力學(xué)刺激對種植體

1、力學(xué)刺激對植體-骨界面骨系細(xì)胞mRNA表達(dá)的影響Effects of the mRNA expression in implant-bone interface bone cells after mechanical stimulate摘要在建立力學(xué)刺激骨系細(xì)胞的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷幕A(chǔ)上，利用激光捕獲顯微分離技術(shù)（LCM）, 獲取動(dòng)物模型體內(nèi)種植體骨界面區(qū)域的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞,用基因芯片法檢測不同力值的間斷力學(xué)刺激作用下基因表達(dá)譜的時(shí)序變化。明確從骨形成到骨破壞這個(gè)質(zhì)的變化過程中，基因表達(dá)的差異和相關(guān)的特異性基因，探討成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的耦聯(lián)機(jī)制，從系統(tǒng)角度研究生理負(fù)荷促進(jìn)骨形成和超負(fù)荷導(dǎo)致骨破

2、壞的基因調(diào)控機(jī)制的差異，嘗試篩選出與骨形成和骨破壞相關(guān)基因，以為骨生物力學(xué)及骨組織工程學(xué)提供理論依據(jù)，并進(jìn)一步完善負(fù)荷狀態(tài)下骨組織與人工材料界面骨改建機(jī)制的理論，為臨床診斷和防治提供理論先導(dǎo)。（一）立項(xiàng)依據(jù)與研究內(nèi)容1、項(xiàng)目的立項(xiàng)依據(jù)（附主要的參考文獻(xiàn)目錄）。隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展，一些人工種植體或裝置越來越多的被植入骨組織，用于治療病變和修復(fù)缺損，如人工關(guān)節(jié)、牙種植體，以及骨內(nèi)固定裝置等。理想的人工種植體或裝置應(yīng)以與骨組織緊密結(jié)合(骨整合Osseointegration)的形式行使其生理功能, 然而，仍有部分植入體不能達(dá)到或保持長期的骨整合，導(dǎo)致植入體松動(dòng)、脫落和并發(fā)癥的產(chǎn)生，除了植入體材料本身

3、的因素之外，負(fù)荷后骨組織的應(yīng)力變化也是重要的影響因素之一，且已引起眾多學(xué)者的關(guān)注。由于植入體與骨組織之間始終存在一個(gè)界面，負(fù)載后界面骨組織的應(yīng)力應(yīng)變與正常骨組織負(fù)載后的應(yīng)力應(yīng)變不同，這種力學(xué)環(huán)境的改變，可能會(huì)促進(jìn)骨組織與人工材料的界面發(fā)生適應(yīng)性改建，達(dá)到理想的骨整合；也可能會(huì)導(dǎo)致骨組織與人工材料的界面發(fā)生骨吸收。骨吸收會(huì)使種植體與骨組織分離，增加了植入物微粒、細(xì)菌及炎癥介質(zhì)等侵入的機(jī)會(huì)，引起炎癥反應(yīng)，加速骨吸收并造成植入體松動(dòng)，進(jìn)而影響種植體的生存率和生存時(shí)間。因此，了解力學(xué)刺激對骨組織與人工材料界面骨改建的影響，將有助于解釋臨床觀察到的現(xiàn)象，有助于與骨生物力學(xué)相關(guān)的諸學(xué)科的發(fā)展，如骨折固定、

4、人工關(guān)節(jié)置換、牽張成骨、口腔種植修復(fù)、口腔正畸、骨質(zhì)疏松癥的防治及骨組織工程研究等等。機(jī)械刺激產(chǎn)生的耦合力傳遞到骨組織，使骨系細(xì)胞發(fā)生應(yīng)力應(yīng)變作用，這些變化通過多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致骨系細(xì)胞產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)并完成骨的改建。成骨細(xì)胞(OB)和破骨細(xì)胞(OC)是骨改建的兩大主要功能細(xì)胞，在應(yīng)力、生長因子、激素等作用下兩者之間相互作用，相互調(diào)控，使骨產(chǎn)生適應(yīng)性地構(gòu)建。其中由應(yīng)力應(yīng)變造成細(xì)胞的生物學(xué)反應(yīng)和變化，引起了人們的關(guān)注1，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為2：不同的力學(xué)刺激可以導(dǎo)致成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞活性和數(shù)量的變化，影響骨形成與骨吸收，而這顯然是由于骨系細(xì)胞基因表達(dá)和基因調(diào)控發(fā)生變化的結(jié)果。目前的研究證據(jù)表

