乳與乳制品病原微生物檢驗(yàn)方法糞鏈球菌群的檢測

1、乳與乳制品病原微生物檢驗(yàn)方法糞鏈球菌群的檢測YLNB 4.81.儀器及器材1.1 培養(yǎng)箱：36 1C1.2 冰箱：04C1.3 恒溫水?。?6 1C1.4 天平1.5 電爐1.6 吸管1.7 廣口瓶或三角瓶：容量為 500ml1.8 玻璃珠：直徑 5mm1.9 平皿：直徑約 90mm1.10 試管1.11 放大鏡1.12 菌落計(jì)數(shù)器1.13 酒精燈1.14 均質(zhì)器或乳缽1.15 試管架1.16 滅菌刀或剪子1.17 滅菌鑷子2.培養(yǎng)基和試劑2.1 : pfrzir腸球菌選擇性培養(yǎng)基（PSE）:按 SN/T0475-95 中規(guī)定或按購買的商用培養(yǎng)基配方配制。2.2: KF 鏈球菌瓊脂：按 SN/

2、T0475-95 中規(guī)定或按購買的商 用培養(yǎng)基配方配制。2.3 :疊氮化鈉葡萄糖肉湯：按SN/T0475-95 中規(guī)定或按購買的商用培養(yǎng)基配方配制。2.4 :生理鹽水2.5 : 75%乙醇溶液3. 檢驗(yàn)程序方法一：平板計(jì)數(shù)法：糞鏈球菌的檢驗(yàn)程序如下：檢樣做成幾個(gè)適當(dāng)倍數(shù)的稀釋液選擇 2-32-3 個(gè)適宜稀釋度各以 1ml1ml 分別加入滅菌平皿中每個(gè)皿內(nèi)加入適量 KFKF 瓊脂（或 PSEPSE 瓊脂）361C482h（或24 2h)菌落計(jì)數(shù)報(bào)告3.1 操作步驟3.1.1 檢樣稀釋及培養(yǎng)3.1.1.1以無菌操作將檢樣 25g（或 ml）剪碎放于裝有 225ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃

3、瓶內(nèi)，（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠）或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成 1: 10 的均勻稀釋液。固體檢樣在加入稀釋液后，最好置均質(zhì)器中以 800010000r/min 的速度處理 1min，做成 1： 10 的均勻稀釋 液。3.1.1.2用 1ml 滅菌吸管吸取 1 : 10 稀釋液 1ml，沿管壁徐 徐注入含有 9ml 滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)（注意 吸管尖端不要觸及管內(nèi)稀釋液）振搖試管，混合均勻，做成1： 100 的稀釋液。3.1.1.3另取 1ml 滅菌吸管，按上述操作順序，做 10 倍遞 增稀釋液，如此每遞增稀釋一次，即換用一支 1ml 滅菌吸管。3.1.1.4根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)

4、要求或?qū)?biāo)本污染情況的估計(jì)，選擇 2-3 個(gè)適宜稀釋度，分別在做10 倍遞增稀釋的同時(shí)，即以吸取該稀釋度的吸管移1ml 稀釋液于滅菌平皿內(nèi)。3.1.1.5稀釋液移入平皿后，應(yīng)及時(shí)將涼至46C的 pfrzir腸球菌選擇性培養(yǎng)基或 kf 鏈球菌培養(yǎng)基(可放置于 46 1C水浴中保溫)注入平皿約15ml，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使混合均勻。同時(shí)將培養(yǎng)基傾入加有 1ml 稀釋液的滅菌平皿內(nèi)做空白對(duì)照。3.1.1.6待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置36 1C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 482h (2412h)。3.1.2 菌落計(jì)數(shù)方法做平板菌落計(jì)數(shù)時(shí)，可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡， 以防遺漏。在記下各平板的菌落數(shù)后，求出同稀釋度的各平

