基因擴(kuò)增與重排

1、基因擴(kuò)增與基因重排基因擴(kuò)增與基因重排遺傳學(xué)遺傳學(xué)基因擴(kuò)增的定義:基因擴(kuò)增（gene amplification):細(xì)胞內(nèi)某些特定基因的拷貝數(shù)專一性的增加,它是細(xì)胞在短期內(nèi)為滿足某種需要而產(chǎn)生足夠基因產(chǎn)物的 一種調(diào)控手段。v為滿足正常的生長(zhǎng)發(fā)育為滿足正常的生長(zhǎng)發(fā)育 兩棲類和昆蟲的卵母細(xì)胞兩棲類和昆蟲的卵母細(xì)胞rRNA基因的擴(kuò)增基因的擴(kuò)增 果蠅濾泡細(xì)胞卵殼蛋白的基因擴(kuò)增現(xiàn)象果蠅濾泡細(xì)胞卵殼蛋白的基因擴(kuò)增現(xiàn)象v外界環(huán)境因素引起的基因擴(kuò)增外界環(huán)境因素引起的基因擴(kuò)增 藥物誘導(dǎo)抗藥性基因的擴(kuò)增藥物誘導(dǎo)抗藥性基因的擴(kuò)增 腫瘤細(xì)胞中原癌基因拷貝數(shù)異常增加腫瘤細(xì)胞中原癌基因拷貝數(shù)異常增加 許多致癌劑可誘導(dǎo)許多致

2、癌劑可誘導(dǎo)DNA擴(kuò)增擴(kuò)增體細(xì)胞體細(xì)胞rDNA500拷貝拷貝1.爪蟾卵細(xì)胞內(nèi)的rRNA(rDNA)的擴(kuò)增 注：注： rDNA：基因組中編碼核糖體RNA（rRNA）分子的對(duì)應(yīng)的DNA序列。 rRNA：rDNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，它是構(gòu)成核糖體的重要成分，核糖體由許多小的rRNA分子組裝而成。卵細(xì)胞卵細(xì)胞rDNA約約2000000拷貝真核細(xì)胞真核細(xì)胞rRNA基因?yàn)榇?lián)重復(fù)序列基因?yàn)榇?lián)重復(fù)序列:由由18S、5.8S和和28SrRNA基因組成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位基因組成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位,彼此間隔分開彼此間隔分開,重復(fù)單位之間的間隔重復(fù)單位之間的間隔DNA序列不轉(zhuǎn)序列不轉(zhuǎn)錄錄.由于間隔區(qū)中的串聯(lián)重復(fù)次數(shù)不同，由于間隔區(qū)中的

3、串聯(lián)重復(fù)次數(shù)不同，因此，不同間隔區(qū)的長(zhǎng)短差異很大。因此，不同間隔區(qū)的長(zhǎng)短差異很大。020406080100120一月二月三月四月亞洲區(qū)歐洲區(qū)北美區(qū) 生物生物 重復(fù)單位長(zhǎng)度重復(fù)單位長(zhǎng)度非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)長(zhǎng)度非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)長(zhǎng)度 轉(zhuǎn)錄區(qū)長(zhǎng)度轉(zhuǎn)錄區(qū)長(zhǎng)度 釀酒酵母 黑腹果蠅 非洲爪蟾 小鼠 8950 1150014200 1050013500 4400 1750 37506450 23005300 30000 7200 7750 7875 13400 rRNA基因簇串聯(lián)重復(fù)單位的不同長(zhǎng)度基因簇串聯(lián)重復(fù)單位的不同長(zhǎng)度單位：bp 5SrRNA基因在基因組中呈串聯(lián)重復(fù)排列成基因簇?；蛟诨蚪M中呈串聯(lián)重復(fù)排列成基因簇

4、。5S基基因因與非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)相間排列，組成一個(gè)重復(fù)單位。在爪蟾體細(xì)與非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)相間排列，組成一個(gè)重復(fù)單位。在爪蟾體細(xì)胞中胞中5SrRNA基因約有基因約有500拷貝，而在卵細(xì)胞中拷貝，而在卵細(xì)胞中5S基因可重基因可重復(fù)復(fù)20000多次。這大概是為了和卵細(xì)胞中大量擴(kuò)增的多次。這大概是為了和卵細(xì)胞中大量擴(kuò)增的28S和和18S基因相統(tǒng)一。基因相統(tǒng)一。5SrRNA基因沒有基因擴(kuò)增現(xiàn)象基因沒有基因擴(kuò)增現(xiàn)象rDNA的擴(kuò)增的擴(kuò)增 rDNA是采用是采用滾環(huán)式復(fù)制滾環(huán)式復(fù)制方式在核仁區(qū)進(jìn)行的方式在核仁區(qū)進(jìn)行的擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)生的新擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)生的新rDNA不納入線形染色體不納入線形染色體中，而是一環(huán)狀小中，而是一環(huán)