5、明：1、體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞加載研究證明3-5：成骨細(xì)胞未受力時(shí), 早期即刻基因c-fos、c-jun在細(xì)胞靜止期內(nèi)不表達(dá)；受力學(xué)刺激后初期即明顯增加，其表達(dá)一般與細(xì)胞的增殖分化同時(shí)出現(xiàn)，因而其轉(zhuǎn)錄翻譯蛋白可能對其它晚應(yīng)答的基因轉(zhuǎn)錄起調(diào)控作用。Ikegame等6發(fā)現(xiàn)：加載6h后，骨形成蛋白-4（BMP-4）基因表達(dá)增加，成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子cbfa1/Osf-2也隨著BMP-4基因表達(dá)開始表達(dá)。Pavlin等7發(fā)現(xiàn)：加載24h后，成骨細(xì)胞中骨鈣蛋白水平輕度下降，但在加載1-2d，其表達(dá)增長了4.6倍，到第4d則增長了7倍，達(dá)到其增長的最高峰；I型膠原基因的表達(dá)在加載后第1d不明顯，但在第2d其表達(dá)增

6、長了3倍，并在其后6d維持這一水平。Cillo等8則針對另外一些重要的基因表達(dá)進(jìn)行了研究：實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)拉伸應(yīng)力可以使TGF-和胰島素樣生長因子-II的mRNA表達(dá)增加，堿性成纖維細(xì)胞生長因子表達(dá)減少，且不同的力值和加載時(shí)間對這些基因的表達(dá)有不同的影響。顯然成骨細(xì)胞受力后，基因的表達(dá)在一定的時(shí)間范圍內(nèi)存在明顯的時(shí)序性變化。2、破骨細(xì)胞是骨吸收的主要功能細(xì)胞，傳統(tǒng)認(rèn)為破骨細(xì)胞是一個(gè)“惰性細(xì)胞”，對力學(xué)刺激不敏感，主要是通過成骨細(xì)胞感受力學(xué)刺激以后，通過耦聯(lián)機(jī)制影響破骨細(xì)胞的活性、增殖和遷移。但是最近的研究表明9：應(yīng)力可直接導(dǎo)致體外培養(yǎng)的破骨細(xì)胞mRNA表達(dá)的增強(qiáng)，并伴隨著骨吸收能力的增強(qiáng)。3、多數(shù)實(shí)

7、驗(yàn)是建立在對OB、OC靜態(tài)加載的基礎(chǔ)上，但動(dòng)態(tài)載荷對骨改建的影響遠(yuǎn)大于靜態(tài)載荷，已得到很多學(xué)者證實(shí)，即間歇性的周期性力學(xué)刺激對細(xì)胞的增殖分化功能和基因表達(dá)的作用明顯大于持續(xù)性靜態(tài)負(fù)荷的作用10-11。但其原因和機(jī)理尚不清楚。4、對力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究表明12-14：骨系細(xì)胞表面的離子通道在細(xì)胞膜受到力學(xué)作用數(shù)秒或數(shù)分鐘后即可引起G蛋白活化、第二信使釋放、蛋白質(zhì)磷酸化、生長因子的分泌、細(xì)胞骨架的變化、細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)粘附的重建，最終導(dǎo)致基因表達(dá)的變化?；虮磉_(dá)的變化可能反過來影響信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo) 13。成骨細(xì)胞在某些力學(xué)刺激因素作用下表達(dá)一些因子，從而將骨吸收信號(hào)傳遞給破骨細(xì)胞的前體細(xì)胞，使之分化發(fā)育并

8、活化，行使骨吸收功能。骨保護(hù)素（OPG）和骨保護(hù)素配體（OPGL）的發(fā)現(xiàn)證實(shí)了這一假說，并提供了分子基礎(chǔ)13-14。有研究表明14-15：作為細(xì)胞表面重要受體的整合素，通過識(shí)別某些胞外基質(zhì)蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附反應(yīng)并接受、轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)信號(hào)，并有可能是力學(xué)信號(hào)傳遞的通道。從以上研究中可以看出：（1）力學(xué)刺激導(dǎo)致OB、OC基因改變的過程涉及眾多基因的變化，但針對個(gè)別基因的研究顯得較為凌亂，基因之間的相互影響也不清楚，不能精確地闡明各基因在這一過程中的作用。（2）多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間存在著密切的耦聯(lián)關(guān)系，不同的力學(xué)信號(hào)可能通過這些內(nèi)在相連的信號(hào)通路，以不同的方式影響骨系細(xì)胞的反應(yīng)。