5、板平均菌落總數(shù)。糞鏈球菌在KF 平板上形成暗紅色至粉紅色菌落，邊緣整齊，瓊脂表面下菌落呈橢圓或晶體狀；在 PSE平板上形成帶棕色環(huán)的棕黑色菌落。選擇有 30-300 個(gè)菌落 的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)(菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告按照 GB/T4789.2 的相關(guān) 條例)，按糞鏈球菌數(shù)/g(mL)報(bào)告結(jié)果。方法二：多管法：4.1 檢驗(yàn)程序:疊氮化鈉葡萄糖肉湯管3636 1 1C, 2424 2h2h不混濁混濁混濁不明顯糞鏈球菌陰性PSEPSE 平板3636 1 1C, 2424 2h2h繼續(xù)培養(yǎng)至4848 2h2h是否帶棕色環(huán)的棕黑色菌落糞鏈球菌陽性糞鏈球菌陰性4.2方法4.2.1檢樣稀釋（冋方法）4.2.2接種培養(yǎng)選

6、適當(dāng)稀釋液的樣液接種一套疊氮化鈉肉湯管，接種量在 1ml 或 1ml 以下者用 10ml 單料管，接種量為 10ml 者用 10ml 雙料管。每一稀釋度接種 3 管，置 36 1C培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng) 24 2h，檢查各試管的混濁情況，如果所有試管不混濁，則可報(bào)告為糞鏈球菌陰性，如果有混濁情況，按下列程序進(jìn)行。（若混濁不明顯繼續(xù)培養(yǎng)至 48 2h 后記錄結(jié)果。）423 確證試驗(yàn)：培養(yǎng) 24 2h 或 48 2h 之后，對(duì)所有產(chǎn)生混濁的試管進(jìn) 行確證試驗(yàn)，用接種環(huán)將各管的培養(yǎng)物劃線于PSE 平板上，36 1C培養(yǎng) 24 2h,在平板上出現(xiàn)的帶棕色環(huán)的棕黑色菌 落，確證為糞鏈球菌群細(xì)菌。4.2.4 報(bào)告

7、根據(jù)證實(shí)為糞鏈球菌陽性的管數(shù)查MPN 僉索表，報(bào)告每 1ml（g）糞鏈球菌群的最可能數(shù)。MPN 僉索表見附錄。附錄：1g 樣品中最可能數(shù)（MPN 表陽性管數(shù)陽性管數(shù)0.1ml0.01m0.001MPN0.1ml0.01m0.001MPNlmllml000 30311300260321600260331900391003.601031017.20116.1102110129.211215013121107.30206.2111110219.3112150221211319023161201112220121151232423136130162324413120233531322430023133

8、29301392009.1302642011430395202203104320326311752101531212021120313160212273209321334321150220213222102212832329022235330240223423314602302933211003331100注：表內(nèi)所列樣品量如改為1, 0.1 , 0.01g(ml)時(shí)，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低 10 倍；如改為 0.01, 0.001 , 0.0001 g(ml)時(shí)，則 表內(nèi)數(shù)字相應(yīng)增加 10 倍，其余可類推。回首頁附圖 1 金黃色葡萄球菌革蘭氏染色顯微照片金黃色葡萄球菌無芽胞、鞭毛，大多數(shù)無莢膜。革蘭氏染色陽性回首頁附圖 2 金黃色葡萄球菌的平板菌落照片金黃色葡萄球菌營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長良好，需氧或兼性厭氧，最適生長溫度 37 G 最適生長 pH 7.4平板上菌落厚、有光澤、圓形凸起，直徑1-2mm 血平板菌落周圍形成透明的溶血環(huán)?；厥醉摳綀D 3 金黃色葡萄球菌在 BP 平板上的菌落形態(tài)金黃色葡萄球菌的單個(gè)菌落在Baird-Parker 瓊脂平板上呈圓形，表面光滑、凸起、濕潤，直徑 23mm 灰黑色至黑色，有光澤，常有淺色（非白色）的邊緣，周圍繞以不透明圈（沉淀）,其外常有一清晰帶。當(dāng)用接種針觸及菌落時(shí)具有黃 油樣粘稠感。有時(shí)可見