實驗二飲料中大腸菌群的測定

1、大腸桿菌的定義大腸桿菌的定義大腸桿菌（也稱大腸埃希氏菌），分類于腸桿菌科，歸屬于埃希氏菌屬。大腸桿菌指革蘭氏陰性無芽孢桿菌、乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣、IMViC試驗（靛基質(zhì)、MR、V-P、檸檬酸鹽試驗）為+-或-+-的細菌。與人類有關(guān)的大腸桿菌統(tǒng)稱為致瀉性大腸桿菌，包括五種：腸毒素性大腸桿菌（ETEC）、致病性大腸桿菌（EPEC）、出血性大腸桿菌（EHEC）、侵襲性大腸桿菌（EIEC）、黏附性大腸桿菌（EAEC）。大腸菌群和大腸桿菌的關(guān)系大腸菌群和大腸桿菌的關(guān)系衛(wèi)生學(xué)意義大腸菌群和大腸桿菌是評價衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標，作為食品中的糞便污染指標。食品中檢出大腸菌群，表明該食品有糞便污染，既可能有腸道致病菌存

2、在，因而也就有可能通過污染的食品引起腸道傳染病的流行。大腸菌群數(shù)的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對人體健康危害性的大小。大腸桿菌在外界存活時間與一些主要腸道致病菌接近，它的出現(xiàn)預(yù)示著某些腸道病原菌的存在，因此該菌是國際上公認的衛(wèi)生監(jiān)測指示菌。近年來，有些國家在執(zhí)行HACCP管理中，將大腸桿菌檢測作為微生物污染狀況的監(jiān)測指標和HACCP實施效果的評估指標。大腸桿菌的生物學(xué)特性基本形態(tài)： 此菌為兩端鈍圓的短小桿菌，一般約0.5-0.8m*1.0-3.0 m，多單獨存在或成雙，但不呈長鏈排列。約50%的菌株有周生鞭毛，但多數(shù)只有1-4根，一般不超過10根，故菌體動力弱。多數(shù)菌株有菌毛，有的有莢

3、膜或微莢膜，不形成芽孢，對普通堿性染料著色良好，革蘭氏染色陰性。大腸桿菌的生物學(xué)特性培養(yǎng)特性：大腸桿菌合成代謝能力強，在含無機鹽、銨鹽、葡萄糖的普通培養(yǎng)基上生長良好。最適生長溫度為37，在42-44 條件下仍能生長，生長溫度范圍15-46 。l 在普通營養(yǎng)瓊脂上有3種菌落形態(tài)： 1）光滑型：菌落邊緣整齊，表面有光澤、濕潤、 光滑、呈灰色，在生理鹽水中易分散； 2）粗糙型：菌落扁平、干澀、邊緣不整齊，易 在生理鹽水中自凝； 3）黏液型：常為含有莢膜的菌株。大腸菌群及大腸桿菌測定 MPN法檢驗流程（FDA BAM） 檢樣50g+450ml稀釋液 適當(dāng)十倍稀釋樣品選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液

4、，每個稀釋度接種三管LST肉湯（每管9ml LST肉湯并加有導(dǎo)管），每管接種1mL 35 ，24 2h 48 2h 沒有產(chǎn)氣管 有產(chǎn)氣管 報告陰性 接種BGLB肉湯管 接種EC肉湯 35 ，48 2h 44.50.5 （水浴培養(yǎng)） 24 2h 48 2h 查MPN表報告結(jié)果 產(chǎn)氣管接種EMB平板（35、1824h） （大腸菌群） 從EMB平板上挑取5個可疑菌轉(zhuǎn)接到PCA斜 面，進行革蘭氏染色、IMVC生化鑒定、接 種LST復(fù)檢產(chǎn)氣 查MPN表報告結(jié)果（大腸桿菌） 大腸菌群測定MPN法檢驗幾點說明MPNMPN檢索表：檢索表： MPN 為最大可能數(shù)(Most Probable Number)的簡稱

5、。這種方法，對樣品進行連續(xù)系列稀釋，加入培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，從規(guī)定的反應(yīng)呈陽性管數(shù)的出現(xiàn)率，用概率論來推算樣品中菌數(shù)最近似的數(shù)值。MPN檢索表只給了三個稀釋度，如改用不同的稀釋度，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低或增加10倍。初發(fā)酵和證實試驗：初發(fā)酵和證實試驗： 1）兩步法進行了兩次乳糖發(fā)酵試驗。初發(fā)酵和證實實驗所用培養(yǎng)基不同，但都是為了證實培養(yǎng)物是否符合大腸菌群的定義，即“在37分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣”。 LST中提供了磷酸鹽緩沖體系，氯化鈉可維持滲透壓，月桂基硫酸鈉可抑制非大腸菌群的生長，這個緩沖蛋白胨乳糖肉湯允許“緩慢乳糖發(fā)酵（Slow lactose fermentations）”來促進菌體產(chǎn)氣。BGLB中

