生物柴油合成中脂肪酶的應(yīng)用研究

1、近些年，將植物油和動(dòng)物脂肪通過(guò)酯化反應(yīng)制備生物柴油的方法受到了人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注。在不同類型油料的脂交換反應(yīng)中，用甘油三酸酯和醇（主要是甲醇和乙醇）反應(yīng)來(lái)生產(chǎn)酯類和甘油。此反應(yīng)常用的催化劑有酸、堿和脂肪酶。酸、堿在很短的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)可催化甘油三酸酯轉(zhuǎn)化成相應(yīng)甲酯，且轉(zhuǎn)化率較高。但此反應(yīng)也有一些缺點(diǎn)：如甘油的回收等很困難，酸或堿催化劑必需從產(chǎn)品中去除，廢水需要處理等。目前，人們的主要興趣集中在利用脂肪酶將植物油或其它農(nóng)業(yè)脂肪原料催化合成生物柴油。1生物柴油合成用脂肪酶的種類脂肪酶（酰基甘油水解酶，E.C.3.1.1.3）是一種廣泛分布于動(dòng)物、植物和微生物中的酶，能夠進(jìn)行可逆的甘油酯鍵水解，因此也能

2、夠進(jìn)行甘油酯合成。在一定的條件下，脂肪酶也能夠催化許多酯化反應(yīng)。無(wú)論在小規(guī)模的還是工業(yè)規(guī)模的酯合成中作為催化劑，脂肪酶已經(jīng)得到成功應(yīng)用。目前至少有35種可以利用的商業(yè)脂肪酶制劑，但僅有少數(shù)幾種能在工業(yè)中使用（見(jiàn)表1）。固定化酶由于其自身的一此優(yōu)越性，在生物柴油酶催化合成中越來(lái)越受到青睞。固定化酶的優(yōu)點(diǎn)在于：催化效率高；酶的費(fèi)用較低；酶不會(huì)進(jìn)入產(chǎn)物中；提高了酶的穩(wěn)定性；改善了酶的行為；可連續(xù)加工，因而能更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量；有利于多酶系統(tǒng)的利用。在脂肪酶的固定化方面，目前國(guó)內(nèi)外的研究重點(diǎn)主要集中在固定載體的選擇與固定條件的優(yōu)化上。Orc等研究了來(lái)源于Burkholderia cepacia和Pse

3、udomonas cepacia的商業(yè)脂肪酶制劑，固定化于用CO2超臨界技術(shù)干燥的石英纖維氣凝膠中，催化向日葵油與乙酸甲酯合成生物柴油。氣凝膠膠囊技術(shù)能夠使酶在有機(jī)疏水介質(zhì)中維持與在水溶液中相似的分散性，兩種膠囊化的脂肪酶的活力相對(duì)比較接近，可與固定化于大孔丙烯酸樹(shù)脂的Novozyme435相媲美。曾淑華等采用溶膠-凝膠法對(duì)脂肪酶進(jìn)行了固定化，考察了固定化酶催化大豆油轉(zhuǎn)酯化的生產(chǎn)工藝。Yagiz等研究了水滑石和4種不同類型的沸石作為固定化酶的材料情況。發(fā)現(xiàn)水滑石上吸附的蛋白質(zhì)的量為13 mg/g，比沸石（9 mg/g）高，5 h后水滑石上酶的固定化可達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。姜紹通等以高吸水樹(shù)脂為載體，采

4、用物理吸附和戊二醛交聯(lián)的方法固定化脂肪酶。研究結(jié)果表明，吸附法和交聯(lián)法固定化酶與游離酶相比催化活性提高了2倍以上，且其pH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性均高于游離酶。TAN等在大孔樹(shù)脂上吸附固定化脂肪酶，酯轉(zhuǎn)化率可達(dá)到97.3%。在使用19次后依然達(dá)到70.2%。2生物柴油的胞外脂肪酶催化合成近些年來(lái)，人們對(duì)于酶在有機(jī)合成中應(yīng)用的興趣日益高漲。許多注意力都集中于在不同反應(yīng)體系中脂肪酶的催化特性上。2.1有機(jī)溶劑體系中的催化合成目前已有很多關(guān)于脂肪酶在有機(jī)溶劑中的催化轉(zhuǎn)酯反應(yīng)研究。以正已烷為溶劑，Nelson等發(fā)現(xiàn)毛霉菌來(lái)源的脂肪酶用于將甘油三酸酯與低級(jí)醇作用轉(zhuǎn)化成它們的烷酯是最有效的。通過(guò)使用幾種不同的有機(jī)

