光學顯微鏡原理分析

1、.光學顯微鏡原理分析一、光學顯微鏡的發(fā)展歷史      早在公元前一世紀，人們就已發(fā)現通過球形透明物體去觀察微小物體時，可以使其放大成像。后來逐漸對球形玻璃外表能使物體放大成像的規(guī)律有了認識。      1590年，荷蘭和意大利的眼鏡制造者已經造出類似顯微鏡的放大儀器。1610年前后，意大利的伽利略和德國的開普勒在研究望遠鏡的同時，改變物鏡和目鏡之間的間隔 ，得出合理的顯微鏡光路結構，當時的光學工匠遂紛紛從事顯微鏡的制造、推廣和改進。      

2、17世紀中葉，英國的胡克和荷蘭的列文胡克，都對顯微鏡的發(fā)展作出了卓越的貢獻。1665年前后，胡克在顯微鏡中參加粗動和微動調焦機構、照明系統(tǒng)和承載標本片的工作臺。這些部件經過不斷改進，成為現代顯微鏡的根本組成部分。      16731677年期間，列文胡抑制成單組元放大鏡式的高倍顯微鏡，其中九臺保存至今。胡克和列文胡克利用自制的顯微鏡，在動、植物機體微觀結構的研究方面獲得了出色成就。      19世紀，高質量消色差浸液物鏡的出現，使顯微鏡觀察微細結構的才能大為進步。1827年阿米奇第一個采用了

3、浸液物鏡。19世紀70年代，德國人阿貝奠定了顯微鏡成像的古典理論基礎。這些都促進了顯微鏡制造和顯微觀察技術的迅速發(fā)展，并為19世紀后半葉包括科赫、巴斯德等在內的生物學家和醫(yī)學家發(fā)現細菌和微生物提供了有力的工具。      在顯微鏡本身結構發(fā)展的同時，顯微觀察技術也在不斷創(chuàng)新：1850年出現了偏光顯微術；1893年出現了干預顯微術；1935年荷蘭物理學家澤爾尼克創(chuàng)造了相襯顯微術，他為此在1953年獲得了諾貝爾物理學獎。      古典的光學顯微鏡只是光學元件和精細機械元件的組合，它以人眼作為接收器

4、來觀察放大的像。后來在顯微鏡中參加了攝影裝置，以感光膠片作為可以記錄和存儲的接收器。現代又普遍采用光電元件、電視攝像管和電荷耦合器等作為顯微鏡的接收器，配以微型電子計算機后構成完好的圖像信息采集和處理系統(tǒng)。      目前全世界最主要的顯微鏡廠家主要有：奧林巴斯、蔡司、徠卡、尼康。國內廠家主要有：江南、麥克奧迪等。    二、顯微鏡的根本光學原理      一折射和折射率      光線在均勻的各向同性介質中，兩點之間以直線傳

5、播，當通過不同密度介質的透明物體時，那么發(fā)生折射現象，這是由于光在不同介質的傳播速度不同造成的。當與透明物面不垂直的光線由空氣射入透明物體如玻璃時，光線在其介面改變了方向，并和法線構成折射角。      二透鏡的性能      透鏡是組成顯微鏡光學系統(tǒng)的最根本的光學元件，物鏡目鏡及聚光鏡等部件均由單個和多個透鏡組成。依其外形的不同，可分為凸透鏡正透鏡和凹透鏡負透鏡兩大類。      當一束平行于光軸的光線通過凸透鏡后相交于一點，這個點稱"

6、;焦點"，通過交點并垂直光軸的平面，稱"焦平面"。焦點有兩個，在物方空間的焦點，稱"物方焦點"，該處的焦平面，稱"物方焦平面"；反之，在象方空間的焦點，稱"象方焦點"，該處的焦平面，稱"象方焦平面"。      光線通過凹透鏡后，成正立虛像，而凸透鏡那么成正立實像。實像可在屏幕上顯現出來，而虛像不能。      三凸透鏡的五種成象規(guī)律     &#

7、160;1.當物體位于透鏡物方二倍焦距以外時，那么在象方二倍焦距以內、焦點以外形成縮小的倒立實象；      2.當物體位于透鏡物方二倍焦距上時，那么在象方二倍焦距上形成同樣大小的倒立實象；      3.當物體位于透鏡物方二倍焦距以內，焦點以外時，那么在象方二倍焦距以外形成放大的倒立實象；      4.當物體位于透鏡物方焦點上時，那么象方不能成象；      5.當物體位于透鏡物方焦點以內時，

8、那么象方也無象的形成，而在透鏡物方的同側比物體遠的位置形成放大的直立虛象。  三、光學顯微鏡的成象幾何成象原理      只有當物體對人眼的張角不小于某一值時，肉眼才能區(qū)別其各個細部，該量稱為目視分辨率。在最正確條件下，即物體的照度為5070lx及其對比度較大時，可到達1。為易于觀測，一般將該量加大到2，并取此為平均目鏡分辨率。      物體視角的大小與該物體的長度尺寸和物體至眼睛的間隔 有關。有公式y(tǒng)=L      間隔 L不能獲得