6、膽鹽和煌綠可以抑制革蘭氏陽性細菌和除了大腸菌群的很多革蘭氏陰性細菌。 2）初發(fā)酵陽性管，不能肯定就是大腸菌群細菌，經(jīng)過證實試驗后，有時可能成為陰性。有數(shù)據(jù)表明，食品中大腸菌群檢驗步驟的符合率，初發(fā)酵與證實試驗相差較大。因此，在實際檢測工作中，證實試驗是必需的。產(chǎn)氣量與倒管：產(chǎn)氣量與倒管： 在乳糖發(fā)酵試驗工作中，經(jīng)?？梢钥吹皆诎l(fā)酵倒管內(nèi)極微少的氣泡（有時比小米粒還?。?，有時可以遇到在初發(fā)酵時產(chǎn)酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡。實驗表明，大腸菌群的產(chǎn)氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體，少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。如果對產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵如有疑問時，可以用手輕輕打動試管，如有氣泡沿管壁上浮，即

7、應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應(yīng)作進一步試驗。 大腸桿菌測定EMB選擇性分離鑒別EMB平板典型大腸桿菌菌落特征：中心黑色或紫紅色，有或無綠色金屬光澤大腸桿菌測定EMB選擇性分離鑒別EMB是一種弱選擇性培養(yǎng)基，一些球菌也可在該培養(yǎng)基上生長；高壓滅菌可使得美藍還原從而使培養(yǎng)基的顏色呈不均一橘黃色，輕輕搖動培養(yǎng)基可以恢復(fù)原有的正常紫色，傾注平板前應(yīng)先搖勻；大腸桿菌在該培養(yǎng)基上并不一定總是呈現(xiàn)綠色的金屬光澤；該培養(yǎng)基受可見光易使其中的成分氧化，儲存及培養(yǎng)細菌時都應(yīng)在避光條件。菌名菌落形態(tài)大腸埃希氏菌 紫黑色，有綠色金屬光澤肺炎克雷伯氏菌粉色，中心色深陰溝腸桿菌粉色，中心色深弗氏志賀氏菌無色鼠傷寒沙門氏菌 無

8、色糞鏈球菌無色大腸桿菌測定革蘭氏染色基本原理： 革蘭氏染色法是細菌學(xué)中廣泛使用的一種重要的鑒別染色法。1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。此法可將細菌分為革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌兩大類。 革蘭氏染色的機理主要是利用兩類細菌的細胞壁成分和結(jié)構(gòu)的不同。革蘭氏陰性菌的細胞壁中含有較多的類脂質(zhì)，而肽聚糖的含量較少。當(dāng)用酒精或丙酮酸脫色時，類脂質(zhì)被溶解，增加了細胞壁的通透性，使初染后的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細胞被脫色，經(jīng)復(fù)染后，又染上復(fù)染液的顏色。而革蘭氏陽性菌細胞壁中肽聚糖的含量多而且交聯(lián)度大，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)乙醇或丙酮洗脫后，肽聚糖層的孔徑變小，通透性降低，因此細胞仍保留初染時的顏色。大腸

9、桿菌測定革蘭氏染色基本步驟：將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染液，染1min，水洗；滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗；滴加95%乙醇脫色約1530s,直至染色液被洗掉，不要過分脫色，水洗；滴加番紅復(fù)染液，復(fù)染1min，水洗、待干、鏡檢。結(jié)果：革蘭氏陽性菌呈，革蘭氏陰性菌呈。大腸桿菌測定生化鑒定Testpositivenegativebiotype1biotype2reagentIndole紅色環(huán)不變色+-KovacsMR紅色不變色+甲基紅V-P玫瑰紅色環(huán)不變色-V-P甲、乙液Citrate生長不生長-實驗二實驗二 飲料中大腸菌群的測定飲料中大腸菌群的測定一、實驗?zāi)康囊弧嶒災(zāi)康?、學(xué)習(xí)飲料中大