5、狀小DNA分子方式存在。分子方式存在。滾環(huán)式復(fù)制：雙鏈DNA環(huán)狀分子先在一條單鏈的復(fù)制起點(diǎn)上產(chǎn)生一個(gè)切口(nick)，然后以另一條單鏈為模板不斷地合成新的單鏈。釋放出的新合成的單鏈或是先復(fù)制成雙鏈DNA，被酶切割成單位長(zhǎng)度后，再形成環(huán)狀雙鏈DNA分子；或是釋放出的新合成的單鏈DNA，先被酶切割成單位長(zhǎng)度形成單鏈環(huán)狀DNA分子后再復(fù)制成雙鏈環(huán)狀DNA分子。 果蠅在卵巢成熟之前，卵巢顆粒細(xì)胞中的卵殼蛋白基因被擴(kuò)增。果蠅的卵母細(xì)胞經(jīng)過4次分裂，形成1個(gè)卵母細(xì)胞和15個(gè)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞（為卵母細(xì)胞提供蛋白質(zhì)及其它營(yíng)養(yǎng)）。營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞通過胞漿橋與卵細(xì)胞相連，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)順利進(jìn)入正在增大的卵細(xì)胞。多次特殊的DNA復(fù)制，

6、卵殼蛋白等基因拷貝數(shù)顯著增加。2. 果蠅濾泡細(xì)胞卵殼蛋白的基因擴(kuò)增現(xiàn)象果蠅濾泡細(xì)胞卵殼蛋白的基因擴(kuò)增現(xiàn)象DNA不切離的多次擴(kuò)增形成復(fù)制泡的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不切離的多次擴(kuò)增形成復(fù)制泡的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)外界環(huán)境因素引起的基因擴(kuò)增外界環(huán)境因素引起的基因擴(kuò)增1.在培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞中在培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞中,已知對(duì)雙氧葉酸還原酶已知對(duì)雙氧葉酸還原酶(DHFR)的抑制劑甲氨蝶呤的抑制劑甲氨蝶呤(methotrexate)具有耐藥性的細(xì)具有耐藥性的細(xì)胞胞,其其dhfr基因增加達(dá)基因增加達(dá)1000個(gè)拷貝個(gè)拷貝,這已使用于對(duì)基這已使用于對(duì)基因擴(kuò)增機(jī)制的分析等因擴(kuò)增機(jī)制的分析等.2.細(xì)胞受到藥物攻擊后細(xì)胞受到藥物攻擊后,為抵抗藥物作用為

7、抵抗藥物作用,需產(chǎn)生抗性需產(chǎn)生抗性基因的產(chǎn)物基因的產(chǎn)物去破壞它去破壞它,最直接有效的辦法是大量最直接有效的辦法是大量增加增加抗性基因的數(shù)目抗性基因的數(shù)目,使抗性基因的產(chǎn)物隨之大量增加使抗性基因的產(chǎn)物隨之大量增加.v基因擴(kuò)增是基因表達(dá)增加的一種重要機(jī)理。v基因擴(kuò)增與抗藥性有關(guān)?；蛑嘏舦定義:DNA分子的核苷酸序列的重新排布,序列的重排可形成新的基因,還可調(diào)節(jié)基因的表達(dá).通過基因的轉(zhuǎn)座，DNA的斷裂錯(cuò)接而使正?；蝽樞虬l(fā)生改變。 基因重排v 定向重排與變換v非定向重排定向重排與變換定向重排可使一個(gè)基因從遠(yuǎn)離其啟動(dòng)子的位置移到啟動(dòng)子附近位點(diǎn)而被啟動(dòng)?；虮磉_(dá)的變換環(huán)境條件引起的基因變化小鼠免疫球蛋