9、這些不同信號(hào)通道是如何介導(dǎo)力學(xué)刺激，而導(dǎo)致OB、OC基因表達(dá)的時(shí)空變化？是否存在某些尚不為人所知的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子？信號(hào)通路之間又是如何耦聯(lián)的？這方面的認(rèn)識(shí)尚不明確，只能從基因表達(dá)的變化來找尋方向。（3）由于各學(xué)者多采用體外實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)條件不盡相同，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可比性較差，有關(guān)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的報(bào)道，特別是力學(xué)刺激對人工種植體-骨界面骨系細(xì)胞基因表達(dá)影響的報(bào)道也極為罕見。因此，有必要同期從體內(nèi)外觀察OB、OC受力后整個(gè)基因表達(dá)的時(shí)序變化，探討各相關(guān)基因在骨形成和骨吸收過程中的確切作用，并探討其臨床應(yīng)用前景和意義。Vaes16等人曾嘗試應(yīng)用基因芯片的方法，找尋骨形成蛋白-2誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化過程中的標(biāo)記基因，

10、為探尋力學(xué)信號(hào)對骨系細(xì)胞基因表達(dá)的影響提供了一個(gè)好的思路?；蛐酒夹g(shù)是一項(xiàng)新興的能檢測全范圍mRNA表達(dá)水平變化的技術(shù)，具有高通量、并行化的特點(diǎn)，可為研究基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其機(jī)理，揭示不同層次多基因相互作用的生理、病理現(xiàn)象提供有效手段17,18。然而，骨組織是不同細(xì)胞群體相互作用的三維空間結(jié)構(gòu)，通過磨碎活組織所提取的DNA、RNA不能代表特定生理或病理過程中單一同類細(xì)胞的信息。激光捕獲顯微切割技術(shù)19（Laser Capture Microdissection ，LCM）則是解決細(xì)胞異質(zhì)性問題的革命性技術(shù)，是在顯微鏡下從組織切片中分離、純化單一類型細(xì)胞群或單個(gè)細(xì)胞的技術(shù)。從LCM捕獲的同質(zhì)細(xì)胞中

11、提取mRNA可構(gòu)建cDNA文庫，進(jìn)行cDNA微列陣分析20。因此，我們相信LCM技術(shù)與基因芯片的有效結(jié)合，將能夠清晣地勾畫出力學(xué)刺激后人工種植體-骨界面OB、OC在生理、病理過程中的基因表達(dá)的改變。綜上所述，骨作為一個(gè)自適應(yīng)的生物系統(tǒng)是通過多層面、多因素的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控來完成應(yīng)力作用下的骨改建，顯然以往只針對其中某一層面、若干因素的單一視角的研究，難以系統(tǒng)透徹地闡述應(yīng)力作用下骨形成和骨吸收的基因調(diào)控機(jī)制。因此有必要從整個(gè)基因組的水平探討應(yīng)力作用下骨系細(xì)胞上千個(gè)基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)，既要從分子水平來研究其機(jī)理，也要從系統(tǒng)層面動(dòng)態(tài)研究骨系細(xì)胞基因的時(shí)序變化，把分析和綜合統(tǒng)一起來，同時(shí)也可以對目前眾多單基因水平

12、的研究進(jìn)行分析、評價(jià)和比較，從而明確不同力學(xué)刺激導(dǎo)致骨形成和骨吸收的基因調(diào)控的異同，試圖發(fā)現(xiàn)新的重要的調(diào)控基因，篩選出能特異性表明骨形成和骨吸收的“標(biāo)記”基因，不僅為骨生物力學(xué)及骨組織工程學(xué)提供理論依據(jù)，而且對負(fù)荷狀態(tài)下骨組織與人工材料界面骨改建機(jī)制的認(rèn)識(shí)、臨床診斷和防治等也有重要的意義。參考文獻(xiàn)：1、Lee TC, Staines A, Taylor D. Bone adaptation to load: microdamage as a stimulus for bone remodelling. J Anat. 2002 Dec;201(6):437-46.2、Femor B,Cundl