10、腸菌群檢測程序、方法；、學(xué)習(xí)飲料中大腸菌群檢測程序、方法；2、掌握飲料中大腸菌群檢測結(jié)果的報告方式。、掌握飲料中大腸菌群檢測結(jié)果的報告方式。二、實驗材料二、實驗材料1、設(shè)備和材料、設(shè)備和材料溫箱、水浴鍋、天平、顯微鏡、均質(zhì)器或乳缽、溫度計、溫箱、水浴鍋、天平、顯微鏡、均質(zhì)器或乳缽、溫度計、平皿、試管、發(fā)酵管、吸管、載玻片、接種針平皿、試管、發(fā)酵管、吸管、載玻片、接種針2、培養(yǎng)基及試劑、培養(yǎng)基及試劑乳糖乳糖膽鹽發(fā)酵管、乳糖發(fā)酵管、蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑、膽鹽發(fā)酵管、乳糖發(fā)酵管、蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑、麥康凱、伊紅美藍瓊脂（麥康凱、伊紅美藍瓊脂（EMB）、革蘭氏染色液）、革蘭氏染色液GB4789.3-

11、2010 大腸菌群計數(shù)GB4789.3-2010 大腸菌群計數(shù)（一）最先準備的器材（一）最先準備的器材規(guī)格名稱 數(shù)量 用途1、500ml三角瓶 1個 稀釋樣品2、250ml三角瓶 1個 制EMB瓊脂3、18180mm試管 9支 單料乳糖膽鹽發(fā)酵管4、18180mm試管 3支 稀釋樣品（9ml）5、1ml移液管 5 支6、10ml移液管 3 支7、直徑為90mm平皿 2套制EMB平板8、250ml量筒 1支9、玻璃珠：直徑約5mm（二）應(yīng)滅菌消毒的器材（二）應(yīng)滅菌消毒的器材剪刀1把不銹鋼藥匙1把 滴管膠頭5只稱量紙適量（三）應(yīng)制備的培養(yǎng)基（三）應(yīng)制備的培養(yǎng)基 培養(yǎng)基 總量 所用容器l蒸餾水 22

12、5ml 500ml三角瓶l蒸餾水 9ml/ 3支 27ml 18180mm試管（稀釋樣品）l乳糖膽鹽發(fā)酵管（單料）： 10ml/ 9支 100ml18180mm試管(裝杜氏小管 )lEMB瓊脂： 1瓶 150ml 250ml三角瓶（每 組配一瓶）蛋白胨20g、膽鹽5g、乳糖10g、0.4%溴甲酚紫乙醇溶液25ml、蒸餾水1000ml（將蛋白胨、膽鹽及乳糖溶于水中，校正PH值至7.4，加入指示劑）；或購買制好的乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、按說明配置。分裝試管，每管10ml，并放入一個到氣管（杜氏小管），高壓滅菌115、15分鐘。雙料乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基除蒸餾水外，其它成分加倍。乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基：乳糖膽鹽

13、發(fā)酵培養(yǎng)基：P99 蛋白胨 10.0g 乳糖 10.0g 磷酸氫二鉀 2.0g 瓊脂 15.0g伊紅 0.4g美藍0.065g 或20ml 伊紅 (20g /L)和 10ml 美藍(6.5 g /L) 蒸餾水 1000.0mL最終pH7.10.2 (25) 先將蒸餾水中加入磷酸氫二鉀及蛋白胨、乳糖使之溶解，后加瓊脂加熱溶解，再調(diào)pH=7.2-7.4,再加入伊紅,美藍水溶液, 高壓滅菌115、15分鐘。 蛋白胨提供細菌生長發(fā)育所需的氮源、維生素和氨基酸，乳糖提供發(fā)酵所需的碳源，磷酸氫二鉀維持緩沖體系，伊紅Y和美藍抑制絕大部分革蘭氏陽性菌的生長。瓊脂是凝固劑。 大腸桿菌在EMB上發(fā)酵乳糖，形成黑色

14、菌落，大部分有金屬光澤。沙門氏菌形成無色菌落。金黃色葡萄球菌基本上不生長。 EMB（伊紅美藍瓊脂）（伊紅美藍瓊脂）質(zhì)控：質(zhì)控：此培養(yǎng)基呈紫色，可有細微沉淀。質(zhì)此培養(yǎng)基呈紫色，可有細微沉淀。質(zhì)控菌株接種后，控菌株接種后，3535培養(yǎng)培養(yǎng)18182424小時，小時，觀察結(jié)果應(yīng)如下表所示：觀察結(jié)果應(yīng)如下表所示：菌株 菌號 生長情況 菌落產(chǎn)氣腸桿菌 ATCC 13048 好 粉紅，無光澤大腸埃希氏菌 ATCC 25922 好，極好 有紫綠金屬光澤中心肺炎克雷伯氏菌 ATCC 13883 好 綠金屬光澤，有黑心奇異變形桿菌 ATCC 25933 好，極好 無色鼠傷寒沙門氏菌 ATCC 14028 好，極