9、很小，因為眼睛的調節(jié)才能有一定限度，尤其是眼睛在接近調節(jié)才能的極限范圍工作時，會使視力極度疲勞。對于標準正視而言，最正確的視距規(guī)定為250mm明視間隔 。這意味著，在沒有儀器的條件下，目視分辨率=2的眼睛，能清楚地區(qū)分大小為0.15mm的物體細節(jié)。      在觀測視角小于1的物體時，必須使用放大儀器。放大鏡和顯微鏡是用于觀測放置在觀測人員近處應予放大的物體的。      一放大鏡的成像原理      外表為曲面的玻璃或其他透明材料制成的光學透鏡

10、可以使物體放大成像，光路圖如圖1所示。位于物方焦點F以內的物AB，其大小為y，它被放大鏡成一大小為y的虛像AB。      放大鏡的放大率      =250/f      式中250-明視間隔 ，單位為mm      f-放大鏡焦距，單位為mm      該放大率是指在250mm的間隔 內用放大鏡觀察到的物體像的視角同沒有放大鏡觀察到的物體視角的

11、比值。      二顯微鏡的成像原理      顯微鏡和放大鏡起著同樣的作用，就是把近處的微小物體成一放大的像，以供人眼觀察。只是顯微鏡比放大鏡可以具有更高的放大率而已。      圖2是物體被顯微鏡成像的原理圖。圖中為方便計，把物鏡L1和目鏡L2均以單塊透鏡表示。物體AB位于物鏡前方，分開物鏡的間隔 大于物鏡的焦距，但小于兩倍物鏡焦距。所以，它經物鏡以后，必然形成一個倒立的放大的實像AB。AB位于目鏡的物方焦點F2上，或者在很靠近F2的位置上。

12、再經目鏡放大為虛像AB后供眼睛觀察。虛像AB的位置取決于F2和AB之間的間隔 ，可以在無限遠處當AB位于F2上時，也可以在觀察者的明視間隔 處當AB在圖中焦點F2之右邊時。目鏡的作用與放大鏡一樣。所不同的只是眼睛通過目鏡所看到的不是物體本身，而是物體被物鏡所成的已經放大了一次的像。      三顯微鏡的重要光學技術參數      在鏡檢時，人們總是希望能明晰而亮堂的理想圖象，這就需要顯微鏡的各項光學技術參數到達一定的標準，并且要求在使用時，必須根據鏡檢的目的和實際情況來協(xié)調各參數的關系。只有這樣

13、，才能充分發(fā)揮顯微鏡應有的性能，得到滿意的鏡檢效果。      顯微鏡的光學技術參數包括：數值孔徑、分辨率、放大率、焦深、視場寬度、覆蓋差、工作間隔 等等。這些參數并不都是越高越好，它們之間是互相聯(lián)系又互相制約的，在使用時，應根據鏡檢的目的和實際情況來協(xié)調參數間的關系，但應以保證分辨率為準。      1數值孔徑      數值孔徑簡寫NA，數值孔徑是物鏡和聚光鏡的主要技術參數，是判斷兩者尤其對物鏡而言性能上下的重要標志。其數值的大小，分別標刻在

14、物鏡和聚光鏡的外殼上。      數值孔徑NA是物鏡前透鏡與被檢物體之間介質的折射率n和孔徑角u半數的正弦之乘積。用公式表示如下：NA=nsinu/2      孔徑角又稱"鏡口角"，是物鏡光軸上的物體點與物鏡前透鏡的有效直徑所形成的角度。孔徑角越大，進入物鏡的光通亮就越大，它與物鏡的有效直徑成正比，與焦點的間隔 成反比。      顯微鏡觀察時，假設想增大NA值，孔徑角是無法增大的，唯一的辦法是增大介質的折射率n值。基于這一

15、原理，就產生了水浸物鏡和油浸物鏡，因介質的折射率n值大于1，NA值就能大于1。      數值孔徑最大值為1.4，這個數值在理論上和技術上都到達了極限。目前，有用折射率高的溴萘作介質，溴萘的折射率為1.66,所以NA值可大于1.4。      這里必須指出，為了充分發(fā)揮物鏡數值孔徑的作用，在觀察時，聚光鏡的NA值應等于或略大于物鏡的NA值。      數值孔徑與其他技術參數有著親密的關系，它幾乎決定和影響著其他各項技術參數。它與分辨率成正比，與放

16、大率成正比，與焦深成反比，NA值增大，視場寬度與工作間隔 都會相應地變小。   2分辨率      顯微鏡的分辨率是指能被顯微鏡明晰區(qū)分的兩個物點的最小間距，又稱"鑒別率"。其計算公式是=/NA      式中為最小分辨間隔 ；為光線的波長；NA為物鏡的數值孔徑。可見物鏡的分辨率是由物鏡的NA值與照明光源的波長兩個因素決定。NA值越大，照明光線波長越短，那么值越小，分辨率就越高。      要進步分辨率，即

17、減小值，可采取以下措施      1降低波長值，使用短波長光源。      2增大介質n值以進步NA值NA=nsinu/2。      3增大孔徑角u值以進步NA值。      4增加明暗反差。      3放大率和有效放大率      由于經過物鏡和目鏡的兩次放大，所以顯微鏡總的放大率應該是物鏡放

