液相色譜法分離手性藥物課件

1、液相色譜法分離手性藥物液相色譜法分離手性藥物液相色譜法分離手性藥物概念n許多藥物中存在著分子組成與構(gòu)造完全相同但分子的立體結(jié)構(gòu)不同的化合物，他們是立體異構(gòu)體，不能完全疊合但能互為鏡像，（如左手與右手），這就是手性手性(chirality)。NNHOOOO沙利度胺（反應(yīng)停）液相色譜法分離手性藥物手性藥物n藥物作用的靶分子都是手性的，因此藥物分子與靶分子的不對(duì)稱(chēng)性必須相匹配（手性識(shí)別手性識(shí)別手與手套）。n另外，分子藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，含有手性因素的化學(xué)藥物對(duì)映體，在人體內(nèi)的藥理活性、代謝過(guò)程和毒性存在著顯著差異。在通常情況下，只有一個(gè)對(duì)映體具有藥理作用，而另一個(gè)對(duì)映體不僅無(wú)藥理作用，還會(huì)產(chǎn)生一定副作用

2、。n如20世紀(jì)60年代，鎮(zhèn)靜藥反應(yīng)停（thalidomide,沙利度胺）的消旋體用作緩解妊辰反應(yīng)作用，后來(lái)發(fā)現(xiàn)在歐洲服用過(guò)的孕婦不少產(chǎn)下海豚狀畸形兒。隨后研究表明：反應(yīng)停右旋體（R型）有鎮(zhèn)靜作用，左旋體（S型)具有胚胎毒性和致畸作用。液相色譜法分離手性藥物研究背景n1992年FDA發(fā)布手性藥物指導(dǎo)原則，要求所有在美國(guó)上市的消旋體新藥，生產(chǎn)者均需提供詳細(xì)報(bào)告，說(shuō)明藥物中所含對(duì)映體各自的藥理作用、毒性和效果。n顯然，單一異構(gòu)體的試驗(yàn)次數(shù)比較單純，經(jīng)濟(jì)上更合算。 n目前普遍使用的2000多種合成藥物中有600余種為手性藥物，而活性的單一對(duì)映體藥物不足100種，其它500余種都是左右旋混在一起的消旋體

3、藥物。n1999年，手性藥物市場(chǎng)第一次超過(guò)1000億美元，單一異構(gòu)體藥物銷(xiāo)售額達(dá)到1150億美元，占世界藥品市場(chǎng)3600億美元的32%。 液相色譜法分離手性藥物常用的手性藥物測(cè)定技術(shù)n高效液相色譜高效液相色譜 (HPLC)n氣相色譜 (GC)(樣品需具有一定的揮發(fā)性及熱穩(wěn)定性）n毛細(xì)管電泳(HPCE)n超臨界流體色譜（SFC)液相色譜法分離手性藥物HPLCn80年代初HPLC法迅速成為藥物對(duì)映體分離和測(cè)定最為廣泛應(yīng)用的方法。n特別適用于極性強(qiáng)、熱穩(wěn)定性差的手性藥物的分析。nHPLC用于手性分離概括起來(lái)可分為兩大途徑：間接(CDR)和直接(CMPA、CSP)方法。液相色譜法分離手性藥物液相色譜法

4、分離手性藥物n直接法（CMPA、CSP）： 對(duì)映體之一與手性固定相或手性流動(dòng)相添加劑間發(fā)生分子間的三點(diǎn)作用（較穩(wěn)定），另一對(duì)映體發(fā)生兩點(diǎn)作用；形成暫時(shí)的非對(duì)映異構(gòu)體的結(jié)合物質(zhì)，通過(guò)洗脫分離。n間接法（CDR)n又稱(chēng)為非對(duì)映體拆分法或柱前手性手性衍生化法n對(duì)映體混合物在預(yù)處理中進(jìn)行柱前衍生組成一對(duì)非對(duì)映體(Diastereoisomers) ，依其理化性質(zhì)的差異，在非手性柱上得以分離。 液相色譜法分離手性藥物間接法：柱前衍生n優(yōu)點(diǎn)： *可采用通用的非手性柱分離； *通過(guò)衍生化可提高檢測(cè)靈敏度； *分離條件簡(jiǎn)單； *分離效果好n缺點(diǎn)： *要有可被衍生化的基團(tuán)； *要有高光學(xué)純度的手性試劑； *對(duì)個(gè)

