堿性裂解液提取DNA法在環(huán)氧化酶亞型基因敲除小鼠基因型鑒定中的應用

1、描述：目的：應用堿性裂解液法提取的DNA鑒定環(huán)氧化酶（COX）亞型基因敲除小鼠，為鑒定純合子小鼠提供一種方便快捷、低成本、可靠的實驗方法。方法：取子代 小鼠耳緣組織于EP管中，用堿性裂解液提取基因組DNA，.【摘要】 目的：應用堿性裂解液法提取的DNA鑒定環(huán)氧化酶（COX）亞型基因敲除小鼠，為鑒定純合子小鼠提供一種方便快捷、低成本、可靠的實驗方法。方法：取子代 小鼠耳緣組織于EP管中，用堿性裂解液提取基因組DNA，PCR擴增COX-1和COX-2基因片段，通過瓊脂糖凝膠電泳對小鼠基因型作出鑒定。結果：堿 性裂解液法提取的DNA能應用于子代小鼠的不同基因型的鑒定，即野生型（COX-1+

2、/+；COX-2+/+）、雜合子（COX-1+/-；COX-2+ /-）和純合子（COX-1-/-；COX-2-/-）。結論：建立了堿性裂解液提取DNA法，并將該法成功應用于環(huán)氧化酶亞型基因敲除小鼠基因型鑒定中。環(huán)氧化酶（COX）催化花生四烯酸（arachidonic acid，AA）產(chǎn)生前列腺素類物質(zhì)，其中在心血管系統(tǒng)主要是前列環(huán)素（PGI2）和血栓烷A2（TxA2），COX作為AA代謝中主要的關鍵限速酶之 一，在心血管方面發(fā)揮重要的病理生理作用。COX主要包括COX-1和COX-2兩種亞型，由于現(xiàn)階段COX亞型選擇性抑制劑存在著非特異性作用， 因此基因敲除小鼠對進一步明確COX亞型的生理及

3、病理生理功能具有重要作用，進而建立COX亞型基因敲除小鼠的鑒定方法也就尤為重要。目前，國內(nèi)基 因敲除小鼠鑒定中DNA的提取主要有兩種方法，第一種即采用蛋白酶K消化后用經(jīng)典酚氯仿提取法：通過有機溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)，再加入乙 醇即可使DNA分離出來；第二種即基因組DNA試劑盒提取法：通過裂解細胞釋放出基因組DNA，然后加入核糖核酸酶A去除RNA，接著選擇性沉淀去除蛋 白，最后通過異丙醇沉淀并重溶解于DNA溶解液。堿性裂解液提取DNA法鮮見報道。因此，本實驗將建立一種用堿性裂解液提取DNA的方法，為 COX亞型基因敲除小鼠鑒定提供更為方便、經(jīng)濟、快速的方法。1 資料與方法1.1 一

4、般資料 實驗動物：COX亞型基因敲除小鼠引進于北京大學醫(yī)學部生理系，基因背景為COX-1+/-的雜合子小鼠2雌1雄，基因背景為COX-2+/-的雜合子小 鼠2雌1雄，共6只。試劑：PCR試劑盒、DNA marker購自大連寶生物工程有限公司；PCR引物由上海英駿生物技術有限公司合成；重要溶液地配制：溶液A，即NaOH溶液，成分為25 mmol/L NaOH、2 mmol/L EDTA，溶液B的成分為40 mmol/L Tris·HCl，pH值為8.0。儀器：干式恒溫器（奧盛儀器有限公司，中國），PCR擴增儀（ABI公司，美國），電泳儀（北京六一儀器廠，中國）。1.2 方法1.2.1

5、基因組DNA提取 COX基因敲除小鼠按照SPF級動物飼養(yǎng)標準進行飼養(yǎng)。溫度控制在22 ，光照周期為12 h黑暗，12 h光照；籠具、墊料、飼料和飲水均經(jīng)過高溫高壓滅菌處理后使用；自由取食和飲水，墊料一周更換兩次。采用1雄和2雌合籠方式進行繁殖。在子代小鼠斷乳打耳 號進行標記時，留取小鼠耳緣組織于1.5 mL EP管中，加入100 L溶液A，于干式恒溫器100 孵育30 min。再加入100 L溶液B，充分震蕩混勻、離心，放入4 冰箱備用。1.2.2 基因組DNA擴增 （1）COX-1引物序列：WT-S：5-AGGAGATGGCTGCTGAGTTGG-3，KO-S：5-GCAGCCTCTGTTC