8、白結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)當(dāng)免疫細(xì)胞分化時(shí)，當(dāng)免疫細(xì)胞分化時(shí)，染色體定向重排染色體定向重排把把3個(gè)遠(yuǎn)離的基因連在一起，個(gè)遠(yuǎn)離的基因連在一起，因因由于由于V、C、J基因的不同組合造成了抗體的多樣性。基因的不同組合造成了抗體的多樣性。基因表達(dá)的變換 由于DNA片段缺失片段缺失使調(diào)控區(qū)和新基因受體連連接成新調(diào)控啟動(dòng)基因接成新調(diào)控啟動(dòng)基因，使原來無活性基因轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚?。（如（如酵母?xì)胞性別的轉(zhuǎn)換酵母細(xì)胞性別的轉(zhuǎn)換）酵母菌的生活周期酵母菌的生活周期 a單倍體 a單倍體 a單倍體 單倍體單倍體單倍體 a / 二倍體M A T aM A T aM A T M A T M A T aM A T aM A T M A T

9、 a 因子 因子受體受體性因子與受體接合接合二倍體形成子囊形成酵母菌的生活史和細(xì)胞特征酵母菌的生活史和細(xì)胞特征v1. 酵母菌的生活史和細(xì)胞特征酵母菌的生活史和細(xì)胞特征 單倍體細(xì)胞單倍體細(xì)胞 二倍體細(xì)胞二倍體細(xì)胞 單倍體細(xì)胞單倍體細(xì)胞v2. 酵母的接合型轉(zhuǎn)換酵母的接合型轉(zhuǎn)換 a細(xì)胞細(xì)胞 細(xì)胞細(xì)胞 細(xì)胞細(xì)胞 a細(xì)胞細(xì)胞v3. 酵母細(xì)胞接合型決定因子基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)酵母細(xì)胞接合型決定因子基因結(jié)構(gòu)及表達(dá) HML, HMR, MAT, HO; 信號(hào)傳遞和調(diào)控基因信號(hào)傳遞和調(diào)控基因v4. 酵母接合型轉(zhuǎn)換模型酵母接合型轉(zhuǎn)換模型-磁帶模型磁帶模型 活動(dòng)磁帶盒和沉默磁帶盒活動(dòng)磁帶盒和沉默磁帶盒 接合型控制的幾種活

10、性接合型控制的幾種活性 酵母接合型轉(zhuǎn)換模型酵母接合型轉(zhuǎn)換模型-磁帶模型磁帶模型S l ie n t c a s s e t t eA c ti v e c a s s e t t eS l ie n t c a s s e t t eF r e q u e n tF r e q u e n tH M LM A TH M RaaH M LM A TH M RaH M LM A TH M RaaH M LM A TH M RaaHML和和HMR兩個(gè)基因貯存了兩種接合型等位基因，兩個(gè)基因貯存了兩種接合型等位基因，當(dāng)轉(zhuǎn)座當(dāng)轉(zhuǎn)座給給MAT基因座時(shí)就發(fā)生了接合型的轉(zhuǎn)換?；蜃鶗r(shí)就發(fā)生了接合型的轉(zhuǎn)換。因此，

11、因此，MAT基因座基因座是通過轉(zhuǎn)座而轉(zhuǎn)換其接合型的。是通過轉(zhuǎn)座而轉(zhuǎn)換其接合型的。MAT基因座的序列轉(zhuǎn)換成另基因座的序列轉(zhuǎn)換成另一個(gè)基因的序列，一個(gè)基因的序列， 非定向重排非定向重排 例如轉(zhuǎn)座子在染色體上的移動(dòng)，轉(zhuǎn)座子的插例如轉(zhuǎn)座子在染色體上的移動(dòng)，轉(zhuǎn)座子的插入可激活或抑制某些基因。如順向末端重復(fù)入可激活或抑制某些基因。如順向末端重復(fù)序列的轉(zhuǎn)座可能導(dǎo)致某些片段的缺失而使啟序列的轉(zhuǎn)座可能導(dǎo)致某些片段的缺失而使啟動(dòng)子鄰近結(jié)構(gòu)基因而使其轉(zhuǎn)錄。動(dòng)子鄰近結(jié)構(gòu)基因而使其轉(zhuǎn)錄。 環(huán)境因素也引起基因重排環(huán)境因素也引起基因重排 改變環(huán)境溫度、水分和改變環(huán)境溫度、水分和pH等條件，可使植物等條件，可使植物改變了的表

12、型得到遺傳。環(huán)境引起的穩(wěn)定變改變了的表型得到遺傳。環(huán)境引起的穩(wěn)定變異很可能起因于某些異很可能起因于某些DNA序列的不等復(fù)制、序列的不等復(fù)制、不等變換或某些染色體外因子導(dǎo)致的基因重不等變換或某些染色體外因子導(dǎo)致的基因重排。排?？偨Y(jié)總結(jié)v基因重排重排廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物的體基因重排重排廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物的體細(xì)胞基因組中細(xì)胞基因組中;v基因重排可能導(dǎo)致基因重排可能導(dǎo)致DNA順序的變化，順序的變化，DNA的擴(kuò)增、的擴(kuò)增、丟失或修飾；丟失或修飾；v基因重排可能產(chǎn)生新基因，用于特定環(huán)境中的表達(dá)，基因重排可能產(chǎn)生新基因，用于特定環(huán)境中的表達(dá)，如動(dòng)物的免疫球蛋白；如動(dòng)物的免疫球蛋白；v基因重

