木瓜蛋白酶活力測定方法

1、木瓜蛋白酶活力測定方法分別精密量取酪蛋白溶液5ml，置3支具塞試管中，置40水浴中保溫10分鐘，各精密加入供試品溶液2ml，搖勻，置40水浴中，開始記時，準確反應(yīng)1小時，立即精密加入三氯醋酸溶液5ml，強力振搖混勻，置40水浴中放置3040分鐘，使沉淀的蛋白質(zhì)完全凝固，濾過，濾液作為供試品溶液。精密量取酪蛋白溶液5ml置另一具試管，于40水浴中保溫1小時，精密加入三氯醋酸溶液5ml，強力振搖混勻，精密加入供試品溶液2ml，置40水浴中放置3040分鐘，濾過，濾液作為空白溶液。照分光光度法（中國藥典2000年版二部附錄IV A），以0.1mol/L鹽酸溶液為空白，在275nm的波長處測定空白溶液

2、、供試品溶液和對照品溶液的吸收度，按下式計算： 效價（單位/mg）=A/AsCs12/2稀釋倍數(shù)/W 式中A為供試品溶液的吸收度減去空白溶液的吸收度： As為酪氨酸對照品溶液的吸收度： Cs為酪氨酸對照品溶液的濃度， ug/ml W為供試品重量，mg; 在上述條件下，釋放1ug的酪氨酸的酶量為一個活力單位。試劑 酪蛋白溶液：取酪蛋白1g，加0.05mol/L磷酸氫二鈉溶液50ml,置沸水浴中煮30分鐘，時時攪拌，冷至室溫，加0.05mol/L枸椽酸溶液調(diào)節(jié)PH至6.0±0.1，并迅速攪拌，防止酪蛋白沉淀，用水稀釋至100ml（臨用新配）。酶稀釋液：取無水磷酸氫二鈉3.55g，加水40

3、0ml溶解，加乙二胺四醋酸二鈉1.1g和鹽酸半胱氨酸2.74g，振搖溶解，用1mol/L鹽酸或1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH6.5±0.1，用水稀釋至500ml,混勻（臨用新配）三氯醋酸溶液:取三氯醋酸17.99g，加醋酸鈉29.94g和冰醋酸18.9ml，加適量水溶解后，加水使成1000ml，搖勻。酶活力測定對照品溶液的制備:精密稱取已105干燥至恒重的酪氨酸對照品適量，用0.1mol/L鹽酸溶液制成每1ml中約含40ug的溶液。供試品溶液的制備:取本品適量（約相當于木瓜酶活力120萬單位），精密稱定，加酶稀釋液振搖，制成每1ml中含200300單位的溶液，搖勻。淀粉酶活力測定實

4、驗技術(shù) 2008-05-27 18:01:29 閱讀213 評論0 字號：大中小 一、目的淀粉是葡萄糖以-1,4糖苷鍵及-1，6糖苷鍵連結(jié)的高分子多糖，是人類和動物的重要食物，也是食品、發(fā)酵、釀造、醫(yī)藥、紡織工業(yè)的基本原料。淀粉酶是加水分解淀粉的酶的總稱，淀粉酶對淀粉的分解作用是工業(yè)上利用淀粉的依據(jù)，也是生物體利用淀粉進行代謝的初級反應(yīng)。小麥成熟期如遇陰雨天氣，有的品種會發(fā)生嚴重的穗發(fā)芽，造成巨大損失，這是小麥種子中淀粉酶活動的結(jié)果。因此，淀粉酶的活性測定，具有理論和應(yīng)用研究的意義。通過本實驗，學(xué)習(xí)酶活測定的一般方法，鞏固并熟練分光光度計的使用。二、原理淀粉酶主要包括-淀粉酶、-淀粉酶、葡萄糖

