(KJ201706)動(dòng)物源性食品中克倫特羅萊克多巴胺及沙丁胺醇的快速檢測(cè)膠體金免疫層析法

1、附件 6動(dòng)物源性食品中克倫特羅、萊克多巴胺及沙丁胺醇的快速檢測(cè)膠體金免疫層析法（ KJ201706）1 范圍本方法規(guī)定了動(dòng)物肌肉組織中克倫特羅、萊克多巴胺及沙丁胺醇的膠體金免疫層析快速檢測(cè)方法。本方法適用于豬肉、牛肉等動(dòng)物肌肉組織中克倫特羅、萊克多巴胺及沙丁胺醇的快速測(cè)定。2 原理本方法采用競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析原理。樣品中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇與膠體金標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，抑制抗體和檢測(cè)卡中檢測(cè)線（ T 線）上抗原的結(jié)合，從而導(dǎo)致檢測(cè)線顏色深淺的變化。通過(guò)檢測(cè)線與控制線（ C 線）顏色深淺比較，對(duì)樣品中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇進(jìn)行定性判定。3 試劑與材料除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均

2、為分析純，水為 GB/T6682 規(guī)定的二級(jí)水。3.1 試劑3.1.1 甲醇：色譜純。3.1.2 氫氧化鈉。3.1.3 磷酸二氫鉀。3.1.4 磷酸氫二鈉。3.1.5 鹽酸。3.1.6 氯化鈉。3.1.7 氯化鉀。3.1.8 三氮化鈉。3.1.9 乙二胺四乙酸二鈉。3.1.10 三羥甲基氨基甲烷，即 Tris。3.1.11 乙酸乙酯。3.1.12 磷酸二氫鈉。3.1.13 氫氧化鈉溶液（1mol/L）:稱取氫氧化鈉（3.1.2） 4g,用水溶解并稀釋至 100mL。3.1.14 緩沖液：準(zhǔn)確稱取磷酸二氫鉀（3.1.3） 0.3g ，磷酸氫二鈉（ 3.1.4） 1.5g ，溶于約 800mL 水

3、 中，充分混勻后用鹽酸（3.1.5）或氫氧化鈉溶液（3.1.13）調(diào)節(jié)pH至7.4,用水稀釋至1000mL, 混勻。4 c保存，有效期三個(gè)月。3.1.15 展開(kāi)液：準(zhǔn)確稱取磷酸二氫鉀（3.1.3） 2g,磷酸氫二鈉（3.1.4） 1.44g,氯化鈉（3.1.6） 8g, 氯化鉀（3.1.7） 0.2g,三氮化鈉（3.1.8） 0.5g,乙二胺四乙酸二鈉（3.1.9） 1.0g溶于約500mL水 中，充分混勻后用水稀釋至1000mL。3.1.16 Tris 緩沖全夜（pH9.0, 1mol/L）：稱取 Tris （3.1.10） 121.14g,溶于約 700mL 水中,充分混勻 后加入鹽酸（3

4、.1.5）調(diào)試pH至9.0后用水定容至1000mL o3.1.17 Tris 緩沖全夜（pH9.0, 10mmol/L ）：精密量取 1mol/LTris 緩沖?夜（3.1.16） 1mL,用水稀釋定 容至100mL。3.1.18 磷酸二氫鈉溶液（0.2mol/L ）:稱取磷酸二氫鈉（3.1.12） 24.0g,用水溶解并稀釋至 1000mL。3.1.19 磷酸氫二鈉溶液 （0.2mol/L）:稱取磷酸氫二鈉 （3.1.4） 28.4g ,用水溶解并稀釋至 1000mL。3.1.20 磷酸鹽緩沖液（pH7.4, 0.2mol/L）:量取磷酸二氫鈉溶液（3.1.18） 19mL ,加入81mL磷