6、CACATACAC- 3，WT/KO-AS：5-AATCTGACTTTCTGAGTTGCC-3。目的基因片段長度為601 bp。各種基因型小鼠擴增片段為：COX-1-/-：646 bp；COX-1+/-：601 bp和646 bp；COX-1+/+：601 bp。COX-2引物序列：WT-S：5-ACACACTCTATCACTGGCACC-3，KO- S：5-ACGCGTCACCTTAATATGCG-3，WT/KO-AS：5-ATCCCTTCACTAAATGCCCTC-3。目的基因片段 長度為905 bp。各種基因型小鼠擴增片段為：COX-2-/-：905 bp；COX-2+/-：760 bp

7、和905 bp；COX-2+/+：760 bp。（2）PCR體系：2× Go Taq Green Master Mix 12.5 L，引物WT-S（10 mol/L）2.5 L，引物KO-S（10 mol/L）2.5 L，引物WT/KO-AS（10 mol/L）2.5 L， 耳緣DNA模板樣品1.5 L，ddH2O補足25 L。（3）COX-1反應條件：預變性94 ，5 min；變性94 ，30 s；退火56 ，30 s；延伸72 ，30 s，重復步驟40次循環(huán)；最后延伸72 ，7 min；4 保存。（4）COX-2反應條件：預變性94 ，5 min；變性94 ，45 s；退火56

8、，45 s；延伸72 ，45 s，重復步驟35次循環(huán)；最后延伸72 ，7 min；4 保存。1.2.3 瓊脂糖凝膠電泳 用TBE緩沖液配制1.2%瓊脂糖凝膠，待60 左右加入溴化乙啶 （EB） 2 L （10 mg/mL），混勻后，倒入凝膠板鋪板，室溫放置30 min，待凝膠完全凝固后放入電泳槽，加入PCR產(chǎn)物10 L于點樣孔，調(diào)節(jié)電泳電壓為100 V，電泳40 min后，觀察結果。2 結果COX-1子代基因鑒定部分結果如圖1所示，凝膠最左側為Marker，編號2、5、6可見大小為646 bp左右的條帶，醫(yī)學論文發(fā)表為純合子；編號1、3、4、7可見大小為646 bp和601 bp左右的條帶，為

9、雜合子；編號8可見大小為601 bp左右的條帶，為野生型。               COX-2子代基因鑒定部分結果如圖2所示，凝膠最左側為Maker，編號3可見大小為905 bp左右的條帶，為純合子；編號1、2、4可見大小為905 bp和760 bp左右的條帶，為雜合子；編號5可見大小為760 bp左右的條帶，為野生型。3 討論小鼠基因敲除技術是研究整體動物水平基因功能的一種直接有效方法，通過基因敲除動物，可以直接分析被敲除基因的功能和作用。目前，心血

10、 管系統(tǒng)中COX亞型的生理功能及其在病理狀態(tài)下的變化尚需進一步明確。一般認為，COX-1為結構型，主要表達于正常組織，在維持腎臟血流和調(diào)節(jié)血小板聚 集中具有重要作用。COX-2為誘導型，又稱“炎癥反應基因”，正常生理狀態(tài)下幾乎不表達或少表達，當受到刺激后便迅速表達合成，參與多種病理生理 過程。深入研究COX在心血管系統(tǒng)的作用機制，有助于明確各種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展機制。為了進一步確定COX-1和COX-2基因在心血管病理生理方面的功能和作用，本實驗室引進了COX-1和COX-2基因敲除小鼠雜合子，嚴 格按照SPF級標準進行小鼠的飼養(yǎng)和繁殖，由于雜合子交配所產(chǎn)生的子代可能出現(xiàn)3種基因型，即野生型

11、（COX-1+/+；COX-2+/+）、雜合子 （COX-1+/-；COX-2+/-）和純合子（COX-1-/-；COX-2-/-），故必須對其子代進行基因鑒定，從而分辨出純合子用于實驗研究。 經(jīng)典酚氯仿提取法雖然用的都是實驗室常用試劑，但是較堿性裂解液提取法費時費力，而且苯酚和氯仿還有一定毒性作用；試劑盒提取法提純效率和純度都比較高， 但相比堿性裂解液提取法而言費用較高，且過程較之復雜。因此，本實驗所采用的堿性裂解液提取法相比于經(jīng)典酚氯仿提取法、試劑盒提取法具有處理過程簡單、快 捷、省時且經(jīng)濟等優(yōu)點。通過對不同亞型的COX基因的鑒定，驗證了該方法的可靠性。同時，在實驗過程中筆者亦觀察到：COX-1-/-雌鼠能懷孕但不能夠 分娩，而COX-2-/-雌鼠不能夠受孕，與之前報道的結果一致