內(nèi)標(biāo)法及外標(biāo)法方法原理優(yōu)缺點(diǎn)

1、An internal standard should be used when performing MS quantitation. An appropriate internal standard will control for extraction, HPLC injection and ionization variability. In a complex matrix it is not uncommon for two different standard levels in SRM integrated plots, at the lower end of the stan

2、dard curve, to give nearly an identical response. It is only when an internal standard is used that the two points can be differentiated. Some researchers attempt to prepare standard curves and run samples without an internal standard and find moderate success. Often without an internal standard % R

3、SDs of replicates can be as high as 20%. Using an internal standard the % RSDs can be brought down to approximately 2%. We run triplicates at each level of our standard curve.How do I choose an internal standard?The best internal standard is an isotopically labeled version of the molecule you want t

4、o quantify. An isotopically labeled internal standard will have a similar extraction recovery, ionization response in ESI mass spectrometry, and a similar chromatographic retention time. If you are performing non-clinical PK quantitation it may be difficult to justify such a standard since a special

5、 synthesis of an isotopically labeled standard can be expensive and time consuming. Often if you are working with medicinal chemists they will have a library of compound analogs that can be used as internal standards. These analogs were made in the evolution of the compound to be tested and will be

6、similar to the compound to be quantified and more importantly will be slightly different by parent mass. Try to avoid using de-methylated (-14) or hydroxylated (+16) analogs as internal standards since these are the most common mass shifts observed in naturally occuring metabolites of the parent com

7、pound. A common internal standard is a chlorinated version of the parent molecule. A chlorinated version of the parent molecule will commonly have a similar chromatographic retention time which is an important characteristic of an internal standard. We have found that one of the most important chara

8、cteristics of an internal standard is that it co-elutes with the compound to be quantified.How do I use an internal standard?First of all an internal standard should be added at the beginning of the sample work-up, typically before the plasma crash or solid phase extraction. The internal standard sh

9、ould be added at the same level in every sample including the standards. An internal standard should give a reliable MS response. Care should be taken that the amount of the internal standard is well above the limit of quantitation but not so high as to suppress the ionization of the analyte. How mu

10、ch internal standard should I add?, this is an important question. It pays to know roughly how much compound is in your sample. This can be accomplished by making trial analyses of an early, middle and late time point with perhaps one or two standard points. This information will be very valuable wh

11、en building an appropriate standard curve and in knowing how much internal standard to add. If you were trying to quantify samples in the range of 100 fg to 25 pg and the limit of detection was 100 fg you might add 5 to 10 pg of internal standard to every sample. A good rule of thumb is to target th

12、e internal standard to the lower 1/3 of the working standard curve. This is a range that will give a comfortable response without interfering with the ionization of the analyte.-中文：什么叫內(nèi)標(biāo)法?怎樣選擇內(nèi)標(biāo)物?內(nèi)標(biāo)法是一種間接或相對(duì)的校準(zhǔn)方法。在分析測(cè)定樣品中某組分含量時(shí)，加入一種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)以校誰(shuí)和消除出于操作條件的波動(dòng)而對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生的影響，以提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確度。內(nèi)標(biāo)法在氣相色譜定量分析中是一種重要的技術(shù)。使用內(nèi)

13、標(biāo)法時(shí)，在樣品中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，它可被色譜拄所分離，又不受試樣中其它組分峰的干擾，只要測(cè)定內(nèi)標(biāo)物和待測(cè)組分的峰面積與相對(duì)響應(yīng)值，即可求出待測(cè)組分在樣品中的百分含量。采用內(nèi)標(biāo)法定量時(shí)，內(nèi)標(biāo)物的選擇是一項(xiàng)十分重要的工作。理想地說(shuō)，內(nèi)標(biāo)物應(yīng)當(dāng)是一個(gè)能得到純樣的己知化合物，這樣它能以準(zhǔn)確、已知的量加到樣品中去，它應(yīng)當(dāng)和被分析的樣品組分有基本相同或盡可能一致的物理化學(xué)性質(zhì)(如化學(xué)結(jié)構(gòu)、極性、揮發(fā)度及在溶劑中的溶解度等)、色譜行為和響應(yīng)特征，最好是被分析物質(zhì)的一個(gè)同系物。當(dāng)然，在色譜分析條什下，內(nèi)標(biāo)物必須能與樣品中各組分充分分離。需要指出的是，在少數(shù)情況下，分析人員可能比較關(guān)心化臺(tái)物在一個(gè)復(fù)雜過(guò)程中

