二維核磁共振譜介紹

1、第五講：二維核磁共振譜介紹第五講：二維核磁共振譜介紹Introduction of 2D NMR Spectroscopy 2DNMR1971年Jeener 首先提出 2DNMR 思想: 具有兩個(gè)時(shí)間變量的nmr1976年 Ernst小組成功實(shí)現(xiàn)了2DNMR實(shí)驗(yàn)后，確定了二維核磁共振的理論基礎(chǔ)20世紀(jì)80年代：2DNMR加速發(fā)展用途： 解析復(fù)雜有機(jī)分子最有力的工具；溶液中分子的三維空間結(jié)構(gòu)的測(cè)定；分子動(dòng)態(tài)過(guò)程的研究：多維NMR技術(shù)：研究生物大分子（蛋白質(zhì)、核酸等）最有效的方法二維核磁共振譜的特點(diǎn)將化學(xué)位移、偶合常數(shù)等核磁共振參數(shù)展開在二維平面上，這樣在一維譜中重疊在一個(gè)頻率坐標(biāo)軸上的信號(hào)分別在

2、兩個(gè)獨(dú)立的頻率坐標(biāo)軸上展開，減少了譜線的擁擠和重疊，提供了自旋核之間相互作用的新信息,獲得更多的信息 相干轉(zhuǎn)移譜和極化轉(zhuǎn)移譜基于耦合的相干轉(zhuǎn)移譜：核自旋間的J耦合（通過(guò)原子核間化學(xué)鍵電子的間接作用而發(fā)生的耦合，又稱間接耦合），與橫向磁化強(qiáng)度相聯(lián)系基于動(dòng)力學(xué)過(guò)程的極化轉(zhuǎn)移譜：D耦合（不需要經(jīng)過(guò)介質(zhì)的空間相互作用，又稱直接耦合或偶極偶極耦合），與縱向磁化強(qiáng)度相聯(lián)系二維核磁共振實(shí)驗(yàn)一維譜：一個(gè)脈沖頻率（一個(gè)頻率）的函數(shù)，一個(gè)變量，二維譜：兩個(gè)獨(dú)立的變量，nmr信號(hào)受這兩個(gè)變量的影響 兩個(gè)時(shí)間變量t1 t2_函數(shù)S（t1 ,t2） 兩次Fourier變換以兩個(gè)頻率為函數(shù)的2D-nmr譜二維NMR實(shí)驗(yàn)：

3、通過(guò)特殊的脈沖序列來(lái)獲得自旋核之間各種信息的。二維NMR實(shí)驗(yàn)的脈沖序列：一般由四個(gè)區(qū)域組成：預(yù)備期D1（preparation）,演化期t1(evolution),混合期tm和檢測(cè)期t2二維NMR實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵：是引入了第二個(gè)時(shí)間變量演化期t1二維譜學(xué)原理：省略二維譜的表示方式堆積圖等高線圖堆積圖和等高線圖F1F2F1F2（a）堆積圖（b）等高線圖等高線圖的習(xí)慣表示橫坐標(biāo)F2維對(duì)應(yīng)真實(shí)采樣的t2維縱坐標(biāo)F1維對(duì)應(yīng)間接采樣的t1維二維實(shí)驗(yàn)的脈沖序列二維實(shí)驗(yàn)的脈沖序列預(yù)備期（D1） 使自旋體系恢復(fù)Boltzmann分布，而處于初始熱平衡狀態(tài)。理論上應(yīng)取D15T1（T1為縱向弛豫時(shí)間），但為節(jié)省時(shí)間，實(shí)

4、驗(yàn)中一般取D1 =(23)T1。演化期（t1） 在預(yù)備期末，施加一個(gè)或多個(gè)90脈沖，使系統(tǒng)建立共振非平衡狀態(tài)。演化時(shí)間t1是以某固定增量t1為單位，逐步延遲t1。每增加一個(gè)t1，其對(duì)應(yīng)的核磁信號(hào)的相位和幅值不同。因此，由t1逐步延遲增量t1可得到二維實(shí)驗(yàn)中的另一維信號(hào)，即F1域的時(shí)間函數(shù)?；旌掀冢?m） 由一組固定長(zhǎng)度的脈沖和延遲組成。在混合期自旋核間通過(guò)相干轉(zhuǎn)移，使t1期間存在的信息直接影響檢測(cè)期信號(hào)的相位和幅值。根據(jù)二維實(shí)驗(yàn)所提供的信息不同，也可以不設(shè)混合期。檢測(cè)期（t2） 在檢測(cè)期t2期間采集的FID信號(hào)是F2域的時(shí)間函數(shù)，所對(duì)應(yīng)的軸通常是一維核磁共振譜中的頻率軸，即表示化學(xué)位移的軸。但