13、排可能是改變已有基因的表達(dá)模式，用于調(diào)基因重排可能是改變已有基因的表達(dá)模式，用于調(diào)控其他基因的表達(dá)。控其他基因的表達(dá)。DNA重排技術(shù)DNA重排又叫有性重排又叫有性PCR、分子雜交等、分子雜交等,是一種反復(fù)是一種反復(fù)性突變、重組過程性突變、重組過程,它是它是將一組緊密相關(guān)的核酸序列將一組緊密相關(guān)的核酸序列隨機(jī)片段化隨機(jī)片段化,這些片段通過自配對(duì)這些片段通過自配對(duì)PCR或重組裝或重組裝PCR延伸延伸,最后組裝成一個(gè)完整的全長(zhǎng)核酸序列最后組裝成一個(gè)完整的全長(zhǎng)核酸序列,在在這個(gè)過程中就引入了突變并進(jìn)行了重組這個(gè)過程中就引入了突變并進(jìn)行了重組,這樣通過這樣通過核酸序列的迅速進(jìn)化核酸序列的迅速進(jìn)化,就可提

14、高核酸序列或其編碼就可提高核酸序列或其編碼的蛋白的功能。的蛋白的功能。DNA重排技術(shù)步驟v目的目的DNA片段的獲得片段的獲得v隨機(jī)片段化隨機(jī)片段化v重組裝重組裝PCR/無引物無引物PCRv篩選或選擇篩選或選擇基因重排技術(shù)的應(yīng)用v單基因的定向改造；單基因的定向改造；v序列相關(guān)基因的重排；序列相關(guān)基因的重排；v生物代謝途徑的改造；生物代謝途徑的改造；v對(duì)整個(gè)基因組的改造對(duì)整個(gè)基因組的改造利用利用DNA重排技術(shù)已經(jīng)成功地對(duì)許多單基因重排技術(shù)已經(jīng)成功地對(duì)許多單基因如工業(yè)用酶、抗體以及一些重要蛋白等進(jìn)行如工業(yè)用酶、抗體以及一些重要蛋白等進(jìn)行了定向改造了定向改造,使酶活性、底物特異性以及抗體使酶活性、底物

15、特異性以及抗體親和性、蛋白的功能、熱穩(wěn)定性等得到了明親和性、蛋白的功能、熱穩(wěn)定性等得到了明顯提高顯提高,DNA重排既可以對(duì)單一代謝途徑進(jìn)行優(yōu)化重排既可以對(duì)單一代謝途徑進(jìn)行優(yōu)化,又又可以同時(shí)對(duì)多個(gè)代謝途徑進(jìn)行組合性改造可以同時(shí)對(duì)多個(gè)代謝途徑進(jìn)行組合性改造,形形成多樣性的合成途徑成多樣性的合成途徑,導(dǎo)致生物小分子多樣性導(dǎo)致生物小分子多樣性的出現(xiàn)的出現(xiàn),產(chǎn)生產(chǎn)生“非天然非天然”的天然小分子文庫的天然小分子文庫,用用于先導(dǎo)化合物的篩選于先導(dǎo)化合物的篩選展望DNA重排目前已經(jīng)可以在單一基因、單一代謝途徑甚至整重排目前已經(jīng)可以在單一基因、單一代謝途徑甚至整個(gè)基因組等各個(gè)層面用于體外進(jìn)化個(gè)基因組等各個(gè)層面用于體外進(jìn)化,如果與合適的選擇或篩選如果與合適的選擇或篩選壓力結(jié)合壓力結(jié)合,將在多方面特別是醫(yī)藥方面得到廣泛應(yīng)用。如用將在多方面特別是醫(yī)藥方面得到廣泛應(yīng)用。如用于于DNA序列的改造序列的改造,可以提供更好的可以提供更好的DNA疫苗、蛋白表達(dá)、疫苗、蛋白表達(dá)、基因治療、轉(zhuǎn)基因載體基因治療、轉(zhuǎn)基因載體;用于特定蛋白的改造用于特定蛋白的改造,可以提供特異可以提供特異性