14、所得到的回收率，此時(shí)，他可以使用一種在這種過(guò)程中很容易被完全回收的化臺(tái)物作內(nèi)標(biāo)，來(lái)測(cè)定感興趣化合物的百分回收率，而不必遵循以上所說(shuō)的選擇原則。在使用內(nèi)標(biāo)法定量時(shí)，有哪些因素會(huì)影響內(nèi)標(biāo)和被測(cè)組分的峰高或峰面積的比值?影響內(nèi)標(biāo)和被測(cè)組分峰高或峰面積比值的因素主要有化學(xué)方面的、色譜方面的和儀器方面的三類(lèi)。由化學(xué)方面的原因產(chǎn)生的面積比的變化常常在分析重復(fù)樣品時(shí)出現(xiàn)?；瘜W(xué)方面的因素包括：分析測(cè)試百科網(wǎng)uf?6BL(lNb44q#dv3l01、內(nèi)標(biāo)物在樣品里混合不好；分析測(cè)試百科網(wǎng);apWq.k(j分析測(cè)試百科網(wǎng)P0f(DIm1k.J$O2、內(nèi)標(biāo)物和樣品組分之間發(fā)生反應(yīng)，V/VZ;n1Q0(u1y;m)h

15、D pc0G&03、內(nèi)標(biāo)物純度可變等。對(duì)于一個(gè)比較成熟的方法來(lái)說(shuō)，色譜方面的問(wèn)題發(fā)生的可能性更大一些，色譜上常見(jiàn)的一些問(wèn)題(如滲漏)對(duì)絕對(duì)面積的影響比較大，對(duì)面積比的影響則要小一些，但如果絕對(duì)面積的變化已大到足以使面積比發(fā)生顯著變化的程度，那么一定有某個(gè)重要的色譜問(wèn)題存在，比如進(jìn)樣量改變太大，樣品組分濃度和內(nèi)標(biāo)濃度之間有很大的差別，檢測(cè)器非線(xiàn)性等。進(jìn)樣量應(yīng)足夠小并保持不變，這樣才不致于造成檢測(cè)器和積分裝置飽和。如果認(rèn)為方法比較可靠，而色譜固看來(lái)也是正常的話(huà)，應(yīng)著重檢查積分裝置和設(shè)置、斜率和峰寬定位。對(duì)積分裝置發(fā)生懷疑的最有力的證據(jù)是：面積比可變，而峰高比保持相對(duì)恒定，在制作內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)時(shí)應(yīng)注意

16、什么?在用內(nèi)標(biāo)法做色譜定量分析時(shí)，先配制一定重量比的被測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)樣品的混合物做色譜分析，測(cè)量峰面積，做重量比和面積比的關(guān)系曲線(xiàn)，此曲線(xiàn)即為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。在實(shí)際樣品分析時(shí)所采用的色譜條件應(yīng)盡可能與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)時(shí)所用的條件一致，因此，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)時(shí)，不僅要注明色譜條件(如固定相、柱溫、載氣流速等)，還應(yīng)注明進(jìn)樣體積和內(nèi)標(biāo)物濃度。在制作內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)時(shí)，各點(diǎn)并不完全落在直線(xiàn)上，此時(shí)應(yīng)求出面積比和重量比的比值與其平均位的標(biāo)準(zhǔn)偏差，在使用過(guò)程中應(yīng)定期進(jìn)行單點(diǎn)校正，若所得值與平均值的偏差小于2，曲線(xiàn)仍可使用，若大于2，則應(yīng)重作曲線(xiàn)，如果曲線(xiàn)在鉸短時(shí)期內(nèi)即產(chǎn)生變動(dòng)，則不宜使用內(nèi)標(biāo)法定量。分析測(cè)試百科網(wǎng)G-2T