18、大率和目鏡放大率1的乘積：      =1      顯然，和放大鏡相比，顯微鏡可以具有高得多的放大率，并且通過調換不同放大率的物鏡和目鏡，能夠方便地改變顯微鏡的放大率。      放大率也是顯微鏡的重要參數，但也不能盲目相信放大率越高越好。顯微鏡放大倍率的極限即有效放大倍率。      分辨率和放大倍率是兩個不同的但又互有聯(lián)系的概念。有關系式：500NA<<1000NA 

19、    當選用的物鏡數值孔徑不夠大，即分辨率不夠高時，顯微鏡不能分清物體的微細結構，此時即使過度地增大放大倍率，得到的也只能是一個輪廓雖大但細節(jié)不清的圖像，稱為無效放大倍率。反之假設分辨率已滿足要求而放大倍率缺乏，那么顯微鏡雖已具備分辨的才能，但因圖像太小而仍然不能被人眼明晰視見。所以為了充分發(fā)揮顯微鏡的分辨才能，應使數值孔徑與顯微鏡總放大倍率合理匹配。      4焦深      焦深為焦點深度的簡稱，即在使用顯微鏡時，當焦點對準某一物體時，不僅位于該點

20、平面上的各點都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度內，也能看得清楚，這個清楚部分的厚度就是焦深。焦深大,可以看到被檢物體的全層，而焦深小，那么只能看到被檢物體的一薄層，焦深與其他技術參數有以下關系：      1焦深與總放大倍數及物鏡的數值孔徑成反比。      2焦深大，分辨率降低。      由于低倍物鏡的景深較大，所以在低倍物鏡照相時造成困難。在顯微照相時將詳細介紹。      5視場直徑

21、FieldOfView      觀察顯微鏡時，所看到的亮堂的圓形范圍叫視場，它的大小是由目鏡里的視場光闌決定的。      視場直徑也稱視場寬度，是指在顯微鏡下看到的圓形視場內所能容納被檢物體的實際范圍。視場直徑愈大，愈便于觀察。      有公式F=FN/      式中F:視場直徑，FN：視場數FieldNumber,簡寫為FN，標刻在目鏡的鏡筒外側，:物鏡放大率。   

22、   由公式可看出：      1視場直徑與視場數成正比。      2增大物鏡的倍數，那么視場直徑減小。因此，假設在低倍鏡下可以看到被檢物體的全貌，而換成高倍物鏡，就只能看到被檢物體的很小一部份。      6覆蓋差      顯微鏡的光學系統(tǒng)也包括蓋玻片在內。由于蓋玻片的厚度不標準，光線從蓋玻片進入空氣產生折射后的光路發(fā)生了改變，從而產生了相差，這就是覆蓋差。覆蓋

23、差的產生影響了顯微鏡的成響質量。      國際上規(guī)定，蓋玻片的標準厚度為0.17mm，許可范圍在0.16-0.18mm，在物鏡的制造上已將此厚度范圍的相差計算在內。物鏡外殼上標的0.17，即說明該物鏡所要求的蓋玻片的厚度。      7工作間隔 WD      工作間隔 也叫物距，即指物鏡前透鏡的外表到被檢物體之間的間隔 。鏡檢時，被檢物體應處在物鏡的一倍至二倍焦距之間。因此，它與焦距是兩個概念，平時習慣所說的調焦，實際上是調節(jié)工作間隔 。&#

24、160;     在物鏡數值孔徑一定的情況下，工作間隔 短孔徑角那么大。      數值孔徑大的高倍物鏡，其工作間隔 小。  四物鏡      物鏡是顯微鏡最重要的光學部件，利用光線使被檢物體第一次成象，因此直接關系和影響成象的質量和各項光學技術參數，是衡量一臺顯微鏡質量的首要標準。      物鏡的結構復雜，制作精細，由于對象差的校正，金屬的物鏡筒內由相隔一定間隔 并被固定的透鏡組組合而成。物鏡

25、有許多詳細的要求，如合軸,齊焦。      齊焦既是在鏡檢時，當用某一倍率的物鏡觀察圖象明晰后，在轉換另一倍率的物鏡時，其成象亦應根本明晰，而且象的中心偏離也應該在一定的范圍內，也就是合軸程度。齊焦性能的優(yōu)劣和合軸程度的上下是顯微鏡質量的一個重要標志，它是與物鏡的本身質量和物鏡轉換器的精度有關。      現代顯微物鏡已到達高度完善，其數值孔徑已接近極限，視場中心的分辨率與理論值之區(qū)別已微乎其微。但繼續(xù)增大顯微物鏡視場與進步視場邊緣成象質量的可能性仍然存在，這種研究工作，至今仍在進行。 

26、;     顯微物鏡與目鏡在參于成象這點上是有區(qū)別的。物鏡是顯微鏡最復雜和最重要的部分，在寬光束中工作孔徑大，但這些光束與光軸的傾角較小視場小；目鏡在窄光束中工作，但其傾角大視場大。當計算物鏡與目鏡，在消除象差上有很大差別。      與寬光束有關的象差是球差、慧差以及位置色差；與視場有關的象差是象散、場曲、畸變以及倍率包差。      顯微物鏡是一消球差系統(tǒng)。這意味著：就軸上的一對共軛點而言，消除了球差并且實現了正弦條件時，每一物鏡僅有兩個這種消球差點。

