第六章 植物組織培養(yǎng)脫毒技術(shù)

1、第六章第六章 植物組織培養(yǎng)脫毒技術(shù)植物組織培養(yǎng)脫毒技術(shù)全世界已發(fā)現(xiàn)植物病毒近700種。大多數(shù)農(nóng)作物，尤其是無性繁殖的家作物都受到一種或一種以上病毒侵染，且?guī)Ф局曷矢摺２《緦闹髦参锟稍斐蓽缧晕：?，?dǎo)致大幅度減產(chǎn)，甚至全株死亡。潛隱性病毒侵染植物造成癥狀不明顯的慢性危害，不易被發(fā)現(xiàn)，尤其危險。受病毒侵染的植物全身終生帶毒，目前尚無藥物可治愈。國內(nèi)外解決這一問題的有效途徑是培育無病毒苗，實施農(nóng)作物無病毒化栽培。第一節(jié)第一節(jié) 常見植物病毒及其癥狀常見植物病毒及其癥狀一種病毒可侵染許多植物，而同種植物又可被許多病毒侵染。植物病毒對農(nóng)作物的危害可使農(nóng)業(yè)生產(chǎn)受到巨大的損失。在一年生種子繁殖作物上，可以采取

2、一些預(yù)防措施，減輕當(dāng)年病害的發(fā)生程度，一般不影響下一季的發(fā)病。木本植物一旦發(fā)病，以后連年都發(fā)病。營養(yǎng)繁殖的作物如馬鈴薯，番木瓜，草莓等，連年種植可以積累多種病毒侵染。馬鈴薯的退化，就是由多種病毒引起的。一、植物病毒的發(fā)現(xiàn)一、植物病毒的發(fā)現(xiàn) 很多植物體內(nèi)都帶有植物病毒，由于人類視覺所限，形體越小的生物就越不易被發(fā)現(xiàn)，所以病毒的發(fā)現(xiàn)比其它生物要晚得多。直到19世紀(jì)末期，德國的AMayer發(fā)現(xiàn)煙草上出現(xiàn)深淺相間的綠色條紋，稱之為煙草花葉病，并證實其具有傳染性；后經(jīng)俄國植物病理學(xué)家DIvanowski對煙草花葉病病原進(jìn)行研究，認(rèn)為它是由一種極小的“細(xì)菌”引起的；最終由荷蘭人MWBeijerinck首先

3、提出煙草花葉病病原是一種“傳染性的活性液體”或稱“病毒”。此后，許多學(xué)者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了各種植物病毒。1935年美國人Stanley和Bawden揭示了煙草花葉病毒的化學(xué)本質(zhì)不是純蛋白而是核蛋白；1940年德國的Kausche等首次在電鏡下視察到煙草花葉病毒的桿狀外形。由此，病毒研究進(jìn)入了更深入的領(lǐng)域。目前，人們不但能在實踐生產(chǎn)中有效地防治病毒的侵染，而且能利用病毒作為遺傳工程的載體改造植物。二、植物病毒的類型二、植物病毒的類型植物病毒大部分屬于單鏈RNA病毒，少數(shù)為DNA病毒。其基本形態(tài)有桿狀、絲狀和等軸對稱的近球形二十面體。植物病毒雖是嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生物，但專一性并不強，往往一種病毒可寄生在不同

4、種、屬甚至不同科的植物上。如煙草花葉病毒能侵染十多個科，200多種草本和木本植物。已知的植物病毒種類有600多種，絕大多數(shù)種子植物易發(fā)生病毒病。植物被病毒感染后，一般表現(xiàn)出三類癥狀：因寄主細(xì)胞的葉綠素或葉綠體被破壞，使植物出現(xiàn)花葉或黃化病癥。阻礙植株發(fā)育，使植株發(fā)生矮化、叢枝或畸形等。殺死植物細(xì)胞使植株出現(xiàn)枯斑或壞死。三、植物病毒對植物的侵染途徑三、植物病毒對植物的侵染途徑由于植物病毒一般無專門吸附結(jié)構(gòu)，而且植物細(xì)胞表面至今也未發(fā)現(xiàn)有病毒特異性受體部位，因而植物病毒的侵染途徑主要是通過傷口。如：借昆蟲刺吸式口器損傷植物而侵入細(xì)胞。借帶病汁液與植物傷口相接觸而侵入。借人工嫁接時的傷口而侵入。植物

5、病毒侵入植物細(xì)胞后，病毒按其各自的核酸類型進(jìn)行復(fù)制。其增殖過程因病毒類型不同其細(xì)節(jié)也很不相同，但步驟大致相似。四、植物病毒病的防治四、植物病毒病的防治目前防治植物病毒病的基本策略是：防重于治和綜合防治。一般采取以下措施：1、選育抗病品種 選育病毒不能侵入或即使侵入也無法復(fù)制的抗病品種和對病毒感染有較強適應(yīng)性的耐病品種。2、消滅傳毒昆蟲 利用化學(xué)農(nóng)藥、生物農(nóng)藥或物理誘捕等方法治蟲。3、用無性繁殖法培育無毒苗 利用植物莖尖生長點并結(jié)合熱處理（3540）和組織培養(yǎng)的方法得到無毒苗。此法在防治馬鈴薯、葡萄、柑桔及某些觀賞植物的病毒病方面十分有效。4、接種弱毒株來保護(hù)植物 這是一種“給莊稼種牛痘”的方法