17、fizQZsI6_G4Jh0外標(biāo)法用待測(cè)組分的純品作對(duì)照物質(zhì)，以對(duì)照物質(zhì)和樣品中待測(cè)組分的響應(yīng)信號(hào)相比較進(jìn)行定量的方法稱(chēng)為外標(biāo)法。此法可分為工作曲線(xiàn)法及外標(biāo)一點(diǎn)法等。工作曲線(xiàn)法是用對(duì)照物質(zhì)配制一系列濃度的對(duì)照品溶液確定工作曲線(xiàn)，求出斜率、截距。在完全相同的條件下，準(zhǔn)確進(jìn)樣與對(duì)照品溶液相同體積的樣品溶液，根據(jù)待測(cè)組分的信號(hào)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出其濃度，或用回歸方程計(jì)算，工作曲線(xiàn)法也可以用外標(biāo)二點(diǎn)法代替。通常截距應(yīng)為零，若不等于零說(shuō)明存在系統(tǒng)誤差。工作曲線(xiàn)的截距為零時(shí)，可用外標(biāo)一點(diǎn)法(直接比較法)定量。外標(biāo)一點(diǎn)法是用一種濃度的對(duì)照品溶液對(duì)比測(cè)定樣品溶液中i組分的含量。將對(duì)照品溶液與樣品溶液在相同條件下

18、多次進(jìn)樣，測(cè)得峰面積的平均值，用下式計(jì)算樣品中i組分的量：WA(W)(A)式中W與A分別代表在樣品溶液進(jìn)樣體積中所含i組分的重量及相應(yīng)的峰面積。(W)及(A)分別代表在對(duì)照品溶液進(jìn)樣體積中含純品i組分的重量及相應(yīng)峰面積。外標(biāo)法方法簡(jiǎn)便，不需用校正因子，不論樣品中其他組分是否出峰，均可對(duì)待測(cè)組分定量。但此法的準(zhǔn)確性受進(jìn)樣重復(fù)性和實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定性的影響。此外，為了降低外標(biāo)一點(diǎn)法的實(shí)驗(yàn)誤差，應(yīng)盡量使配制的對(duì)照品溶液的濃度與樣品中組分的濃度相近。外標(biāo)法 external standard method 色譜分析中的一種定量方法，它不是把標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)加入到被測(cè)樣品中，而是在與被測(cè)樣品相同的色譜條件下單獨(dú)測(cè)定，

19、把得到的色譜峰面積與被測(cè)組分的色譜峰面積進(jìn)行比較求得被測(cè)組分的含量。外標(biāo)物與被測(cè)組分同為一種物質(zhì)但要求它有一定的純度，分析時(shí)外標(biāo)物的濃度應(yīng)與被測(cè)物濃度相接近，以利于定量分析的準(zhǔn)確性。-定量分析中怎樣選擇內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法選一與欲測(cè)組分相近但能完全分離的組分做內(nèi)標(biāo)物（當(dāng)然是樣品中沒(méi)有的組分），然后配制欲測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣得相對(duì)校正因子。再將內(nèi)標(biāo)物加入欲測(cè)組分的樣品中，進(jìn)樣后測(cè)得欲測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物的定量參數(shù)。用內(nèi)標(biāo)法公式計(jì)算即可。內(nèi)標(biāo)法是將一定量的純物質(zhì)作內(nèi)標(biāo)物，加入到準(zhǔn)確稱(chēng)量的試樣中，根據(jù)被測(cè)試樣和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量比及其相應(yīng)的色譜峰面積之比，來(lái)計(jì)算被測(cè)組分的含量。 選擇內(nèi)標(biāo)物有4個(gè)要求：1