5、檢測(cè)期t2期間采集的FID信號(hào)都是演化期t1的函數(shù)，核進(jìn)動(dòng)的磁化矢量具有不同的化學(xué)位移和自旋偶合常數(shù)，其FID信號(hào)是這些因素的相位調(diào)制的結(jié)果。因此，通過(guò)控制時(shí)間長(zhǎng)度可使某期間僅表現(xiàn)化學(xué)位移的相位調(diào)制，而某期間又僅表現(xiàn)自旋耦合的相位調(diào)制，通過(guò)施加不同的調(diào)制就產(chǎn)生了各種不同的二維核磁共振譜。二維實(shí)驗(yàn)的脈沖序列二維實(shí)驗(yàn)中的參數(shù)設(shè)置參數(shù)表實(shí)驗(yàn)參數(shù)的設(shè)定F2維中的參數(shù)設(shè)定參照一維方法進(jìn)行，采樣點(diǎn)數(shù)少于一維的，因此二維實(shí)驗(yàn)的數(shù)字分辨率比一維實(shí)驗(yàn)低得多F1維的采樣數(shù)要少于F2維，這是基于實(shí)驗(yàn)時(shí)間的考慮二維實(shí)驗(yàn)時(shí)間 =（等待時(shí)間+脈沖序列作用時(shí)間+F2維采樣時(shí)間）x F1維采樣點(diǎn)數(shù) x 累加次數(shù)F2維采樣時(shí)間

6、 = F2維采樣點(diǎn)數(shù) /（2 x 譜寬），但等待時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于F2維采樣時(shí)間二維譜上的精細(xì)結(jié)構(gòu)的辨認(rèn)主要靠F2維的分辨F1維由于不進(jìn)行真實(shí)采樣，沒(méi)有接收機(jī)增益的參數(shù)F2維采用正交的檢測(cè)方式，F(xiàn)1維有正交復(fù)數(shù)檢測(cè)和單通道實(shí)數(shù)檢測(cè)兩種方式，應(yīng)與Fourier變換方式相對(duì)應(yīng)處理參數(shù)的設(shè)定由于F1維采樣點(diǎn)的增加從測(cè)譜時(shí)間上考慮有困難，因此采用零充填的方法使變換點(diǎn)大于采樣點(diǎn)，提高數(shù)字分辨率，但是不能提高譜峰的分辨率，通常信號(hào)會(huì)出現(xiàn)譜峰拖長(zhǎng)的現(xiàn)象利用窗函數(shù)進(jìn)行變跡處理：相移的正弦鐘函數(shù)、高斯函數(shù)或平方正弦鐘函數(shù)利用正弦鐘函數(shù)對(duì)截尾嚴(yán)重的FID進(jìn)行修飾，可以消除由于截尾時(shí)的高頻截?cái)嘣斐傻恼鹗幬膊‵1維的間接采

7、樣方式有實(shí)數(shù)型和復(fù)數(shù)型兩種，F(xiàn)1維的Fourier變換方式應(yīng)與采樣方式相適應(yīng)二維Fourier變換應(yīng)先變換t2維然后再變換t1維，順序不可顛倒顯示方式分為絕對(duì)值顯示和相敏顯示兩種，絕對(duì)值顯示的峰有好的信噪比，相敏顯示有高的分辨率二維譜中的基線調(diào)整十分重要二維核磁共振譜的基本理論同核二維譜實(shí)驗(yàn)異核二維譜實(shí)驗(yàn)例題與練習(xí)常用的5種二維同核實(shí)驗(yàn)COSYDQF-COSYTOCSYNOESYROESYCOSY實(shí)驗(yàn)COSY實(shí)驗(yàn)是最簡(jiǎn)單的二維實(shí)驗(yàn)，用途最為廣泛，脈沖序列由兩個(gè)90o脈沖組成脈沖序列：90o-t1- 90o-t2兩個(gè)時(shí)域長(zhǎng)度由各維的采樣點(diǎn)數(shù)和譜寬決定采樣點(diǎn)間隔在譜寬確定以后依照Nyquist采樣

8、定律確定t1維中，采樣間隔表示為t1，又稱t1增量，也受Nyquist采樣定律制約，由F1維的譜寬決定混合時(shí)間混合時(shí)間10ms雜峰與雜峰的消除軸峰：沿F1維出現(xiàn)在參考頻率為零處，與演化期間因縱向弛豫而產(chǎn)生的縱向磁化強(qiáng)度有關(guān)。因?yàn)檠莼诘目v向弛豫不可避免，因此軸峰必然存在t1噪聲峰：沿F1維出現(xiàn)的雜峰，可由許多復(fù)雜因素引起，例如宏觀退磁場(chǎng)效應(yīng)和飽和效應(yīng)等鏡像峰：關(guān)于中心頻率對(duì)稱的峰，二維鏡像峰是復(fù)數(shù)Fourier變換所固有的消除或降低其強(qiáng)度的方法：相位循環(huán)（例如，COSY實(shí)驗(yàn)的完整相位循環(huán)至少包括4次實(shí)驗(yàn)，因此累加次數(shù)就是4的倍數(shù)）DQF-COSY實(shí)驗(yàn)脈沖序列采用三個(gè)90o脈沖： 90o-t1-