13、e R, Evans M,et al.Primary human osteoblast proliferation and prostagland in E2 release in response to mechanical strain in vitro. Bone ,1998;22(6:)637.4、Peake MA, El Haj AJ.Preliminary characterisation of mechanoresponsive regions of the c-fos promoter in bone cells.FEBS Lett. 2003 Feb 27;537(1-3):

14、117-20. 5、Kletsas,Dimitris,Basdra,et al. Effect of proteinkinase Inhibitor on the stretch-elicited c-fos and c-jun up-regulation In human PDL osteoblast-like cells J.Cell Physiol,2002,190(3):313321.6、Ikegame M,Ishibashi O,YOSHIZAWA T,et al.Tensile stress Induces bone morphogenetic protein 4 in preos

15、teoblastic and fibroblastic cells,which later differentiate into osteoblasts leading to osteogenesis in the mouse calvariae in organ culrure JBone Miner Res,2001,16(1):24-32.7、Pavlin D, Zadro R, Gluhak-Heinrich J. Temporal pattern of stimulation of osteoblast-associated genes during mechanically-ind

16、uced osteogenesis in vivo: early responses of osteocalcin and type I collagen. Connect Tissue Res. 2001 Oct;42(2):135-48. 8、 Cillo JE,Gassner R,Koepsel RR, et al. Growth factor and cytokine gene expression In mechanically strained human osteoblast-like cells:Implicaltions for distraction osteogenesi

17、s J.Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod,2000,90(2):147154.9、 Nakamura I, Rodan GA, Duong le T.Regulatory mechanism of osteoclast activation.J Electron Microsc (Tokyo). 2003;52(6):527-33.10、Winter LC, Walboomers XF, Bumgardner JD, Jansen JA.Intermittent versus continuous stretching effects on oste

18、oblast-like cells in vitro. J Biomed Mater Res. 2003 Dec 15; 67A(4): 1269-75.11、Di Palma F, Douet M, Boachon C, et al. Physiological strains induce differentiation in human osteoblasts cultured on orthopaedic biomaterial. Biomaterials. 2003 Aug; 24(18): 3139-51. 12、Rosenberg N.The role of the cytosk

19、eleton in mechanotransduction in human osteoblast-like cells.Hum Exp Toxicol. 2003 May;22(5):271-4. 13、Moalli MR, Caldwell NJ, Patil PV, et al.An in vivo model for investigations of mechanical signal transduction in trabecular bone.J Bone Miner Res. 2000 Jul;15(7):1346-53. 14、 Filippo G,Giancotti an

20、d Erkki Ruoslahti . Science 1999 August 13; 285: 1028-1033. 15、Li L, Chen M, Deng L, Mao Y, et al.The effect of mechanical stimulation on the expression of alpha 2, beta 1, beta 3 integrins and the proliferation, synthetic function in ratosteoblasts.Sheng Wu Yi Xue Gong Cheng Xue Za Zhi. 2003 Jun;20

21、(2):187-92. 16、Vaes BL, Dechering KJ, Feijen A, et al.Comprehensive microarray analysis of bone morphogenetic protein 2-induced osteoblast differentiation resulting in the identification of novel markers for bone development.J Bone Miner Res. 2002 Dec;17(12):2106-18. 17、Schena M.Shalon D. Davis R W.

22、 Brown P O.Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray. Science,1995,270(20):467-470.18、Qackenbush J. Genomics Microarrays-guilt by association science,2003, 302(5643):249-55.19、Yim SH, Ward JM, Dragan Y, et al.Microarray analysis using amplified mRNA from

23、 laser capture microdissection of microscopic hepatocellular precancerous lesions and frozen hepatocellular carcinomas reveals unique and consistent gene expression profiles.Toxicol Pathol. 2003 May-Jun;31(3):295-303.20、Ying SY, Lin SL.Gene expression in precursor cells of prostate cancer associated

24、 with activin by combination of subtractive hybridization and microarray technologies.Biochem Biophys Res Commun. 2004 Jan 2;313(1):104-9.2、項(xiàng)目的研究內(nèi)容、研究目標(biāo),以及擬解決的關(guān)鍵問題。研究內(nèi)容：第一部分：建立將力學(xué)刺激傳遞到骨系細(xì)胞的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證間斷力學(xué)刺激與骨形成和骨破壞之間的關(guān)系，確定本實(shí)驗(yàn)中擬采用的“生理”負(fù)荷和“超”負(fù)荷的標(biāo)準(zhǔn)力值。第二部分：體外培養(yǎng)OB和OC，采用基因芯片法檢測不同力值的間斷力學(xué)刺激下OB和OC基因表達(dá)譜的時(shí)