20、.內(nèi)標(biāo)物應(yīng)是該試樣中不存在的純物質(zhì)；2.它必須完全溶于試樣中，并與試樣中各組分的色譜峰能完全分離；3.加入內(nèi)標(biāo)物的量應(yīng)接近于被測(cè)組分；4.色譜峰的位置應(yīng)與被測(cè)組分的色譜峰的位置相近，或在幾個(gè)被測(cè)組分色譜峰中間。 內(nèi)標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn)是測(cè)定的結(jié)果較為準(zhǔn)確，由于通過(guò)測(cè)量?jī)?nèi)標(biāo)物及被測(cè)組分的峰面積的相對(duì)值來(lái)進(jìn)行計(jì)算的，因而在一定程度上消除了操作條件等的變化所引起的誤差。內(nèi)標(biāo)法的缺點(diǎn)是操作程序較為麻煩，每次分析時(shí)內(nèi)標(biāo)物和試樣都要準(zhǔn)確稱(chēng)量，有時(shí)尋找合適的內(nèi)標(biāo)物也有困難。 外標(biāo)法簡(jiǎn)便，但進(jìn)樣量要求十分準(zhǔn)確，要嚴(yán)格控制在與標(biāo)準(zhǔn)物相同的操作條件下進(jìn)行，否則造成分析誤差，得不到準(zhǔn)確的測(cè)量結(jié)果。內(nèi)標(biāo)與外標(biāo)都是定量的一種方法

21、而已，至于哪一種方法好與不好不能一概而論，做不同的分析，面對(duì)著不同的要求，再加上分析成本分析效率等等問(wèn)題，我想簡(jiǎn)單而有效進(jìn)行定量分析來(lái)滿(mǎn)足要求才是最重要的。1、以前做過(guò)很多醫(yī)藥、農(nóng)藥中間體的芳香族鹵代化合物的常量定量分析，沒(méi)有自動(dòng)進(jìn)樣器，用外標(biāo)法定量，確實(shí)重現(xiàn)性與穩(wěn)定性非常差，結(jié)果經(jīng)常受到搞合成同事的質(zhì)疑。其實(shí)，仔細(xì)分析原因不一定就是外標(biāo)法不適合這種定量分析，首先我們的實(shí)驗(yàn)室儀器和手段是否調(diào)整到一種穩(wěn)定而合理的狀態(tài)了，比如，襯管是否潔凈，玻璃棉的位置是否合適恰當(dāng)（能否使樣品盡可能的汽化）、汽化溫度是否合適、色譜峰形是否對(duì)稱(chēng)（也就是樣品與色譜柱健合相是否匹配）、附近有沒(méi)有其它色譜峰的干擾、選用什

22、么進(jìn)樣方式（如快速進(jìn)樣還是熱針進(jìn)樣）等等因素的影響都需要考慮，如果這些因素都考慮了，按照GMP方法驗(yàn)證對(duì)于精密度的要求，同一樣品進(jìn)6針以上的RSD和配制6個(gè)樣品的定量結(jié)果RSD都能滿(mǎn)足小于1.5%的要求，那么這個(gè)方法用外標(biāo)法就是完全適用的，但是前面的影響因素是一定要都考慮到的，否則談?wù)撨@個(gè)方法是否適用就有失偏頗了。在做過(guò)的許多出口產(chǎn)品的定量分析方法當(dāng)中有許多是一些醫(yī)藥公司提供的比較完善而驗(yàn)證過(guò)的方法，內(nèi)標(biāo)與外標(biāo)都有（他們用的都是自動(dòng)進(jìn)樣）精密度都能滿(mǎn)足RSD小于1.5%的要求，當(dāng)一個(gè)方法能夠滿(mǎn)足測(cè)試要求的時(shí)候，無(wú)論內(nèi)標(biāo)外標(biāo)，都是可行的，當(dāng)然有一個(gè)分析成本和分析時(shí)間的問(wèn)題，內(nèi)標(biāo)的成本和控制溶液、