9、 90o - 90o t2目的是為了降低對(duì)角峰的強(qiáng)度，從而使位于對(duì)角峰附近的交叉峰較易辨認(rèn)TOCSY（全相關(guān)譜）實(shí)驗(yàn)TOCSY可以將每一個(gè)耦合網(wǎng)絡(luò)用一個(gè)方格網(wǎng)連接起來(lái)脈沖序列為一個(gè)90o脈沖加上一串自旋鎖定功能的組合脈沖： 90o-t1- 自旋鎖定-t2旋轉(zhuǎn)坐標(biāo)系實(shí)驗(yàn)（有自旋鎖定過(guò)程，如TOCSY和ROESY）和實(shí)驗(yàn)室坐標(biāo)系實(shí)驗(yàn)（無(wú)自旋鎖定過(guò)程，如COSY、DQF-COSY和NOESY）NOESY實(shí)驗(yàn)NOESY實(shí)驗(yàn)是探測(cè)核間空間距離的實(shí)驗(yàn)，依據(jù)的是核之間與距離6次方呈反比的Overhauser作用脈沖序列為三個(gè)90o脈沖：90o-t1- 90o tm- 90o t2混合時(shí)間tm應(yīng)該根據(jù)核的弛豫

10、時(shí)間而定J干擾峰的消除ROESY（旋轉(zhuǎn)坐標(biāo)系中的NOESY）實(shí)驗(yàn)脈沖序列： 90o-t1- 自旋鎖定-t2脈沖序列與TOCSY中所示的序列完全相同，但是用于自旋鎖定的組合脈沖是不相同的，鎖定功率和鎖定時(shí)間也有較大的區(qū)別ROESY也不可避免地受到J耦合的干擾，而且難以用一般的方法予以消除異核二維NMR譜簡(jiǎn)介異核二維NMR譜主要指的是檢測(cè)1H而同時(shí)間接觀測(cè)13C、15N等核的逆檢測(cè)二維相關(guān)譜記錄不靈敏核FID的HECSY實(shí)驗(yàn)已被淘汰直接觀測(cè)靈敏核的FID，通過(guò)核間耦合間接地觀測(cè)不靈敏核的化學(xué)位移異核實(shí)驗(yàn)?zāi)壳坝龅阶疃嗟氖?3C-1H耦合系統(tǒng)，此外15N-1H，29Si-1H系統(tǒng)也得到了廣泛的應(yīng)用常用

11、的3種二維異核實(shí)驗(yàn)HMQCHMBCHSQCHMQC（異核多量子相關(guān)譜）實(shí)驗(yàn)HMQC實(shí)驗(yàn)是通過(guò)檢測(cè)1H信號(hào)而達(dá)到間接檢測(cè)13C或15N信號(hào)的一種方法是成功率最高的異核相關(guān)實(shí)驗(yàn)，正逐步取代一維的不靈敏核檢測(cè)1H-13C HMQC實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的就是1H譜中的13C的衛(wèi)星峰當(dāng)樣品為天然豐度時(shí)，與12C或14N相連的1H主峰需要在實(shí)驗(yàn)中用合適的方法濾去在4脈沖HMQC實(shí)驗(yàn)中，濾去1H主峰是通過(guò)相位循環(huán)完成的，一般效率很高當(dāng)樣品濃度極低時(shí)，需要借助BIRD序列增強(qiáng)濾波功能HMQC脈沖序列雙線性旋轉(zhuǎn)去耦（bilinear rotation decoupling, BIRD）HMBC（異核多重鍵相關(guān)譜）實(shí)驗(yàn)HMQ

12、C的嚴(yán)重缺陷：無(wú)法判定季碳的化學(xué)位移，需要通過(guò)長(zhǎng)程耦合來(lái)辨認(rèn)歸屬HMBC實(shí)驗(yàn)的脈沖序列是以HMQC實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，本質(zhì)上說(shuō)是借助較小耦合常數(shù)完成的HMQC實(shí)驗(yàn)由于長(zhǎng)程耦合常數(shù)之間的差值與耦合常數(shù)本身之比很大，旋進(jìn)過(guò)程中帶來(lái)的誤差就很大，給調(diào)整相位帶來(lái)了很大的困難，因此一般顯示為絕對(duì)值譜與HMQC實(shí)驗(yàn)相比，HMBC實(shí)驗(yàn)的信噪比要低很多，沿F1走向的t1噪聲峰特別強(qiáng)（可通過(guò)數(shù)學(xué)的方法消除）HMBC譜中一個(gè)氫峰可以和多個(gè)碳峰相關(guān)，主要用于解決四級(jí)碳信號(hào)的問(wèn)題HMBC的脈沖序列HSQC（異核單量子相關(guān)譜）實(shí)驗(yàn)在外形上與HMQC完全相同各項(xiàng)參數(shù)要求頗高，當(dāng)參數(shù)不是很完美時(shí)，很容易形成相位難調(diào)的情況在F1維的分辨率要比HMQC高，在三維NMR中得到比HMQC實(shí)驗(yàn)廣得多的應(yīng)用HSQC的脈沖序列未知物結(jié)構(gòu)解析例一（1H NMR）未知物結(jié)構(gòu)解析例一（13C NMR）未知物結(jié)構(gòu)解析例一(DEPT-90)未知物結(jié)構(gòu)解析例一(DEPT-135)未知物結(jié)構(gòu)解析例一(COSY)未