5、對(duì)映體衍生化率速和平衡常數(shù)應(yīng)一致； *衍生化和色譜過(guò)程中不能發(fā)生消旋化；液相色譜法分離手性藥物 直接法：n手性流動(dòng)相添加劑（CMPA）法： （又可稱(chēng)為手性手性流動(dòng)相(CMP)拆分法或手性手性洗脫法） & 環(huán)糊精(Cyclodextrins)類(lèi)（主要是-、-和-環(huán)糊精及其衍生物）； & 手性離子對(duì)配合劑(Chiral Ion Pair Complex,CIPC)，如（+）-10-樟腦磺酸、奎寧和奎尼丁等； & 配位體交換型手性流動(dòng)相添加劑（Chiral Ligand-exchange Complexs, CLEC) 。n手性固定相（CSP）法液相色譜法分離手性藥物手性固定

6、相（CSP）法n優(yōu)點(diǎn)是：優(yōu)點(diǎn)是： 能廣泛適用于各類(lèi)化合物，適于常規(guī)及生物樣品的分析測(cè)定；能廣泛適用于各類(lèi)化合物，適于常規(guī)及生物樣品的分析測(cè)定； 除非必須衍生化，否則無(wú)需高光學(xué)純度試劑；除非必須衍生化，否則無(wú)需高光學(xué)純度試劑； 樣品處理步驟簡(jiǎn)單。樣品處理步驟簡(jiǎn)單。 制備分離方便，定量分析的可靠性較高；制備分離方便，定量分析的可靠性較高； n缺點(diǎn)是：缺點(diǎn)是： 樣品有時(shí)也須作柱前衍生（但不一定是手性衍生化試劑），樣品有時(shí)也須作柱前衍生（但不一定是手性衍生化試劑）， 對(duì)樣品結(jié)構(gòu)有一定限制，其適用性尚不及普通對(duì)樣品結(jié)構(gòu)有一定限制，其適用性尚不及普通HPLC固定相固定相（包括正相和反相）那樣廣泛。（包括正

7、相和反相）那樣廣泛。 迄今為止，迄今為止，CSPCSP柱商品已有柱商品已有4040多種，價(jià)格大多昂貴，尚未有一多種，價(jià)格大多昂貴，尚未有一種具有類(lèi)似種具有類(lèi)似ODSODS柱的普遍適用性。柱的普遍適用性。液相色譜法分離手性藥物常用的手性固定相（CSP）法 & 刷（Brush）型或稱(chēng)為Prikle型& 手性聚合物固定相（如纖維素、淀粉，合成的手性手性聚合物固定相（如纖維素、淀粉，合成的手性聚合物）聚合物）； & 含肽或蛋白質(zhì)手性固定相； & 含環(huán)糊精（Cyclodextrin）及其衍生物的手性固定相； & 大環(huán)抗生素（Macrocyclic antibiot

8、ics）型& 配位交換（|Ligand exchange）型 & 冠醚（Crown ethers）型液相色譜法分離手性藥物n在手性拆分中，溫度溫度的影響是很顯著的。低溫增加手性識(shí)別能力，但可能引起色譜峰變寬而導(dǎo)致分離變差。因此確定手性分析方法過(guò)程中要考慮柱溫的影響，確定最優(yōu)柱溫。n根據(jù)分子結(jié)構(gòu)分子結(jié)構(gòu)選擇合適的CSP柱是非常重要的。nChiral Technologies Europe(法國(guó))和Chiral Technologies(美國(guó)，是日本Daicel化學(xué)工業(yè)公司的全資子公司 )是專(zhuān)門(mén)為制藥和農(nóng)業(yè)化學(xué)及相關(guān)工業(yè)提供對(duì)映體分離服務(wù)的公司。服務(wù)的領(lǐng)域包括分析方法的開(kāi)發(fā)和cGM