5、酸 氫二鈉溶液（3.1.19）,混勻。3.1.21 磷酸鹽緩沖液（pH7.4, 10mmol/L）:精密量取 0.2mol/L磷酸鹽緩沖液（3.1.20） 50mL,用 水稀釋至1000mL。3.2 參考物質(zhì)克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇參考物質(zhì)的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號(hào)、分子式、相對(duì)分子量見(jiàn)表1,純度97%。表1克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇參考物質(zhì)的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號(hào)、分子式、相對(duì)分子質(zhì)量序號(hào)中文名稱英文名稱CAS登錄號(hào)分子式相對(duì)分子質(zhì)量1克倫特羅Clenbuterol37148-27-9C12H18Cl2N2O277.192萊克多巴胺Ractopamine97825

6、-25-7Ci8H23NO3301.383沙丁胺醇Salbutamol18559-94-9C13H21NO3239.31注：或等同可溯源物質(zhì)。3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：精密稱取適量克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇參考物質(zhì)（3.2）,分別置于100mL容量瓶中，用甲醇（3.1.1）溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別制成濃度為100pg/mL的克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。-18 C保存，有效期一年。3.3.2 克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)中間液（1科g/mL：精密量取克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100科g/mL （3.3.1） 1mL置于100mL容量瓶中，用甲醇（3.1.1）稀釋至刻度，搖勻，制

7、成濃度為 1 pg/mL的克倫特羅標(biāo)準(zhǔn) 中間液。臨用新制。3.3.3 克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)工作液（20ng/mL）：精密量取克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)中間液（1科g/mL （3.3.2） 1mL,置于50mL容量瓶中，用甲醇（3.1.1）稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為 20ng/mL的克倫特羅標(biāo)準(zhǔn) 工作液。臨用新制。3.3.4 萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)中間液（1科g/mD :精密量取萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100科g/mL （3.3.1）1mL置于100mL容量瓶中，用甲醇（3.1.1）稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為 1科g/m而萊克多巴 胺標(biāo)準(zhǔn)中間液。臨用新制。3.3.5 萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)工作液（20ng/mL ） ： 精密量取萊

8、克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)中間液置于 50mL 容量瓶中，用甲醇（ 3.1.1）稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為準(zhǔn)工作液。臨用新制。3.3.6 沙丁胺醇胺標(biāo)準(zhǔn)中間液（1科g/mL：精密量取沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（置于 100mL 容量瓶中，用甲醇（ 3.1.1 ）稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為中間液。臨用新制。3.3.7 沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)工作液（ 20ng/mL ） ：精密量取沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)中間液（置于 50mL 容量瓶中，用甲醇（ 3.1.1）稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為工作液。臨用新制。(1 W g/mL (3.3.4) 1mL, 20ng/mL 的萊克多巴胺標(biāo)100 科 g/mL (3.3.1) 1mL1科g/mL的

9、沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)1 科 g/mL (3.3.6) 1mL, 20ng/mL 的沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)3.4 材料3.4.1 克倫特羅試劑盒/檢測(cè)卡（條）：含膠體金試紙條及配套的試劑。3.4.2 萊克多巴胺試劑盒/檢測(cè)卡（條）：含膠體金試紙條及配套的試劑。3.4.3 沙丁胺醇試劑盒/檢測(cè)卡（條）：含膠體金試紙條及配套的試劑。3.4.4 固相萃取柱：丙烯酸系弱酸性陽(yáng)離子交換柱。4 儀器和設(shè)備4.1 電子天平：感量為 0.01g 和 0.0001g。4.2 組織粉碎機(jī)。4.3 水浴箱。4.4 離心機(jī)：轉(zhuǎn)速R4000r/min4.5 移液器：10 壯，100 山，1mL, 5mL。4.6 讀數(shù)儀：產(chǎn)品配套可使用的檢

10、測(cè)儀器（可選）4.7 固相萃取裝置（可選） 。4.8 其他產(chǎn)品說(shuō)明書操作中需用的儀器。4.9 環(huán)境條件：溫度 10-40C,濕度80%。5 分析步驟5.1 試樣制備取適量具有代表性樣品的可食部分，充分粉碎混勻。5.2 試樣提取和凈化稱取適量試樣，按照方法一（ 5.2.1）或方法二（ 5.2.2）提取步驟分別對(duì)空白試樣、加標(biāo)質(zhì)控樣品、待測(cè)樣進(jìn)行處理。5.2.1 方法一（隔水煮法）稱取粉碎混勻的樣品5g （精確至0.01g）于50mL離心管，置90c水浴中加熱20min至離心管中可清晰看見(jiàn)有組織液滲透， 4000r/min 離心 10min ，將上清液轉(zhuǎn)至另一離心管，重復(fù)離心操作一次。準(zhǔn)確量取上清