27、因此，物體與象的計算位置的任何改變均導致象差變大。      1物鏡的主要參數      1放大率      2數值孔徑NA      3機械筒長L：在顯微鏡中，物鏡支承面到目鏡支承面之間的間隔 稱為機械筒長。對于一臺顯微鏡來說，機械筒長是固定的。我國規(guī)定機械筒長是160毫米。      4蓋玻片厚度d    

28、0; 5工作間隔 WD      這些參數，大多刻在物鏡筒上，如圖3所示。      有一種所謂筒長無限的顯微物鏡，這種物鏡的前方一般帶有輔助物鏡也叫補償物鏡或鏡筒物鏡，被觀察物體位于物鏡前焦點上，經過物鏡以后，成像在無限遠，再經過輔助物鏡成像在輔助物鏡的焦平面上，如圖4所示。在物鏡和輔助物鏡之間是平行光，所以中間間隔 比較自由一些，可以參加棱鏡等光學元件。      2物鏡的根本類型     &

29、#160;1按顯微鏡鏡筒長度以mm計：透射光用160鏡筒，帶0.17mm厚或更厚的蓋玻片；反射光用190鏡筒，不帶蓋玻片；透射光與反射光用鏡筒，筒長無限大。      2按浸法特征：非浸式干式、浸式油浸、水浸、甘油浸及其它浸法。      3按光學裝置：透射式、反射式以及折反射式。      4按數值孔徑和放大倍數：低倍NA0.2與10X，中倍NA0.65與40X，高倍NA0.65與40X。     

30、60;5按校正象差的情況不同，通常分為消色差物鏡，半復消色差物鏡，復消色差物鏡，平視場消色差物鏡，平視場復消色差物鏡和單色物鏡。      a.消色差物鏡Achromaticobjective      這是應用最廣泛的一類顯微物鏡，外殼上常有"Ach"字樣。它校正了軸上點的位置色差紅，藍二色、球差黃綠光和正弦差，保持了齊明條件。軸外點的象散不超過允許值4屬光度，二級光譜未校正。      數值孔徑為0.10.15的低倍消色差

31、物鏡一般由兩片透鏡膠合在一起的雙膠物鏡構成。數值孔徑至0.2的消色差物鏡由兩組雙膠透鏡構成。當數值孔徑增大到0.3時，再參加一平凸透鏡，該平凸透鏡決定著物鏡的焦距，而其它透鏡那么補償由其平面與球面產生的象差。高倍物鏡的平面象差可用浸法消除。高倍消色差物鏡一般均為浸式，由四部分構成：前片透鏡、新月形透鏡及兩個雙膠透鏡組。      b.復消色差物鏡Apochromaticobjective      這類物鏡的結構復雜，透鏡采用了特種玻璃或螢石等材料制作而成，物鏡的外殼上標有"Apo&q

32、uot;字樣。它對兩個色光實現了正弦條件，要求嚴格地校正軸上點的位置色差紅，藍二色、球差紅，藍二色和正弦差，同時要求校正二級光譜再校正綠光的位置色差。其倍率色差并不能完全校正，一般須用目鏡補償。      由于對各種象差的校正極為完善，比響應倍率的消色差物鏡有更大的數值孔徑，這樣不僅分辨率高，象質量優(yōu)而且也有更高的有效放大率。因此，復消色差物鏡的性能很高，適用于高級研究鏡檢和顯微照相。      c.半復消色差物鏡Semiapochromaticobjective   

33、60;  半復消色差物鏡又稱氟石物鏡，物鏡的外殼上標有"FL"字樣。在結構上透鏡的數目比消色差物鏡多，比復消色差物鏡少，成象質量上，遠較消色差物鏡為好，接近于復消色差物鏡。      d.平視場物鏡Planobjective      平場物鏡是在物鏡的透鏡系統(tǒng)中增加一快半月形的厚透鏡，以到達校正場曲的缺陷，進步視場邊緣成像質量的目的。平場物鏡的視場平坦，更適用于鏡檢和顯微照相。對于平視場消色差物鏡，其倍率色差不大，不必用特殊目鏡補償。而平視場復消色差物鏡

34、，那么必須用目鏡來補償它的倍率色差。      e.單色物鏡      這類物鏡由石英、熒石或氟化鋰制的一組單片透鏡構成。只能在紫外線光譜區(qū)的個別區(qū)內使用寬度不超過20mm，可見光譜區(qū)不能采用單色物鏡。這類物鏡均制成反射式與折反射式系統(tǒng)。主要缺點是相當大一部分光束在中心被遮蔽入瞳面積的25%。在新型折反射系統(tǒng)中，由于采用半透明反射鏡以及物鏡的膠合結構，使這一缺點大為減輕，從而可以取消反射鏡框的遮光。并且兩同軸反射鏡的剩余象差是互相補償的，同時用透鏡組來增大數值孔徑。假設系統(tǒng)的校正滿意，孔徑到達N

35、A=1.4時，中心遮蔽可不超過入瞳面積的4%。      f.特種物鏡      所謂"特種物鏡"是在上述物鏡的基礎上，專門為到達某些特定的觀察效果而設計制造的。主要有以下幾種：      a帶校正環(huán)物鏡Correctioncollarobjective      在物鏡的中部裝有環(huán)裝的調節(jié)環(huán)，當轉動調節(jié)環(huán)時，可調節(jié)物鏡內透鏡組之間的間隔 ，從而校正由蓋玻片厚度不標準引起的覆蓋