5、淀粉酶和R-酶，它們廣泛存在于動物、植物和微生物界。不同來源的淀粉酶，性質(zhì)有所不同。植物中最重要的淀粉酶是-淀粉酶和-淀粉酶。-淀粉酶隨機作用于直鏈淀粉和支鏈淀粉的直鏈部分-1,4糖苷鍵，單獨使用時最終生成寡聚葡萄糖、-極限糊精和少量葡萄糖。Ca2+能使-淀粉酶活化和穩(wěn)定，它比較耐熱但不耐酸，pH3.6以下可使其鈍化。-淀粉酶從非還原端作用于-1,4糖苷鍵，遇到支鏈淀粉的-1,6鍵時停止。單獨作用時產(chǎn)物為麥芽糖和-極限糊精。-淀粉酶是一種巰基酶，不需要Ca2+及Cl等輔助因子，最適pH偏酸，與-淀粉酶相反，它不耐熱但覺耐酸，70保溫15min可使其鈍化。通常提取液中-淀粉酶和-淀粉酶同時存在。

6、可以先測定（+）淀粉酶總活力，然后在70加熱15min，鈍化-淀粉酶，測出-淀粉酶活力，用總活力減去-淀粉酶活力，就可求出-淀粉酶活力。淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的還原糖與3,5-二硝基水楊酸的顯色反應(yīng)來測定。還原糖作用于黃色的3,5-二硝基水楊酸生成棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸，生成物顏色的深淺與還原糖的量成正比。以每克樣品在一定時間內(nèi)生成的還原糖（麥芽糖）量表示酶活大小。三、儀器、試劑和材料1.儀器（1）電子頂載天平（2）研缽（3）容量瓶100mL2個（4）具塞刻度試管25Ml15支（5）試管8支（6）吸管1mL3支，2mL12支，5mL1支（7）離心機（8）離心管（9）恒溫水

7、浴鍋（10）分光光度計2.試劑（1）1%淀粉溶液（2）0.4mol/L氫氧化鈉（3）pH5.6檸檬酸緩沖液稱取檸檬酸20.01g，溶解后定容至1000mL，為A液。稱取檸檬酸鈉29.41g，溶解后定容至1000mL，為B液。取A液13.7mL與B液26.3mL混勻，即為pH5.6之緩沖液。（4）3,5-二硝基水楊酸精確稱取1g3,5-二硝基水楊酸溶于20mL1mol/L氫氧化鈉中，加入50mL蒸餾水，再加入30g酒石酸鉀鈉，待溶解后用蒸餾水稀釋至100Ml，蓋緊瓶塞，防止CO2進入。（5）麥芽糖標準液（1mg/ml）稱取0.100g麥芽糖，溶于少量蒸餾水，定容至100mL。3.材料萌發(fā)3天的小

8、麥芽。四、操作步驟1.酶液提取稱取2g萌發(fā)3天的小麥種子（芽長1cm左右），置研缽中加少量石英砂和2m1左右蒸餾水，研成勻漿，無損地轉(zhuǎn)入100m1容量瓶中，用蒸餾水定容至100m1，每隔數(shù)分鐘振蕩1次，提取20min。3000rmin離心l0min，轉(zhuǎn)出上清液備用。2.a-淀粉酶活力測定（1）取試管4支，標明2支為對照管，2支為測定管。（2）于每管中各加酶液lml，在70士0.5恒溫水浴中準確加熱15min，鈍化-淀粉酶。取出后迅速用流水冷卻。（3）在對照管中加入4m10.4mol/L氫氧化鈉。（4）在4支試管中各加入1mlpH5.6的檸檬酸緩沖液。（5）將4支試管置另一個40士0.5恒溫水浴

9、中保溫15min，再向各管分別加入40下預(yù)熱的1淀粉溶液2m1，搖勻，立即放入40恒溫水浴準確計時保溫5min。取出后向測定管迅速加入4ml0.4mol/L氫氧化鈉，終止酶活動，準備測糖。3.淀粉酶總活力測定取酶液5ml，用蒸餾水稀釋至100m1，為稀釋酶液。另取4支試管編號，2支為對照，2支為測定管。然后加入稀釋之酶液lml。在對照管中加入4m10.4mol氫氧化鈉。4支試管中各加1mlpH5.6之檸檬酸緩沖液。以下步驟重復(fù)-淀粉酶測定第（5）步的操作，同樣準備測糖。4.麥芽糖的測定（1）標準曲線的制作取25ml刻度試管7支，編號。分別加入麥芽糖標準液（lmg/ml）0,0.2,0.6,1.