15、好 無色金黃色葡萄球菌 ATCC 25923 被抑制 說明：（1）伊紅又稱署紅或四溴熒光素，為酸性染料。美藍又稱亞甲藍，為堿性染料。當(dāng)大腸桿菌分解乳糖產(chǎn)酸時，細菌帶正電荷，染上紅色，再與美藍結(jié)合而形成紫黑色菌落，并有綠色金屬光澤。二者除了作為指示劑外，還有抑制格蘭氏陽性菌的作用。（2）在堿性環(huán)境中，不分解乳糖產(chǎn)酸的細菌不著色。伊紅、美藍不能結(jié)合，故沙門氏菌和志賀氏菌等為無色或琥珀色半透明菌落。（3）此培養(yǎng)基用于鑒別大腸桿菌及產(chǎn)氣桿菌，并可快速鑒定白色念珠菌及鑒定凝固酶陽性葡萄球菌。美國公共衛(wèi)生協(xié)會和美國細菌協(xié)會推薦，用于增殖或鑒別大腸桿菌的檢查。但某些沙門氏菌、志賀氏菌可被抑制。培養(yǎng)基保存應(yīng)注

16、意避光防止氧化。 樣品1.酸奶12.鮮奶3.水樣14.水樣25.水樣36.水樣47.水樣58.酸奶2A1組組 酸奶1 A2A2組組 水樣1 A3組組 水樣2 A4組組 水樣3 B1B1組組 鮮奶 B2B2組組 水樣4 B3B3組組 水樣5 B4組組 酸奶2 三、實驗方法與三、實驗方法與步驟步驟1、采樣及稀釋、采樣及稀釋以無菌操作將檢樣以無菌操作將檢樣25g（或（或25ml）放于含有）放于含有225ml滅菌生理滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(nèi)（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(nèi)（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠）或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成珠）或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨

17、做成1：10的均勻稀釋的均勻稀釋液。固體檢樣最好用無菌均質(zhì)器，以液。固體檢樣最好用無菌均質(zhì)器，以800r/min1000r/min的的速度處理速度處理1min，做成，做成1：10的稀釋液。的稀釋液。用用1ml滅菌吸管吸取滅菌吸管吸取1：10稀釋液稀釋液1ml，注入含有，注入含有9ml滅菌生滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖混勻，做成理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖混勻，做成1：100的稀釋的稀釋液，換用液，換用1支支1ml滅菌吸管，按上述操作依次作滅菌吸管，按上述操作依次作10倍遞增稀釋倍遞增稀釋液液2. 乳糖初發(fā)酵試驗乳糖初發(fā)酵試驗 即通常所說的假定試驗。其目的在于檢查樣品中有無發(fā)即通常

18、所說的假定試驗。其目的在于檢查樣品中有無發(fā)酵乳糖產(chǎn)生氣體的細菌。酵乳糖產(chǎn)生氣體的細菌。 將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1ml以上以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管；者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管；1ml及及1ml以下者，用單料乳糖以下者，用單料乳糖發(fā)酵管。每一個稀釋度接種發(fā)酵管。每一個稀釋度接種3管，置（管，置（361）0C溫箱內(nèi)，培溫箱內(nèi)，培養(yǎng)（養(yǎng)（242）h，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報告，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)生者，則按下列程續(xù)進行為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)生者，則按下列程續(xù)進行根據(jù)食品衛(wèi)生要求或?qū)z驗樣

19、品污染情況估計，選擇三根據(jù)食品衛(wèi)生要求或?qū)z驗樣品污染情況估計，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種個稀釋度，每個稀釋度接種3管。也可直接用樣品接種。管。也可直接用樣品接種。10， 100, 1000 倍稀釋（倍稀釋（-1，-2，-3）3.分離培養(yǎng)分離培養(yǎng)（10倍稀釋倍稀釋） 將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍瓊脂板或麥康凱瓊將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍瓊脂板或麥康凱瓊脂平板上，置（脂平板上，置（361）0C溫箱內(nèi)，培養(yǎng)溫箱內(nèi)，培養(yǎng)18h24h，然后取出，然后取出，觀察菌落形態(tài)并作革蘭氏染色鏡檢和復(fù)發(fā)酵試驗。觀察菌落形態(tài)并作革蘭氏染色鏡檢和復(fù)發(fā)酵試驗。4.乳糖復(fù)發(fā)酵試驗乳糖復(fù)發(fā)酵試驗 即通常所說的證實試驗，其目的在于證明從乳糖初酵管即通常所說的證實試驗，其目的在于證明從乳糖初酵管試驗呈陽性反應(yīng)的試管內(nèi)分離到的革蘭氏陰性無芽胞桿菌，試驗呈陽性反應(yīng)的試管內(nèi)分離到的革蘭氏陰性無芽胞桿菌，確能發(fā)酵乳糖產(chǎn)生氣體。確能