36、差。調節(jié)環(huán)上的刻度可從0.11-.023,在物鏡的外殼上也標科有此數字，說明可校正蓋玻片從0.11-0.23mm厚度之間的誤差。      b帶虹彩光闌的物鏡Irisdiaphragmobjective      在物鏡鏡筒內的上部裝有虹彩光闌，外方也可以旋轉的調節(jié)環(huán)，轉動時可調節(jié)光闌孔徑的大小，這種結構的物鏡是高級的油浸物鏡，它的作用是在暗視場鏡檢時，往往由于某些原因此使照明光線進入物鏡，使視場背景不夠黑暗，造成鏡檢質量的下降。這時調節(jié)光闌的大小，使背景變黑，使被檢物體更亮堂，增強鏡檢效果。&

37、#160;     c相襯物鏡Phasecontrastobjective      這種物鏡是由于相襯鏡檢術的專用物鏡，其特點是在物鏡的后焦平面處裝有相板。      d無罩物鏡Nocoverobjective      有些被檢物體，如涂抹制片等，上面不能加用蓋玻片，這樣在鏡檢時應使用無罩物鏡，否那么圖象質量將明顯下降，特別是在高倍鏡檢時更為明顯。這種物鏡的外殼上常標刻NC，同時在蓋玻片厚度的位置上沒有

38、0.17的字樣，而標刻著"0"。      e長工作間隔 物鏡      這種物鏡是倒置顯微鏡的專用物鏡，它是為了滿足組織培養(yǎng)，懸浮液等材料的鏡檢而設計。  五目鏡      目鏡的作用是把物鏡放大的實象中間象再放大一級，并把物象映入觀察者的眼中，本質上目鏡就是一個放大鏡。顯微鏡的分辨率才能是由物鏡的數值孔徑所決定的，而目鏡只是起放大作用。因此，對于物鏡不能分辨出的結構，目鏡放的再大，也仍然不能分辨出。 

39、    六聚光鏡      聚光鏡裝在載物臺的下方。小型的顯微鏡往往無聚光鏡，在使用數值孔徑0.40以上的物鏡時，那么必須具有聚光鏡。聚光鏡不僅可以彌補光量的缺乏和適當改變從光源射來的光的性質，而且將光線聚焦于被檢物體上，以得到最好的照明效果。      聚光鏡的的結構有多種，同時根據物鏡數值孔徑的大小，相應地對聚光鏡的要求也不同。      1阿貝聚光鏡Abbecondenser   

40、   這是由德國光學大學大師恩斯特.阿貝ErnstAbbe設計。阿貝聚光鏡由兩片透鏡組成，有較好的聚光才能，但是在物鏡數值孔徑高于0.60時，那么色差，球差就顯示出來。因此，多用于普通顯微鏡上。      2消色差聚光鏡Achromaticaplanaticcondenser      這種聚光鏡又名"消球差聚光鏡"和"齊明聚光鏡"，它由一系列透鏡組成，它對色差球差的校正程度很高，能得到理想的圖象，是明場鏡檢中質量最高的一種聚

41、光鏡，其NA值達1.4。因此，在高級研究顯微鏡常配有此種聚光鏡。它不適用于4X以下的低倍物鏡，否那么照明光源不能充滿整個視場。      3搖出式聚光鏡Swingoutcondenser      在使用低倍物鏡時如4X，由于視場大，光源所形成的光錐不能充滿真整個視場，造成視場邊緣部分黑暗，只中央部分被照亮。要使視場充滿照明，就需將聚光鏡的上透鏡從光路中搖出。      4其它聚光鏡      聚

42、光鏡除上述明場使用的類型外，還有作特殊用圖的聚光鏡。如暗視場聚光鏡，相襯聚光鏡，偏光聚光鏡，微分干預聚光鏡等，以上聚光鏡分別適用于相應的觀察方式。      七照明方法      顯微鏡的照明方法按其照明光束的形成，可分為"透射式照明"，和"落射式照明"兩大類。前者適用于透明或半透明的被檢物體，絕大數生物顯微鏡屬于此類照明法；后者那么適用于非透明的被檢物體，光源來自上方，又稱""反射式照明"。主要應用與金相顯微鏡或熒光鏡檢法。

43、      1透射式照明      生物顯微鏡多用來觀察透明標本，需要以透射光來照明。有兩種照明方式      1臨界照明Criticalillumination光源經過聚光鏡后，成像于物平面上，如圖5所示。假設忽略光能的損失，那么光源像的亮度與光源本身一樣，因此，這種方法相當于在物平面上放置光源。顯然，在臨界照明中，假設光源外表亮度不均勻，或明顯地表現出細小的結構，如燈絲等，那么就要嚴重影響顯微鏡觀察效果，這是臨界照明的缺點。其補救的方法是在光