25、序變化。第三部分: 利用激光捕獲顯微分離技術(shù), 采集動(dòng)物模型體內(nèi)種植體骨界面區(qū)域的OB和OC,再用基因芯片法檢測“生理”負(fù)荷和“超”負(fù)荷下各類細(xì)胞基因表達(dá)譜的時(shí)序變化。第四部分：采用RT-PCR方法，對骨形成和骨破壞過程中OB、OC基因表達(dá)變化差異最大的幾個(gè)基因進(jìn)行檢測和驗(yàn)證。第五部分：統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較體內(nèi)外OB、OC基因表達(dá)的時(shí)序變化和差異，分析從骨形成到骨破壞過程中整個(gè)基因組表達(dá)的差異及其作用機(jī)制。研究目標(biāo)：本研究擬通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，探討從骨形成到骨破壞這個(gè)質(zhì)的變化過程中骨系細(xì)胞基因表達(dá)的差異，從整體角度分析“生理”負(fù)荷促進(jìn)骨形成和“超”負(fù)荷導(dǎo)致骨破壞的基因調(diào)控機(jī)制，明確相關(guān)的特異性基因表達(dá)，

26、探討OB和OC在力學(xué)刺激下的耦聯(lián)機(jī)制，探索未知的相關(guān)調(diào)控基因或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因，從而為與骨生物力學(xué)相關(guān)的臨床學(xué)科提供分子水平的理論基礎(chǔ)以及臨床應(yīng)用的指導(dǎo)。擬解決的關(guān)鍵問題1）、建立動(dòng)物模型，確定本實(shí)驗(yàn)中擬采用的“生理”負(fù)荷和“超”負(fù)荷的標(biāo)準(zhǔn)力值。2）、通過體內(nèi)體外OB和OC，在間斷力學(xué)刺激下不同時(shí)間點(diǎn)取樣的基因表達(dá)譜的比較，研究骨系細(xì)胞基因表達(dá)的時(shí)序變化。3）、通過體內(nèi)體外OB和OC基因表達(dá)譜差異的對比分析，探討OB和OC的耦聯(lián)機(jī)制。4）、通過探索骨形成和骨破壞過程中OB和OC特異性基因表達(dá)的種類和豐度，嘗試找尋相應(yīng)的“標(biāo)記”基因。5）、通過基因表達(dá)譜的比較，結(jié)合基因數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)，結(jié)合重要調(diào)控

27、基因的發(fā)現(xiàn)，從整體角度分析負(fù)荷狀態(tài)下骨組織與人工材料界面骨改建的機(jī)制，為進(jìn)一步研究提供新的線索和思路。3、擬采取的研究方案及可行性分析。研究方案一）、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立及間斷力學(xué)刺激對骨系細(xì)胞影響的觀察1）、選6月齡SD大鼠60只，雌雄各半，分別單側(cè)股骨植入純鈦種植體（2.0，L 8）骨外暴露4mm，以備加力用，2-3月后，X光驗(yàn)證骨整合者備用。 2）、隨機(jī)分為5組，Zwick1454自動(dòng)材料萬能試驗(yàn)機(jī)分別以0N，5N，10N，20N，40N力值、2HZ的頻率給種植體軸向加載，每天3次，每次1小時(shí)，連續(xù)3周。如種植體明顯松動(dòng)，停止加載，取材檢測。3）、3周后取材， 通過骨形態(tài)學(xué)計(jì)量方法分別檢測