5、溶劑，Hadzir等用Lipozyme和Novozyme催化甘油三酯和油醇生產(chǎn)蠟狀脂的醇解反應(yīng)。他們發(fā)現(xiàn)有機(jī)溶劑嚴(yán)重地影響著脂肪酶的活性，庚烷和正已烷被證實(shí)是最好的有機(jī)溶劑。Soumanou等研究了在正已烷的開(kāi)放體系中幾種植物油的脂肪酶催化醇解作用。他們發(fā)現(xiàn)Thermomyces lanuginose脂肪酶催化轉(zhuǎn)化率最高（97%），相比之下，此酶在使用甲醇或2-丙醇為底物的無(wú)溶劑體系中幾乎沒(méi)有活性。通過(guò)在干燥的催化劑中混和使用碳水化合物、聚合體和有機(jī)緩沖劑，由于有機(jī)介質(zhì)微環(huán)境的改善，可以在有機(jī)溶劑中提高酶的催化活性。Pu等研究了在已烷中鹽固定化脂肪酶和它的酯交換反應(yīng)，他們發(fā)現(xiàn)用EDTA-Na2

6、固定化的脂肪酶在已烷中的酯交換活性相比在其鹽溶液中脂肪酶的活性提高了463%2700%。Li等研究了以叔丁醇為反應(yīng)介質(zhì)的新體系。當(dāng)叔丁醇/油體積比1 1；甲醇/油摩爾比率4 1；3%Lipozyme TL IM和1%Novozym 435基于油重；溫度35；130 r/min、12 h時(shí)，生物柴油和最高收率可達(dá)95%。研究還發(fā)現(xiàn)：以叔丁醇為反應(yīng)介質(zhì)脂肪酶重復(fù)使用200個(gè)周期而沒(méi)有明顯損失，脂肪酶表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性。叔丁醇作為一個(gè)新的反應(yīng)介質(zhì)，其可有效減小由于過(guò)量的甲醇和副產(chǎn)物甘油引起的負(fù)面影響。2.2無(wú)溶劑體系中的催化合成許多類型的醇如伯醇、仲醇以及直鏈、鏈醇都可以用來(lái)在脂肪酶的催化下進(jìn)行酯交

7、換反應(yīng)。Nelson等研究了在與短鏈醇發(fā)生交換反應(yīng)反應(yīng)中脂肪酶的催化能力。在無(wú)溶劑反應(yīng)體系中，與甲醇和乙醇反應(yīng)的收率比有正已烷參與的收率要低一些；與甲醇的反應(yīng)收率降低了19.4%。Mittelbach報(bào)道了在使用甲醇、乙醇和正丁醇時(shí)的情況。雖然與乙醇和正丁醇反應(yīng)時(shí)，收率較高，但是與甲醇的反應(yīng)中僅獲得微量的甲酯。Abigor等也發(fā)現(xiàn)在棕櫚油與乙醇反應(yīng)可獲得最高72%的交換率，而與甲醇反應(yīng)僅得到15%的甲酯。所以說(shuō)脂肪酶對(duì)長(zhǎng)鏈脂肪醇比短鏈脂肪醇的催化作用更有效?？傮w上無(wú)論在有無(wú)溶劑的體系中，甘油三酸酯與甲醇的酯交換反應(yīng)效率和與乙醇的反應(yīng)效率相比要低得多。在實(shí)際工業(yè)應(yīng)用中，在無(wú)溶劑體系中脂肪酶的催化

8、醇解作用十分重要，此體系的優(yōu)點(diǎn)就是可以避免后分離、毒性和有機(jī)溶劑易燃等問(wèn)題。2.3 AOT反膠束體系中的催化合成已有報(bào)道表明，對(duì)于脂肪酶催化反應(yīng)，膠束界面面積的大小限制著反應(yīng)速率。人們已認(rèn)識(shí)到對(duì)于包含水不溶性底物的酶催化反應(yīng)，反相膠束是一個(gè)很好的介質(zhì)，這是因?yàn)樗峁┝艘粋€(gè)相當(dāng)可觀的界面面積。許多不同類型的表面活性劑被用來(lái)組成反相膠束，最常用的表面活性劑是AOT琥珀酸雙（2-乙基已基）脂磺酸鈉。由于其緊密的結(jié)構(gòu)和熱力學(xué)穩(wěn)定性，AOT表現(xiàn)異常好。Riter等報(bào)道了在AOT/水/異辛烷反相膠束中脂肪酶的活性受到水的負(fù)面影響。另外，一些報(bào)道表明如AOT這樣的離子表面活性劑與溶解的酶分子間的靜電和疏水作