44、源的前方放置乳白和吸熱濾色片，使照明變得較為均勻和防止光源的長時間的照射而損傷被檢物體。用透射光照明時，物鏡成像光束的孔徑角，被聚光鏡像方光束的孔徑角所決定，為使物鏡的數值孔徑得到充分利用，聚光鏡應有與物鏡一樣或稍大的數值孔徑。  2柯拉照明臨界照明中物面光照度不均勻的缺點，在柯拉照明中可以消除。在光源1與聚光鏡5之間加一輔助聚光鏡2，如圖6所示。可見，由于不是直接把光源，而是把被光源均勻照明了的輔助聚光鏡2也稱為柯拉鏡成像在標本6上，所以物鏡的視場標本得到均勻的照明。      2落射式照明    &#

45、160; 在觀察不透明物體時，例如通過金相顯微鏡觀察金屬磨片，往往是采用從側面或者從上面加以照明的方式。此時，被觀察物體的外表上沒有蓋玻璃片，標本像的產生是靠進入物鏡的反射或散射光線。如圖7所示。      3用暗視場來觀察微粒的照明方法      用暗視場方法可以觀察超顯微質點。所謂超顯微質點，是指那些小于顯微鏡分辨極限的微小質點。暗視場照明的原理是：不使主要的照明光線進入物鏡，能夠進入物鏡成像的只是由微粒所散射的光線。因此，在暗的背景上給出了亮的微粒的像，視場背景雖暗，但襯度對比很

46、好，可以使分辨率進步。      暗視場照明又有單向和雙向之分      1單向暗視場照明圖8是單向暗視場照明示意圖。由圖可見，由照明器2發(fā)出的光線，經不透明的標本片1反射后，主要的光線都沒有進入物鏡3，進入物鏡的光線主要是由微粒或凸凹不平的細部所散射的光線。顯然，這種單向的暗視場照明，對觀察微粒的存在和運動是有效的，但對物體細節(jié)的再現不是有效的，即存在"失真"的現象。      2雙向暗視場照明雙向暗視場照明，可以消除單向所

47、產生的失真缺點。在普通的三透鏡聚光鏡前面，安置一個環(huán)形光闌，如圖9即可實現雙向暗視場照明。在聚光鏡的最后一片與載物玻璃片之間浸以液體，而蓋玻璃片與物鏡之間是干的。于是，經過聚光鏡的環(huán)形光束，在蓋玻璃片內全反射而不能進入物鏡，形成如圖中的回路。進入物鏡的只是由標本上的微粒所散射的光線，形成了雙向暗視場照明。            四、光學顯微鏡的組成結構      光學顯微鏡包括光學系統(tǒng)和機械裝置兩大部分，而數碼顯微鏡還包括數碼攝像系統(tǒng)，現分述如下

48、：      一機械裝置      1機架顯微鏡的主體部分，包括底座和彎臂。      2目鏡筒位于機架上方，靠圓形燕尾槽與機架固定，目鏡插在其上。根據有否攝像功能，可分為雙目鏡筒和三目鏡筒；根據瞳距的調節(jié)方式不同，可分為鉸鏈式和平移式。      3物鏡轉換器它是一個旋轉圓盤，上有35個孔，分別裝有低倍或高倍物鏡鏡頭。轉動物鏡轉換器就可讓不同倍率的物鏡進入工作光路。   &#

49、160;  4載物臺是放置玻片的平臺，其中央具有通光孔。臺上有一個彈性的標本夾，用來夾住載玻片。右下方有移動手柄，使載物臺面可在XY雙方向進行移動。      5調焦機構利用調焦手輪可以驅動調焦機構，使載物臺作粗調和微調的升降運動，從而使被觀察物體對焦明晰成像。      6聚光器調節(jié)機構聚光器安裝在其上，調節(jié)螺旋可以使聚光器升降，用以調節(jié)光線的強弱。  二光學系統(tǒng)      1目鏡它是插在目鏡筒頂部的鏡頭

50、，由一組透鏡組成，可以使物鏡成倍地分辨、放大物像，例如10X、15X等。按照所能看到的視場大小，目鏡可分為視場較小的普通目鏡，和視場較大的大視場目鏡或稱廣角目鏡兩類。較高檔顯微鏡的目鏡上還裝有視度調節(jié)機構，操作者可以方便快捷地對左右眼分別進行視度調整；此外，在這些目鏡上可以加裝測量分劃板，測量分劃板的象總能明晰地調焦在標本的焦面上；并且，為了防止目鏡被取走以及減少運輸中被損壞的可能性，這些目鏡可以被鎖定。      2物鏡它安裝在轉換器的孔上，也是由一組透鏡組成的，能夠把物體明晰地放大。物鏡上刻有放大倍數，主要有10X、40X、60X、100X

51、等。高倍物鏡中多采用浸液物鏡，即在物鏡的下外表和標本片的上外表之間填充折射率為1.5左右的液體如杉木油，它能顯著的進步顯微觀察的分辨率。      3光源有鹵素燈、鎢絲燈、汞燈、熒光燈、金屬鹵化物燈等。      4聚光器包括聚光鏡、孔徑光闌。聚光鏡由透鏡組成，它可以集中透射過來的光線，使更多的光能集中到被觀察的部位?？讖焦怅@可控制聚光器的通光范圍，用以調節(jié)光的強度。      三數碼攝像系統(tǒng)     &#