28、各種植體周圍骨質(zhì)的骨小梁表面成骨細(xì)胞數(shù)、骨小梁表面破骨細(xì)胞數(shù)、有成骨細(xì)胞被覆的類骨質(zhì)表面占骨小梁總表面的百分比、骨小梁吸收表面占骨小梁總表面的百分比等相關(guān)指標(biāo)檢測。4）、各指標(biāo)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，確定臨界負(fù)荷及本課題將采用的“生理”負(fù)荷和“超”負(fù)荷的標(biāo)準(zhǔn)力值。二）、體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞在間斷力學(xué)刺激下基因表達(dá)譜的基因芯片檢測1）、體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，觀察不同負(fù)荷下的生物學(xué)性狀。（已積累經(jīng)驗(yàn)）2）、將前期實(shí)驗(yàn)測出的標(biāo)準(zhǔn)“生理”負(fù)荷和“超”負(fù)荷換算成大氣壓，通過氣壓加壓裝置間斷加力于體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，其力學(xué)參數(shù)參考前期實(shí)驗(yàn)。3）、將“生理”負(fù)荷和“超”負(fù)荷作用于成骨細(xì)胞，以1

29、h ,24h ，48 h，4d為取樣點(diǎn)，未加力為對照，抽提mRNA后，逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記cDNA ，應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測成骨細(xì)胞基因表達(dá)譜的時(shí)序變化。(取樣時(shí)間點(diǎn)系根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)總結(jié)、臨床經(jīng)驗(yàn)、及參考相關(guān)文獻(xiàn)提出)4）、將“生理”負(fù)荷和“超”負(fù)荷作用于破骨細(xì)胞，以1h ,24h ，48 h，4d 為取樣點(diǎn)，未加力為對照，抽提mRNA后，逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記cDNA ，應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測成骨細(xì)胞基因表達(dá)譜的時(shí)序變化。三）、體內(nèi)骨組織不同負(fù)荷和時(shí)間下成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞基因表達(dá)譜基因芯片檢測1）、90只SD大鼠動(dòng)物模型，隨機(jī)分為三組，每組各30只。2）、I組：按“生理”負(fù)荷力值加載，隨機(jī)選5只大鼠，分成6小組，分別在

30、1h加載后，以及24h, 48 h，4d加載（每天3次，每次1小時(shí)）后取下大鼠股骨，分別分離種植體和骨組織，取與種植體交界處骨組織，采用激光捕獲顯微分離技術(shù)分別分離出成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，將每小組5個(gè)樣品的成骨細(xì)胞（或破骨細(xì)胞）等量混合，抽提mRNA，逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記cDNA,基因芯片檢測成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的基因表達(dá)譜（基因芯片為大鼠Oligo基因芯片，6000個(gè)cDNA的微陣列，由北京博奧生物芯片有限公司協(xié)助制備）。3）、II組：按“超”負(fù)荷力值加載后，隨機(jī)選5只大鼠，分成6小組，分別在1h加載后，以及24h，48h,6d加載（每天3次，每次1小時(shí)）后取下大鼠股骨，其余方法同I組。4）、III組：無

31、負(fù)荷加栽組，與上兩組同期取種植體周圍骨組織，抽提成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞mRNA，逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記cDNA,基因芯片檢測成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞基因表達(dá)譜。四）、采用RT-PCR檢測不同負(fù)荷下表達(dá)差異明顯的基因擬對在骨形成和骨吸收中基因表達(dá)差異（上調(diào)或下調(diào)）超過5倍的基因，應(yīng)用RT-PCR法進(jìn)行基因表達(dá)水平的半定量測定，并結(jié)合基因數(shù)據(jù)庫分析此生理過程中涉及功能性基因的種類和變化的幅度，以期闡明“標(biāo)記”基因。1）、樣品在做基因芯片檢測之前，提取部分細(xì)胞，標(biāo)記，液氮凍存?zhèn)溆谩?）、據(jù)基因芯片檢測的結(jié)果，對I、II組基因表達(dá)差異最大的數(shù)個(gè)基因通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法，抽提細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，再通

32、過隨機(jī)引物法對此類基因進(jìn)行基因表達(dá)水平的半定量分析。結(jié)合基因數(shù)據(jù)庫，分析這些基因的主要功能及作用。五）、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，明確間斷壓力下的骨形成和骨破壞過程中，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)和時(shí)序變化，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的對比，探討成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞在間斷力學(xué)刺激下的耦聯(lián)機(jī)制。 生理負(fù)荷 超負(fù)荷體外培養(yǎng)的成骨(OB)細(xì)胞和破骨細(xì)胞(OC)體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞(OB)和破骨細(xì)胞(OC) 基因芯片 基因芯片 體外OB、OC基因表達(dá)譜的時(shí)序變化體外OB、OC基因表達(dá)譜的時(shí)序變化研究骨形成到骨吸收質(zhì)的變化過程中，OB、OC基因調(diào)控機(jī)理。1、 RT-PCR法檢測OB、OC表達(dá)差異最大的