6、。目前在許多國家已可用此法來預(yù)防蕃茄花葉病，用于其他植物病毒的弱毒株也在實驗之中。5、采用合理的栽培措施等五、植物病毒的癥狀五、植物病毒的癥狀植物病毒引起植株的癥狀是各異的，在觀賞植物上由病毒引起外部癥狀主要有以下幾種：（1）變色：褪綠、黃化、花葉、斑駁、紅葉等，常見病毒有；香石竹斑駁病毒、黃瓜花葉病毒、芋花葉病毒等。（2）壞死：常見的壞死是病斑或斑點。有輪斑、環(huán)斑、條斑條紋等。如香石竹壞死斑點病毒、，鳳仙花壞死斑點病毒草等。（3）畸形：植株可出現(xiàn)矮縮、矮化或葉片皺縮、卷葉、蕨葉等病狀。（4）萎蔫 ：主要是指植物根或莖的維管束組織受到破壞而發(fā)生供水不足所出現(xiàn)的凋萎現(xiàn)象。第二節(jié)第二節(jié) 脫毒材料的

7、獲取脫毒材料的獲取 目前在生產(chǎn)上常用的脫毒材料獲取方法主要有：熱處理脫毒、莖尖脫毒、抗病毒藥劑脫毒等。此外，也有人通過愈傷組織、花絲組培等方法獲取無毒植株。一、熱處理脫毒一、熱處理脫毒 帶毒植株經(jīng)高溫處理后，病毒濃度會降低。通常處理方法是：把適當(dāng)?shù)牟牧弦迫胍粋€熱處理室或光照培養(yǎng)箱中，在3540高溫下，根據(jù)種類特征和材料情況處理數(shù)天到數(shù)周不等。如香石竹在38連續(xù)處理2個月，消除了莖尖內(nèi)所有病毒。百合、郁金香、，風(fēng)信子等球根花卉，用休眠種球進(jìn)行熱處理，可大大降低種球生長點內(nèi)的病毒含量。熱處理有一定的局限性，一方面熱處理只能降低植株內(nèi)病毒的含量，單獨處理難以獲得無毒材料；另一方面熱處理時間過長，會造

8、成植株代謝紊亂，加大品種變異的可能性。生產(chǎn)上通常采用熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)的脫毒方式，獲得較高 二、莖尖脫毒二、莖尖脫毒研究表明，莖尖和根尖的分生組織中一般是無毒或僅含極低濃度的病毒粒子。莖尖由頂端分生組織及其下的13個葉原基構(gòu)成。一般大小在0.11之間.莖尖脫毒主要包括表面滅菌、莖尖剝離、莖尖培養(yǎng)等步驟。香石竹脫毒的具體操作過和如下：香石竹脫毒的具體操作過和如下：（1）熱處理 將盆栽植株或離體瓶苗，在3638下處理2周，或每天在3616小時和388小時處理共30天，光照為3000lx。（2）表面消毒 選取盆栽香石竹植株葉腋間生出的側(cè)芽為外植體，先用自來水沖洗半小時，用75%的酒精消毒30秒，再用

9、2.5%次氯酸鈣或次氯酸鈉溶液處理15分鐘,取出后用無菌蒸餾水清洗4次,用無菌濾紙吸去多余水分備用。（3）莖尖剝離 在雙筒解剖鏡下。切除葉片使芽體暴露，用解剖針剝掉幼葉，直到只剩下2個最幼小的葉原基。（4）莖尖培養(yǎng) 用小刀片切下莖尖放入培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為25，光照16小時，光照強度為2000lx，平均兩周進(jìn)行一次轉(zhuǎn)接，57周可獲得單個小植株。三、抗病毒藥劑處理脫毒三、抗病毒藥劑處理脫毒 用于植物脫毒的抗病毒藥劑主要包括嘌呤和嘧啶類似物、氨基酸、抗生素等。近年來，在脫毒生產(chǎn)中，經(jīng)常采用且效果較好的抗病毒藥劑是病毒唑。通常病毒唑在培養(yǎng)基內(nèi)濃度為5/l，處理時間4 周后，生長錐中已無病毒，合適的莖尖大小是關(guān)鍵，1長的莖尖，脫毒率為80%。第三節(jié)第三節(jié) 脫毒苗的檢測脫毒苗的檢測 經(jīng)過脫毒處理的植株作為無病毒原原種或原種使用之前，必須針對特定的病毒進(jìn)行檢測，才能保證組培苗的內(nèi)在質(zhì)量。目前常用的植物病害檢測方法有可見癥狀鑒定、寄主鑒定、抗血清檢測、電鏡檢測、分子檢測等?？梢姲Y狀鑒定法較簡單，但準(zhǔn)確性差，對于不表現(xiàn)楞見癥狀的隱癥病毒幾乎無效；而電鏡檢測、分子檢測雖然準(zhǔn)確性高，但設(shè)備昂貴。目前生產(chǎn)上，國內(nèi)外主要采用鑒別寄主和抗血清