52、160;1攝像頭      2圖像采集卡      3軟件      4微機            五、光學顯微鏡的分類      光學顯微鏡有多種分類方法：按使用目鏡的數目可分為雙目和單目顯微鏡；按圖像是否有立體感可分為立體視覺和非立體視覺顯微鏡；按觀察對像可分為生物和金相顯微鏡等；按光學原理可分

53、為偏光、相襯和微差干預對比顯微鏡等；按光源類型可分為普通光、熒光、紫外光、紅外光和激光顯微鏡等；按接收器類型可分為目視、數碼攝像顯微鏡等。常用的顯微鏡有雙目體視顯微鏡、金相顯微鏡、偏光顯微鏡、熒光顯微鏡等。      1雙目體視顯微鏡      雙目體視顯微鏡又稱"實體顯微鏡"或"解剖鏡"，是一種具有正象立體感地目視儀器。在生物、醫(yī)學領域廣泛用于切片操作和顯微外科手術；在工業(yè)中用于微小零件和集成電路的觀測、裝配、檢查等工作。它具有如下特點：  &

54、#160;   1利用雙通道光路，雙目鏡筒中的左右兩光束不是平行，而是具有一定的夾角-體視角一般為12度-15度，為左右兩眼提供一個具有立體感的圖像。它本質上是兩個單鏡筒顯微鏡并列放置，兩個鏡筒的光軸構成相當于人們用雙目觀察一個物體時所形成的視角，以此形成三維空間的立體視覺圖像。      2象是直立的，便于操作和解剖，這是由于在目鏡下方的棱鏡把象倒轉過來的緣故。      3雖然放大率不如常規(guī)顯微鏡，但其工作間隔 很長。    

55、60; 4焦深大，便于觀察被檢物體的全層。      5視場直徑大。      目前體視鏡的光學結構是：由一個共用的初級物鏡，對物體成象后的兩光束被兩組中間物鏡-變焦鏡分開，并成一體視角再經各自的目鏡成象，它的倍率變化是由改變中間鏡組之間的間隔 而獲得的，因此又稱為"連續(xù)變倍體視顯微鏡"Zoom-stereomicroscope。隨著應用的要求，目前體視鏡可選配豐富的選購附件，如熒光，照相，攝象，冷光源等等。   2金相顯微鏡 

56、60;   金相顯微鏡是專門用于觀察金屬和礦物等不透明物體金相組織的顯微鏡。這些不透明物體無法在普通的透射光顯微鏡中觀察，故金相和普通顯微鏡的主要差別在于前者以反射光，而后者以透射光照明。在金相顯微鏡中照明光束從物鏡方向射到被觀察物體外表，被物面反射后再返回物鏡成像。這種反射照明方式也廣泛用于集成電路硅片的檢測工作。      3偏光顯微鏡Polarizingmicroscope      偏光顯微鏡是用于研究所謂透明與不透明各向異性材料的一種顯微鏡。凡具有雙折射的

57、物質，在偏光顯微鏡下就能分辨的清楚，當然這些物質也可用染色法來進行觀察，但有些那么不可能，而必須利用偏光顯微鏡。      1偏光顯微鏡的特點      將普通光改變?yōu)槠窆膺M行鏡檢的方法，以鑒別某一物質是單折射各向同行或雙折射性各向異性。雙折射性是晶體的根本特性。因此，偏光顯微鏡被廣泛地應用在礦物、化學等領域，在生物學和植物學也有應用。      2偏光顯微鏡的根本原理      偏光顯微鏡的原

58、理比較復雜，在此不作過多介紹,偏光顯微鏡必須具備以下附件：起偏鏡，檢偏鏡，補償器或相位片，專用無應力物鏡，旋轉載物臺。      3偏光鏡檢術的方式      a.正相鏡檢Orthscope:又稱無畸變鏡檢，其特點是使用低倍物鏡，不用伯特蘭透鏡BertrandLens,被研究對象可直接用偏振光研究。同時為使照明孔徑變小，推開聚光鏡的上透鏡。正相鏡檢用于檢查物體的雙折射性。      b.錐光鏡檢Conoscope：又稱干預鏡檢，研究在偏振光干預時

59、產生的干預圖樣，這種方法用于觀察物體的單軸或雙軸性。在該方法中，用強會聚偏振光束照明。      4偏光顯微鏡在裝置上的要求      a.光源：最好采用單色光，因為光的速度，折射率，和干預現象由于波長的不同而有差異。一般鏡檢可使用普通光。      b.目鏡：要帶有十字線的目鏡。      c.聚光鏡：為了獲得平行偏光，應使用能推出上透鏡的搖出式聚光鏡。    &#

60、160; d.伯特蘭透鏡：聚光鏡光路中的輔助部件，這是把物體所有造成的初級相放大為次級相的輔助透鏡。它可保證用目鏡來觀察在物鏡后焦平面中形成的平涉圖樣。      5偏光鏡檢術的要求      a.載物臺的中心與光軸同軸。      b.起偏鏡和檢偏鏡應處于正交位置。      c.制片不宜過薄。    4熒光顯微鏡    &#