10、0,1.4,1.8,2.0ml，然后用吸管向各管加蒸餾水使溶液達2.0ml，再各加3，5一二硝基水楊酸試劑2.0m1，置沸水浴中加熱5min。取出冷卻，用蒸餾水稀釋至25m1?；靹蚝笥梅止夤舛扔嬙?20nm波長下進行比色，記錄吸光度。以吸光度為縱坐標，以麥芽糖含量（mg）為橫坐標，繪制標準曲線。（2）樣品的測定取步驟2,3中酶作用后的各管溶液2m1,分別放入相應(yīng)的8支25ml具塞刻度試管中，各加入2m13,5-二硝基水楊酸試劑。以下操作同標準曲線制作。根據(jù)樣品比色吸光度，從標準曲線查出麥芽糖含量，最后進行結(jié)果計算。（AA0）xVT五、結(jié)果處理式中A為a-淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖（mg）；Ao

11、為a-淀粉酶的對照管中麥芽糖量（mg）；B為（a十）淀粉酶共同水解淀粉生成的麥芽糖（mg）；Bo為（a十）淀粉酶的對照管中麥芽糖（mg）；VT為樣品稀釋總體積（ml）；VU為比色時所用樣品液體積（ml）；W為樣品重（g）。六、注意事項（1）酶反應(yīng)時間應(yīng)準確計算。（2）試劑加入按規(guī)定順序進行。七、思考題1.淀粉酶活性測定原理是什么？2.酶反應(yīng)中為什么加pH5.6的檸檬酸緩沖液？為什么在40進行保溫？3.測定酶活力，應(yīng)注意什么問題？一、目的淀粉是葡萄糖以-1,4糖苷鍵及-1，6糖苷鍵連結(jié)的高分子多糖，是人類和動物的重要食物，也是食品、發(fā)酵、釀造、醫(yī)藥、紡織工業(yè)的基本原料。淀粉酶是加水分解淀粉的酶的

12、總稱，淀粉酶對淀粉的分解作用是工業(yè)上利用淀粉的依據(jù)，也是生物體利用淀粉進行代謝的初級反應(yīng)。小麥成熟期如遇陰雨天氣，有的品種會發(fā)生嚴重的穗發(fā)芽，造成巨大損失，這是小麥種子中淀粉酶活動的結(jié)果。因此，淀粉酶的活性測定，具有理論和應(yīng)用研究的意義。通過本實驗，學(xué)習(xí)酶活測定的一般方法，鞏固并熟練分光光度計的使用。二、原理淀粉酶主要包括-淀粉酶、-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和R-酶，它們廣泛存在于動物、植物和微生物界。不同來源的淀粉酶，性質(zhì)有所不同。植物中最重要的淀粉酶是-淀粉酶和-淀粉酶。-淀粉酶隨機作用于直鏈淀粉和支鏈淀粉的直鏈部分-1,4糖苷鍵，單獨使用時最終生成寡聚葡萄糖、-極限糊精和少量葡萄糖。Ca2+