9、用導(dǎo)致了酶活性的降低。為了提高AOT反相膠束中脂肪酶的活性和穩(wěn)定性，人們采取了一些措施如AOT的化學(xué)修飾，脂肪酶的預(yù)處理和AOT反相膠束的修正。Moniruzzaman等在AOT/水/異辛烷體系中加入疏水質(zhì)子溶劑，考察了其對(duì)Chromobacterium viscosum脂肪酶活性、穩(wěn)定性及動(dòng)力學(xué)的影響。在試驗(yàn)的7種疏水溶劑中，二甲基亞砜是最有效的。通過(guò)優(yōu)化水、AOT的摩爾比率，緩沖液pH值和表面活性劑濃度等相關(guān)參數(shù)，可以提高脂肪酶活性且半衰期從33天提高到了125天。2.4離子液體中的催化合成近年來(lái)，離子液體作為一種性能優(yōu)良的綠色溶劑受到越來(lái)越多的關(guān)注。離子液體可作為脂肪酶的載體進(jìn)行酯交換反

10、應(yīng)，這一概念是Klibanov及其同事提出的。緊隨Klibanov之后，Lau等研究了以離子性流體(C4mimBF4或C4mimPF6)為反應(yīng)介質(zhì)中脂肪酶的催化醇解反應(yīng)。在50，Lozano等對(duì)Candida antarctica脂肪酶B在4種不同含水量的離子流體中的活性和穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，報(bào)道了所有的離子流體對(duì)于脂肪酶催化反應(yīng)是適合的，都比在有機(jī)介質(zhì)中要好。Ha等在23種離子流體中試驗(yàn)了生物柴油的Candida antarctica脂肪酶催化合成方法。其中在EmimTfO流體中50反應(yīng)12 h后脂肪酸甲酯的收率為80%，為無(wú)溶劑體系中的8倍，比叔丁醇體系中高15%。此方法對(duì)于尋求在新的反應(yīng)體

11、系中進(jìn)行生物柴油的脂肪酶法催化合成不失為一種很好的思路。3生物柴油的甲醇分解合成3.1生物柴油的短鏈醇分解合成從生產(chǎn)成本和對(duì)生物柴油的技術(shù)要求來(lái)看，短鏈醇是最好的?；荏w，故人們對(duì)生物柴油的短鏈醇分解合成進(jìn)行了研究。Salis等對(duì)線性和支鏈短鏈醇的影響進(jìn)行了研究，最差的醇就要數(shù)甲醇和2-丁醇了，前者大概是由于其與油的互溶性較差后者是由于仲醇比伯醇反應(yīng)惰性大。相反，具有短烷基鏈（C2C4）的直鏈和枝鏈伯醇表現(xiàn)出很高的反應(yīng)速率與轉(zhuǎn)化率。Abigor等報(bào)道了棕櫚核油和椰子油與不同鏈長(zhǎng)的醇在脂肪酶催化條件下的生產(chǎn)情況。在棕櫚核油的轉(zhuǎn)化過(guò)程中，沒(méi)有任何反應(yīng)混合物以外的溶劑，乙醇與之反應(yīng)所得轉(zhuǎn)化率最高為7

12、2%，其次為叔丁醇62%、丁醇42%、丙醇42%、異丙醇24%，而用甲醇時(shí)只得到了15%的甲酯轉(zhuǎn)化率。De等研究了在無(wú)溶劑體系中使用固定化脂肪酶（Lipozyme IM-20）進(jìn)行醇酯的交換反應(yīng)。他們發(fā)現(xiàn)隨著醇鏈的增長(zhǎng)所得酯的熔點(diǎn)也在不斷穩(wěn)步增長(zhǎng)，但對(duì)于相同鏈長(zhǎng)的醇，隨著其不飽和度增加反而降低。如以上詮釋的那樣，酶的催化醇解在有機(jī)無(wú)溶劑體系中長(zhǎng)鏈醇和分支醇往往處于優(yōu)勢(shì)地位，但是在有機(jī)無(wú)溶劑體系中甲醇醇解卻沒(méi)有一個(gè)較高的轉(zhuǎn)化率?；诖耍绾文艿玫揭粋€(gè)高的轉(zhuǎn)化率，這對(duì)人們利用脂肪酸與甲醇反應(yīng)制備生物柴油來(lái)說(shuō)是十分重要的。3.2生物柴油的甲醇分解合成雖然說(shuō)甲醇分解合成作用在生物柴油的催化合成中不占有