61、160; 熒光顯微鏡是用短波長的光線照射用熒光素染色過的被檢物體，使之受激發(fā)后而產生長波長的熒光，然后觀察。熒光顯微鏡廣泛應用于生物，醫(yī)學等領域。      1熒光顯微鏡一般分為透射和落射式兩種類型。      a.透射式：激發(fā)光來自被檢物體的下方，聚光鏡為暗視野聚光鏡，使激發(fā)光不進入物鏡，而使熒光進入物鏡。它在低倍情況下亮堂，而高倍那么暗，在油浸和調中時，較難操作，尤以低倍的照明范圍難于確定，但能得到很暗的視野背景。透射式不使用于非透明的被檢物體。    

62、;  b.落射式：透射式目前幾乎被淘汰，新型的熒光顯微鏡多為落射式，光源來自被檢物體的上方，在光路中具有分光鏡，所以對透明和不透明的被檢物體都適用。由于物鏡起了聚光鏡的作用，不僅便于操作，而且從低倍到高倍，可以實現整個視場的均勻照明。      2熒光鏡檢術的注意事項      a.激發(fā)光長時間的照射，會發(fā)生熒光的衰減和淬滅現象，因此盡可能縮短觀察時間，暫時不觀察時，應用擋板遮蓋激發(fā)光。      b.作油鏡觀察時，應用&qu

63、ot;無熒光油"。      c.熒光幾乎都較弱，應在較暗的室內進行。      d.電源最好裝穩(wěn)壓器，否那么電壓不穩(wěn)不僅會降低汞燈的壽命，也會影響鏡檢的效果。      目前許多新興生物研究領域應用到熒光顯微鏡，如基因原位雜交FISH等等。      5相襯顯微鏡Phasecontrastmicroscope      在光學顯微鏡的發(fā)

64、展過程中，相襯鏡檢術的發(fā)明成功，是近代顯微鏡技術中的重要成就。我們知道，人眼只能區(qū)分光波的波長顏色和振幅亮度，對于無色通明的生物標本，當光線通過時，波長和振幅變化不大，在明場觀察時很難觀察到標本。      相襯顯微鏡利用被檢物體的光程之差進行鏡檢，也就是有效地利用光的干預現象，將人眼不可分辨的相位差變?yōu)榭煞直娴恼穹?，即使是無色透明的物質也可成為明晰可見。這大大便利了活體細胞的觀察，因此相襯鏡檢法廣泛應用于倒置顯微鏡中。      相襯鏡檢法在裝置上與明場不同，有一些特殊要求：  &

65、#160;   a.環(huán)狀光闌Ringslit:裝在聚光鏡的下方，而與聚光鏡組合為一體-相襯聚光鏡。它是由大小不同的環(huán)形光闌裝在一圓盤內，外面標有10X、20X、40X、100X等字樣，與相對應倍數的物鏡配合使用。      b.相板Phaseplate:裝在物鏡的后焦平面處，它分為兩部分，一是通過直射光的部分，為半透明的環(huán)狀，叫共軛面；另一是通過衍射光的部分，?quot;補償面"。有相板的物鏡稱"相襯物鏡"，外殼上常有"Ph"字樣。   

66、0;  相襯鏡檢法是一種比較復雜的鏡檢方法，想要得到好的觀察效果，顯微鏡的調試非常重要。除此之外還應注意以下幾個方面：      a.光源要強，全部開啟孔徑光闌；      b.使用濾色片，使光波近于單色。   6微分干預對比顯微鏡DifferentialinterferencecontrastDIC      微分干預對比鏡檢術出現于60年代，它不僅能觀察無色透明的物體，而且圖象呈現出浮雕壯的立體感，并具

67、有相襯鏡檢術所不能到達的某些優(yōu)點，觀察效果更為逼真。      1原理      微分干預對比鏡檢術是利用特制的渥拉斯頓棱鏡來分解光束。分裂出來的光束的振動方向互相垂直且強度相等，光束分別在間隔 很近的兩點上通過被檢物體，在相位上略有差別。由于兩光束的裂距極小，而不出現重影現象，使圖象呈現出立體的三維感覺。      2微分干預對比鏡檢術所需的特殊部件：      a.起偏鏡  

68、0;   b.檢偏鏡      c.渥拉斯頓棱鏡2塊      3微分干預對比鏡檢時的注意事項      a.因微分干預靈敏度高，制片外表不能有污物和灰塵。      b.具有雙折射性的物質，不能到達微分干預對比鏡檢的效果。      c.倒置顯微鏡應用微分干預時，不能用塑料培養(yǎng)皿。    

69、;  7倒置顯微鏡Invertedmicroscope      倒置顯微鏡是為了適應生物學、醫(yī)學等領域中的組織培養(yǎng)、細胞離體培養(yǎng)、浮游生物、環(huán)境保護、食品檢驗等顯微觀察。      由于上述樣品特點的限制，被檢物體均放置在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中，這樣就要求倒置顯微鏡的物鏡和聚光鏡的工作間隔 很長，能直接對培養(yǎng)皿中的被檢物體進行顯微觀察和研究。因此，物鏡、聚光鏡和光源的位置都顛倒過來，故稱為"倒置顯微鏡"。      由于工作間隔 的限制，倒置顯微鏡物鏡的最大放大率為60X。一般研究用倒置顯微鏡都配置有4X、10X、20X、及40X相差物鏡，因為倒置顯微鏡多用