33、幾個(gè)基因；2、 結(jié)合基因數(shù)據(jù)庫，明確“標(biāo)記”基因及功能。骨界面OB、OC基因表達(dá)譜的時(shí)序變化骨界面OB、OC基因表達(dá)譜的時(shí)序變化基因芯片 基因芯片 提取骨界面取材的OB和OC提取骨界面取材的OB和OC激光捕獲激光捕獲體內(nèi)種植體骨界面區(qū)域的骨組織體內(nèi)種植體骨界面區(qū)域的骨組織 生理負(fù)荷超負(fù)荷可行性分析：1、項(xiàng)目是在大量查閱國際最新相關(guān)文獻(xiàn)資料，并結(jié)合申請者本人相關(guān)的前期工作的基礎(chǔ)上，采用了多種學(xué)科、多種技術(shù)相結(jié)合的綜合性研究方法，從而保證了立題的新穎性、科學(xué)性和可靠性。2、本項(xiàng)目在技術(shù)思想上是課題“？”的延續(xù)和發(fā)展。在前期相關(guān)的研究中發(fā)現(xiàn)，在生理范圍內(nèi)，機(jī)械應(yīng)力的增加導(dǎo)致與成骨相關(guān)基因表達(dá)（比如轉(zhuǎn)

34、化生長因子-1、骨形成蛋白-4）的激活或上調(diào)，有理由相信可能存在破骨相關(guān)基因的滅活或下調(diào)（或相對水平的下調(diào)）。反之亦然。此二者對比，結(jié)合相同條件下體內(nèi)外基因表達(dá)譜的異同，我們預(yù)期能篩選出與骨形成、骨破壞以及信息耦聯(lián)密切相關(guān)的特異性基因，并可進(jìn)一步研究其互關(guān)系。3、項(xiàng)目申請者多年從事生物力學(xué)、分子生物學(xué)的相關(guān)的研究，在臨床和科研上有著多年的組織和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。近年先后承擔(dān)省科技攻關(guān)計(jì)劃市科委基金等科研項(xiàng)目積累了與該項(xiàng)目相關(guān)的工作經(jīng)驗(yàn)，特別是將力學(xué)刺激傳遞到骨系細(xì)胞的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕ⅲ瑸楸卷?xiàng)目的完成奠定了基礎(chǔ)。4、與課題相關(guān)的基因芯片檢測技術(shù)比較成熟，課題組成員有一定的工作經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)，已同生物科技有

35、限公司，生物芯片有限公司達(dá)成協(xié)議，基因芯片的制備和相關(guān)技術(shù)支持可以得到保證。5、激光捕獲顯微分離技術(shù)（Laser Capture Microdissection LCM）在軟組織應(yīng)用以很成熟，課題組成員有在骨松質(zhì)捕獲細(xì)胞的經(jīng)驗(yàn)，所需設(shè)備已具備。4、本項(xiàng)目的特色與創(chuàng)新之處。1）不僅從體外，還通過動(dòng)物模型從體內(nèi)探討力學(xué)刺激作用下成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞上千個(gè)基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)。2）首次應(yīng)用基因芯片技術(shù)從整個(gè)基因組的宏觀水平，探尋不同負(fù)荷狀態(tài)下，骨形成和骨破壞的基因調(diào)控機(jī)制，以及成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞在其中的作用，及其可能的耦聯(lián)機(jī)制。3）在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中采用激光捕獲顯微分離技術(shù)（LCM），從骨組織與人工材料界面捕獲所需的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，使相關(guān)基因的檢測更加準(zhǔn)確。4）通過本課題的研究可能引出的思考： A）不同類型的應(yīng)力，不同的作用方式和時(shí)間均有可能影響基因的表達(dá)，本課題為簡化實(shí)驗(yàn)，突出重點(diǎn)，選用間斷力學(xué)刺激作為力的作用形式。根據(jù)本課題所測得的特異性基因表達(dá)的結(jié)果為基礎(chǔ)，針對不同應(yīng)力形式對骨系細(xì)胞基因表達(dá)的影響是否存在差異這一尚存爭論的問題，通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用聚類分析等方法，可以給出基因水平的判別。B）、若體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的特異性基因表達(dá)是體外細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)中沒有出現(xiàn)的，