13、優(yōu)勢(shì)，但由于其價(jià)廉易得，在脂肪酯類中碳鏈最短，故受到了人們的青睞。Du等研究了在大豆油與甲醇的酶催化酯交換反應(yīng)生產(chǎn)生物柴油。由于lipozyme TL具有嚴(yán)格的1，3-位特異性，生物柴油的收率僅為66%，然而事實(shí)上其收率超過(guò)了90%，后來(lái)證實(shí)在反應(yīng)過(guò)程中發(fā)生了?；D(zhuǎn)移作用。油脂和甲醇的混合液中，酶會(huì)失活，Samukawa等研究了當(dāng)Novozym 435在油酸甲酯中活化0.5h后，再在大豆油中活化12 h，甲醇分解反應(yīng)速度得到很大的提高。結(jié)果在3.5 h內(nèi)每間隔0.250.4 h分步添0.33 mol的甲醇，反應(yīng)混合物中甲酯的含量可超過(guò)97%。Shimada等開(kāi)發(fā)了一種分步添加甲醇的方法來(lái)避免脂

14、肪酶失活，結(jié)果在50個(gè)反應(yīng)周期后，酯交換率超過(guò)了95%。使用上述相同的酶，Watanabe等開(kāi)發(fā)用三步甲醇法從植物油連續(xù)生產(chǎn)甲酯的方法，洗出液中甲酯的含量達(dá)到了93%，且固定化脂肪酶可使用100天而酶活沒(méi)有任何降低。Lee等通過(guò)三步反應(yīng)，使豬油和餐館油脂來(lái)源的動(dòng)物油脂有一個(gè)相對(duì)高的轉(zhuǎn)化率，然而，在連續(xù)分批操作中當(dāng)甲醇和油的摩爾比大于2 1時(shí)脂肪酶的活性急劇損失，此時(shí)最適溫度為3040。4生物柴油的胞內(nèi)脂肪酶催化合成生物轉(zhuǎn)化可以通過(guò)使用胞外和胞內(nèi)脂肪酶來(lái)進(jìn)行，但是胞外酶需要純化，這對(duì)于實(shí)際應(yīng)用來(lái)說(shuō)過(guò)于復(fù)雜。而且酶的回收過(guò)程既不穩(wěn)定又很昂貴，促使人們考慮使用整個(gè)細(xì)胞來(lái)作為催化劑。為了更好地利用整個(gè)

15、細(xì)胞催化劑，細(xì)胞應(yīng)該以傳統(tǒng)固相催化劑的形式來(lái)進(jìn)行固定化。在多種可供利用的固定化方法中，Atkinson等開(kāi)發(fā)了一種使用多孔生物載體粒子（biomass support particles，BSPs）的技術(shù)，由于其諸多優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于微生物、動(dòng)物、昆蟲(chóng)和植物細(xì)胞體系。將Rhizopas Oryzae細(xì)胞作為整個(gè)生物催化劑固定在BSPs中，Hama等將Rhizopus oryzae細(xì)胞固定在6 mm6 mm3 mm立方體的聚氨酯泡沫體BSPs中，在一個(gè)20 L的填充床生物反應(yīng)器中進(jìn)行間歇培養(yǎng)。流速為25 L/h時(shí)在第一個(gè)生產(chǎn)周期甲酯含量超過(guò)90%，第10個(gè)周期后可以達(dá)到80%。Ban等的研究表

16、明當(dāng)含水量為10%20%，用BSPs固定Rhizopas.oryzae細(xì)胞，沒(méi)有任何有機(jī)溶劑預(yù)處理的情況下，反應(yīng)混合物中甲酯的含量達(dá)到了80%90%，此甲酯的生產(chǎn)水平幾乎和使用胞外脂肪酶時(shí)是一致的。為了穩(wěn)定Rhizopas.Oryzae細(xì)胞，對(duì)其用0.1%的戊二醛溶液進(jìn)行十字交聯(lián)處理，細(xì)胞中脂肪酶的活性在6個(gè)培養(yǎng)周期期間沒(méi)有大的下降，甲酯的含量在72 h內(nèi)達(dá)到70%83%。這些發(fā)現(xiàn)表明固定整個(gè)細(xì)胞生物催化劑的生物載體粒子的使用給生物柴油燃料的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一條光明的途徑。6結(jié)語(yǔ)生物柴油就是以動(dòng)植物油脂為原料制造的可再生能源，即脂肪酸甲酯，可作為石油柴油的替代燃料。生物柴油的發(fā)展不僅有利于解決能源問(wèn)題，而且可以減少溫室氣體的排放量，這些都是吸引發(fā)展生物柴油的主要原因。酶法合成生物柴油的優(yōu)點(diǎn)是其反應(yīng)條件溫和、醇用量小、產(chǎn)品易于收集以及無(wú)污染排放等。目前存在的問(wèn)題主要有：對(duì)甲醇及乙醇的轉(zhuǎn)化率低，一般僅為40%60%；短鏈醇對(duì)酶有一定毒性，使得酶的使用壽命短；副產(chǎn)物甘