11、液900 L,加入緩沖液（3.1.14） 100 dL混勻，即得待測(cè)液。本方法推薦水浴加熱，也可按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。5.2.2 方法二（固相萃取法）稱取粉碎混勻的樣品5g （精確至0.01g）于50mL離心管，加入10mmol/LTris緩沖液（3.1.17）5mL,劇烈振搖5min,放置20min ,加入乙酸乙酯（3.1.11） 10mL ,劇烈振搖1min。以4000r/min 離心 2min ，上清液待凈化。連接好固相萃取裝置（ 4.7） ，并在固相萃取柱（ 3.4.4）上方連接30mL注射器針筒，將上述上清液全部倒入 30mL 針筒中，用手緩慢推壓注射器活塞，控制液體流速約 1

12、滴/秒，使注射器中液體全部流過(guò)固相萃取柱，盡可能將固相萃取柱中溶液去除干凈。將固相萃 取柱下方的接液管更換為潔凈的離心管，向固相萃取柱中加入 0.5mL10mmol/L 磷酸鹽緩沖液 （3.1.21 ）。用手緩慢推壓注射器活塞，控制液體流速約 1 滴/秒，使固相萃取柱中的液體全部流至 離心管中，即得待測(cè)液。注：試樣制備過(guò)程可按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，不做限定。5.3 測(cè)定步驟5.3.1 檢測(cè)卡與金標(biāo)微孔測(cè)定步驟測(cè)試前，將未開(kāi)封的檢測(cè)卡恢復(fù)至室溫。吸取100dL上述待測(cè)液于金標(biāo)微孔中，上下抽吸5 10 次直至微孔試劑混合均勻。室溫溫育5min ，將反應(yīng)液全部加入到檢測(cè)卡的加樣孔中， 1min后加

13、入 1 滴展開(kāi)液（ 3.1.15） 。檢測(cè)卡加入樣本后10min 進(jìn)行結(jié)果判定。5.3.2 無(wú)金標(biāo)微孔時(shí)，檢測(cè)卡測(cè)定步驟測(cè)試前，將未開(kāi)封的檢測(cè)卡恢復(fù)至室溫。吸取100dL上述待測(cè)液直接加入到檢測(cè)卡加樣孔中，1min 后加入 1 滴展開(kāi)液（ 3.1.15） 。檢測(cè)卡加入樣本后10min 后進(jìn)行結(jié)果判定。5.3.3 試紙條與金標(biāo)微孔測(cè)定步驟測(cè)試前，將未開(kāi)封的試紙條恢復(fù)至室溫。吸取100dL上述待測(cè)液于金標(biāo)微孔中，上下抽吸5 10 次直至微孔試劑混合均勻。室溫溫育1min ，將試紙條樣品墊插入到金標(biāo)微孔中。室溫溫育4min ，從微孔中取出試紙條，去掉試紙條下端樣品墊，進(jìn)行結(jié)果判定。注：1.測(cè)定步驟建

14、議按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。2.結(jié)果判定建議使用讀數(shù)儀，讀數(shù)儀的具體使用參照儀器使用說(shuō)明書。5.4 質(zhì)控試驗(yàn)每批樣品應(yīng)同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)和加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)。5.4.1 空白試驗(yàn)稱取空白試樣，按照 5.2和 5.3 步驟與樣品同法操作。5.4.2 加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)稱取空白試樣5g（精確至0.01g）置于50mL離心管中，加入適量克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)工作液（20ng/ml）（3.3.3）,使克倫特羅濃度為 0.5 wg/kg按照5.2和5.3步驟與樣品同法操作。稱取空白試樣 5g （精確至0.01g）置于50mL離心管中，加入適量萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)工作液（20ng/ml） （3.3.3）,使萊克多巴胺濃度為0.5科g/