23、樣品溶液的配制當(dāng)然要比外標(biāo)要高和麻煩一些了。而有些時(shí)候，可能受你實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有儀器和附屬設(shè)備的影響，達(dá)不到一定的要求，而還必須進(jìn)行定量分析，有時(shí)外標(biāo)的結(jié)果可能就要差一些，這時(shí)，你可能就要考慮用內(nèi)標(biāo)法了，可以排除手動(dòng)進(jìn)樣的誤差、分流歧視的影響、包括一些未知因素平行誤差的影響，這時(shí)內(nèi)標(biāo)可能就顯示出它的優(yōu)勢(shì)來(lái)了。2、上面已經(jīng)提到當(dāng)做方法驗(yàn)證的時(shí)候，當(dāng)同一樣品配制6個(gè)樣品溶液用所選用的外標(biāo)法進(jìn)行定量的時(shí)候，RSD都滿(mǎn)足1.5%的要求時(shí)，也分為兩種情況，小于1%和大于1%小于1.5%。如果RSD的結(jié)果小于1%，那這個(gè)方法就沒(méi)有什么可以懷疑的了；如果RSD的結(jié)果大于1%而在1.5%略低一些的范圍活動(dòng)時(shí)，這個(gè)方

24、法的可行性就將受到質(zhì)疑，畢竟這是方法驗(yàn)證，你就要考慮上面1所提到的影響因素的影響了，如果排除掉以上的影響因素，RSD還是在1.5%附近，就要嘗試內(nèi)標(biāo)了，如果內(nèi)標(biāo)結(jié)果的RSD很好，就證明你的這個(gè)方法受實(shí)驗(yàn)條件的影響很大，只能用內(nèi)標(biāo)了，或者干脆將原方法做大的變動(dòng)，再?lài)L試用外標(biāo)法測(cè)試。3、而對(duì)于微量分析，比如農(nóng)藥和獸藥殘留的分析、環(huán)境分析等，根據(jù)不同的限量標(biāo)準(zhǔn)要求對(duì)于精密度的要求也比常量分析的要求要寬松的多，RSD有時(shí)可以允許達(dá)到10%甚至更高，這時(shí)可能外標(biāo)法有更大的應(yīng)用空間。4、單從精密度方面去考慮，排除其它成本和效率的因素，個(gè)人認(rèn)為還是內(nèi)標(biāo)優(yōu)于外標(biāo)。曾經(jīng)做過(guò)一個(gè)中間體二氨基丙醇的常量定量分析，以

25、二乙醇胺為內(nèi)標(biāo)，RTX-5 amine（堿改性） 15m*0.32mm*1.0um色譜柱分析，將配制好的控制溶液（含有內(nèi)標(biāo)物）自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)6針，目的物（二氨基丙醇）與內(nèi)標(biāo)物（二乙醇胺）峰面積比率的RSD為0.18%，而只對(duì)這六針樣品的目的物峰（二氨基丙醇）面積求RSD，結(jié)果為0.71%，通過(guò)這一實(shí)例的結(jié)果大家就會(huì)發(fā)現(xiàn)到底哪個(gè)方法精密度更好了，當(dāng)然是內(nèi)標(biāo)更好了。當(dāng)然這個(gè)化合物的檢測(cè)方法最后根據(jù)上面的驗(yàn)證數(shù)據(jù)用內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)定量都是可以的，實(shí)驗(yàn)室可以自由選擇。但內(nèi)標(biāo)與外標(biāo)精密度結(jié)果的差異是顯然存在的事實(shí)。結(jié)論：應(yīng)用外標(biāo)法能夠滿(mǎn)足要求，首選還是外標(biāo)法了，畢竟簡(jiǎn)單而省事。對(duì)于精密度要求比較高、結(jié)果準(zhǔn)確度會(huì)產(chǎn)生重大影響、實(shí)驗(yàn)室條件不是很理想的等等條件下，用內(nèi)標(biāo)法還是必要的。無(wú)論應(yīng)用那種方法，方法的驗(yàn)證和確認(rèn)都是很重要的，只要是按照程序經(jīng)過(guò)驗(yàn)證和確認(rèn)的方法，都有其應(yīng)用的空間的。外標(biāo)法分析測(cè)試百科網(wǎng)G+?B(f3_w(y分析測(cè)試百科網(wǎng)3?-1L)I-F用被測(cè)化合物的純品作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，配制成一系列的已知濃度的標(biāo)樣。分析測(cè)試百科網(wǎng) d_l6C5r7bGct2!a.Fe yn3cU0注入色譜柱的到其響應(yīng)值（峰面積）。分析測(cè)試百科網(wǎng)9eK )U5QcV/