9、P噸級(jí)單一對(duì)映體的分離和商業(yè)規(guī)模工藝的開(kāi)發(fā)等。n手性聚合物固定相商品柱主要是日本Daicel公司制造的Chiralcel柱。nDaicel固定相的廣泛選擇性和高負(fù)載性能，使Chiral Technologies及整個(gè)Daicel集團(tuán)成為手性色譜產(chǎn)品和服務(wù)市場(chǎng)的領(lǐng)先者。Daicel的手性固定相是以纖維素為基礎(chǔ)的，如將甲酰(3，5-二甲苯胺)基引入纖維素的羥基。合適的CSP柱液相色譜法分離手性藥物手性聚合物固定相Chiralcel柱類(lèi)型與應(yīng)用 手性聚合物固定相手性聚合物固定相Chiralcel柱類(lèi)型與應(yīng)用柱類(lèi)型與應(yīng)用柱型號(hào)柱型號(hào)Chiralcel OAChiralcel OBChiralcel O

10、CChiralcel ODChiralcel OEChiralcel OFChiralcel OGChiralcel OJChiralcel OKChiralcel ADChiralcel ASChiralcel OT(+)Chiralcel O(+)聚三苯甲基乙丁烯酸酯酯，酰胺，含磷化合物，芳香化合物酯，酰胺，含磷化合物，芳香化合物聚吡啶二苯甲基乙丁烯酸酯酯，酰胺，含磷化合物酯，酰胺，含磷化合物淀粉三（3，5-二甲苯基氨基甲酸酯）生物堿，胺，莨菪堿，受體拮抗劑生物堿，胺，莨菪堿，受體拮抗劑淀粉三（S）-1-苯乙基氨基甲酸酯）生物堿，胺，莨菪堿生物堿，胺，莨菪堿纖維素三（對(duì)甲苯基甲酸酯）甲基芳

11、基酯，甲氧基芳基酯甲基芳基酯，甲氧基芳基酯纖維素三肉桂酸酯芳香化合物芳香化合物纖維素三（對(duì)氯苯基氨基甲酸酯）內(nèi)酰胺，生物堿，二氫吡啶內(nèi)酰胺，生物堿，二氫吡啶纖維素三（對(duì)甲苯基氨基甲酸酯）內(nèi)酰胺，生物堿內(nèi)酰胺，生物堿纖維素（3，5-二甲苯基氨基甲酸酯）生物堿，胺，莨菪堿，受體拮抗劑生物堿，胺，莨菪堿，受體拮抗劑纖維素二芐醚芳香化合物芳香化合物纖維素三苯甲酸酯脂肪酸族和芳香族小分子化合物脂肪酸族和芳香族小分子化合物纖維素三苯氨基甲酸酯環(huán)戊烯酮類(lèi)環(huán)戊烯酮類(lèi)固定相，官能團(tuán)固定相，官能團(tuán)拆分化合物類(lèi)型拆分化合物類(lèi)型纖維素三乙酯脂肪酸族小分子化合物脂肪酸族小分子化合物液相色譜法分離手性藥物經(jīng)驗(yàn)nCHIRA

12、LPAK AD-H CHIRALCEL OD-H(50-60%)nCHIRALCEL OJ-H # CHIRALPAK AS-H (20%)液相色譜法分離手性藥物DAICEL 柱使用的溶劑n流動(dòng)相采用烷烴-醇混合物體系（主要是正己烷正己烷-異丙醇異丙醇），極性溶劑乙醇、甲醇、乙腈容許存在。n以下溶劑一點(diǎn)也不可以存在（會(huì)破壞柱子）： 丙酮、氯仿、丙酮、氯仿、DMF、DMSO、THF、甲苯、乙甲苯、乙酸乙酯、二氯甲烷、吡啶酸乙酯、二氯甲烷、吡啶 液相色譜法分離手性藥物流動(dòng)相添加劑n酸性化合物：TFA乙酸、甲酸n堿性化合物：DEA乙醇胺、丁醇胺n加入量0.1-0.2，不超過(guò)0.5。n柱子穩(wěn)定的PH范圍：2.0-7.0。液相色譜法分離手性藥物樣品溶解性n樣品含量0.5mg/ml1.0mg/ml.n酸性化合物和堿性鹽，可加添加劑來(lái)增加樣品的溶解性。n仍不好溶，可溶于100醇（甲醇、乙醇、異丙醇）;若流動(dòng)相中有烷烴則不可用乙腈若流動(dòng)相中有烷烴則不可用乙腈.n水溶性化合物最好用反相柱，如OD-R、OD-RH、OJ-RH、AD-RH、AS-RH; 可用醇-水、乙腈-水作流動(dòng)相。液相色譜法分離手性藥物柱子壓力過(guò)高n原因：可能是雜質(zhì)堵住了柱頭（frit）