裝,用避光袋或錫箔紙包住避光以免分解，當(dāng)MT儂為灰綠色時不能再用。DMSOT以直接溶解，無需配制，使用方便，溶解速度快，但對人體毒性較大，且需去除原培養(yǎng)液,在去除培養(yǎng)液的過程中,可能會把結(jié)晶去掉,導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定。4. 實驗步驟:4.1.1 0.5%的胰酶消化對數(shù)期細(xì)胞,待細(xì)胞即將脫離皿底時,加少量血清終止反應(yīng),1000r/min,離心5min,吸去上清,將細(xì)胞沉淀用培養(yǎng)基吹打混勻,制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)后調(diào)

3、整其濃度至5-10X104/ml。4.1.2 取4塊96孔板,分別標(biāo)記為0h、24h、48h、72h,每組設(shè)置3個復(fù)孔,每孔加入100nL細(xì)胞懸液，每板分別鋪8組細(xì)胞，分別為3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000個/孔，邊緣孔用無菌PBSR充以消除邊緣效應(yīng)。4.1.3 5%CO2,37C培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，每24h取出一塊96孔板檢測：a）每孔加入10nLMTT溶液（5mg/ml）,繼續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-6h;b）小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液;c）每孔加入150仙LDMSO使結(jié)晶物充分溶解；d）加DMSOt10min內(nèi)，用酶標(biāo)儀檢測各孔波長1570nm的吸光值;4.

4、1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線制作以時間為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞增殖標(biāo)準(zhǔn)曲線。選擇合適的細(xì)胞濃度進(jìn)行實驗。4.2 MTT藥物毒性實驗步驟4.2.1 0.5%的胰酶消化對數(shù)期細(xì)胞,加少量血清終止反應(yīng),1000r/min,離心5min,吸去上清,將細(xì)胞沉淀用培養(yǎng)基吹打混勻,制成細(xì)胞懸液,細(xì)胞計數(shù)后調(diào)整其濃度至5-10X104/ml,藥物毒性實驗一般每孔細(xì)胞數(shù)量5000-10000個（具體數(shù)目根據(jù)預(yù)實驗判斷）。此外,還應(yīng)根據(jù)細(xì)胞本身特性,如生長快慢,來決定細(xì)胞數(shù)量。比如生長較快的細(xì)胞密度可略小。4.2.2 將細(xì)胞懸液制備好后，輕輕混勻，每孔加入90屋細(xì)胞懸液，這樣待測細(xì)胞的密度為500010000/孔（邊

5、緣孔用無菌PBS®充）。注意:因細(xì)胞在混勻后仍要繼續(xù)沉降,因此接種的過程中要反復(fù)多次混勻,如每加5個孔就混勻一次,以確保接種的細(xì)胞密C在各孔之間完全相同,這對于MTT勺結(jié)果至關(guān)重要。4.2.3 5%CO2,37培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),待細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物。（原則上,細(xì)胞貼壁后即可加藥,或兩h,或半天時間,但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥。加藥時按照所需的濃度在EP管中先稀釋好，每孔加入10仙1已經(jīng)稀釋好藥物，使每孔最終體積為100仙1,為了避免產(chǎn)生誤差，稀釋好的藥物體積應(yīng)略大于所需藥物的體積。需要注意的是，以DMSm為溶劑溶解的藥物至少需要進(jìn)行100倍

6、以上稀釋才能使用，因為作用于細(xì)胞DMSOJ含量高于1%寸,DMS8殺死細(xì)胞從而影響判斷。）4.2.4 按照藥物作用時間點,每24h取出一塊96孔板檢測:a）每孔加入10nLMTT溶液（5mg/m1）,繼續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-6h;b）小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液;c）每孔加入150仙LDMSO置搖床上低速振蕩10min,使結(jié)晶物充分溶解；d）加DMSO110min內(nèi)，用酶標(biāo)儀檢測各孔波長570nm的吸光值;4.2.5 同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT二甲基亞碉）,對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT二甲基亞碉）0IC50值可以通過Graphpadprism5進(jìn)行計算4.3 MTT增殖實驗4.3.1 分別收集各組對數(shù)期的細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞懸液濃度;4.3.2 取4塊96孔板，每孔加入100仙L細(xì)胞懸液,鋪板使待測細(xì)胞為5X103cell/孔（邊緣孔用無菌PBS填充以消除邊緣效應(yīng)），每組設(shè)置3個復(fù)孔;4.3.3 5%CO2,37C培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，每24h取出一塊96孔板檢測：a）每孔加入20nLMTT溶液（5mg/ml）,