15、kg按照5.2和5.3步驟與樣品同法操作。準(zhǔn)確稱取空白試樣5g （精確至0.01g）置于50mL離心管中，加入適量沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)工作液（20ng/ml） （3.3.3）,使沙丁胺醇濃度為 0.5科g/kg按照5.2和5.3步驟與樣品同法操作。6 結(jié)果判定要求6.1 讀數(shù)儀測(cè)定結(jié)果通過(guò)儀器對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀。6.1.1 無(wú)效6.1.2陽(yáng)性結(jié)果若檢測(cè)結(jié)果顯示6.1.3陰性結(jié)果若檢測(cè)結(jié)果顯示當(dāng)質(zhì)控線（C線）不顯色時(shí)，無(wú)論檢測(cè)線（T線）是否顯色，均表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)效?！?”（陽(yáng)性），表示試樣中含有待測(cè)組分且其含量大于等于方法檢測(cè)限。-"'（陰性），表示試樣中不含待測(cè)組分或其含量低于方法檢測(cè)限

16、。6.2 目視判定通過(guò)對(duì)比質(zhì)控線（C線）和檢測(cè)線（T線）的顏色深淺進(jìn)行結(jié)果判定。6.2.1 無(wú)效當(dāng)質(zhì)控線（C線）不顯色時(shí)，無(wú)論檢測(cè)線（T線）是否顯色，均表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)效。6.2.2 陽(yáng)性結(jié)果T線）不出現(xiàn)或出現(xiàn)但顏色淺于質(zhì)控線（ C線），表示試樣 判為陽(yáng)性。T線）顏色深于或等于質(zhì)控線（C線），表示試樣中不含待質(zhì)控線（C線）顯色，若檢測(cè)線（ 中含有待測(cè)組分且其含量高于方法檢測(cè)限, 6.2.3陰性結(jié)果質(zhì)控線（C線）顯色，若檢測(cè)線（加樣孔無(wú)效陰性陽(yáng)性B.檢測(cè)卡6.3 質(zhì)控試驗(yàn)要求空白試樣測(cè)定結(jié)果應(yīng)為陰性，加標(biāo)質(zhì)控樣品測(cè)定結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性。7 結(jié)論當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，應(yīng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行確證。8 性能指標(biāo)8.1 檢

17、測(cè)限：克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇檢出限均為0.5科g/kg8.2 靈敏度：95%8.3 特異性：85%8.4 假陰性率：5%8.5 假陽(yáng)性率： 15%注：性能指標(biāo)計(jì)算方法見(jiàn)附錄A 。9 其他本方法所述試劑、試劑盒信息、操作步驟及結(jié)果判定要求是為給方法使用者提供方便，在使用本方法時(shí)不做限定。方法使用者在使用替代試劑、試劑盒或操作步驟前，須對(duì)其進(jìn)行考察，應(yīng)滿足本方法規(guī)定的各項(xiàng)性能指標(biāo)。本方法參比方法為 GB/T22286-2008動(dòng)物源性食品中多種3受體激動(dòng)劑殘留量的測(cè)定液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法 （包括所有的修改單） 。本方法使用克倫特羅試劑盒可能與沙丁胺醇、特布他林、西馬特羅等有交叉反應(yīng)，當(dāng)結(jié)果判

18、定為陽(yáng)性時(shí)，應(yīng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行確證。本方法使用沙丁胺醇試劑盒可能與克倫特羅、特布他林、西馬特羅等有交叉反應(yīng)，當(dāng)結(jié)果判定為陽(yáng)性時(shí)，應(yīng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行確證。附錄A快速檢測(cè)方法性能指標(biāo)計(jì)算表表A.1性能指標(biāo)計(jì)算方法樣品情況a檢測(cè)Z果b總數(shù)陽(yáng)性陰性陽(yáng)性N11N12N1.=N11+N12陰性N21N22N2.=N21+N22總數(shù)N.1=N11+N12N.2=N21+N22N=N1.+N2.或 N.1+N.2顯著性差異（平）胃二(| N12-N21 1-1) 2/( N12+N21 ),自由度(df) =1靈敏度（p+, %）p+=N11/N1.特異性（P-, %）p-=N22/N2.假陰性率（pf-, %）pf-=N12/N1.=100-靈敏度假陽(yáng)性率（pf+, %）pf+=N21/N2.=100