13、能使-淀粉酶活化和穩(wěn)定，它比較耐熱但不耐酸，pH3.6以下可使其鈍化。-淀粉酶從非還原端作用于-1,4糖苷鍵，遇到支鏈淀粉的-1,6鍵時停止。單獨作用時產(chǎn)物為麥芽糖和-極限糊精。-淀粉酶是一種巰基酶，不需要Ca2+及Cl等輔助因子，最適pH偏酸，與-淀粉酶相反，它不耐熱但覺耐酸，70保溫15min可使其鈍化。通常提取液中-淀粉酶和-淀粉酶同時存在?？梢韵葴y定（+）淀粉酶總活力，然后在70加熱15min，鈍化-淀粉酶，測出-淀粉酶活力，用總活力減去-淀粉酶活力，就可求出-淀粉酶活力。淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的還原糖與3,5-二硝基水楊酸的顯色反應(yīng)來測定。還原糖作用于黃色的3,5-二硝基

14、水楊酸生成棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸，生成物顏色的深淺與還原糖的量成正比。以每克樣品在一定時間內(nèi)生成的還原糖（麥芽糖）量表示酶活大小。三、儀器、試劑和材料1.儀器（1）電子頂載天平（2）研缽（3）容量瓶100mL2個（4）具塞刻度試管25Ml15支（5）試管8支（6）吸管1mL3支，2mL12支，5mL1支（7）離心機（8）離心管（9）恒溫水浴鍋（10）分光光度計2.試劑（1）1%淀粉溶液（2）0.4mol/L氫氧化鈉（3）pH5.6檸檬酸緩沖液稱取檸檬酸20.01g，溶解后定容至1000mL，為A液。稱取檸檬酸鈉29.41g，溶解后定容至1000mL，為B液。取A液13.7mL與B液2

15、6.3mL混勻，即為pH5.6之緩沖液。（4）3,5-二硝基水楊酸精確稱取1g3,5-二硝基水楊酸溶于20mL1mol/L氫氧化鈉中，加入50mL蒸餾水，再加入30g酒石酸鉀鈉，待溶解后用蒸餾水稀釋至100Ml，蓋緊瓶塞，防止CO2進入。（5）麥芽糖標準液（1mg/ml）稱取0.100g麥芽糖，溶于少量蒸餾水，定容至100mL。3.材料萌發(fā)3天的小麥芽。四、操作步驟1.酶液提取稱取2g萌發(fā)3天的小麥種子（芽長1cm左右），置研缽中加少量石英砂和2m1左右蒸餾水，研成勻漿，無損地轉(zhuǎn)入100m1容量瓶中，用蒸餾水定容至100m1，每隔數(shù)分鐘振蕩1次，提取20min。3000rmin離心l0min，

16、轉(zhuǎn)出上清液備用。2.a-淀粉酶活力測定（1）取試管4支，標明2支為對照管，2支為測定管。（2）于每管中各加酶液lml，在70士0.5恒溫水浴中準確加熱15min，鈍化-淀粉酶。取出后迅速用流水冷卻。（3）在對照管中加入4m10.4mol/L氫氧化鈉。（4）在4支試管中各加入1mlpH5.6的檸檬酸緩沖液。（5）將4支試管置另一個40士0.5恒溫水浴中保溫15min，再向各管分別加入40下預(yù)熱的1淀粉溶液2m1，搖勻，立即放入40恒溫水浴準確計時保溫5min。取出后向測定管迅速加入4ml0.4mol/L氫氧化鈉，終止酶活動，準備測糖。3.淀粉酶總活力測定取酶液5ml，用蒸餾水稀釋至100m1，為

17、稀釋酶液。另取4支試管編號，2支為對照，2支為測定管。然后加入稀釋之酶液lml。在對照管中加入4m10.4mol氫氧化鈉。4支試管中各加1mlpH5.6之檸檬酸緩沖液。以下步驟重復(fù)-淀粉酶測定第（5）步的操作，同樣準備測糖。4.麥芽糖的測定（1）標準曲線的制作取25ml刻度試管7支，編號。分別加入麥芽糖標準液（lmg/ml）0,0.2,0.6,1.0,1.4,1.8,2.0ml，然后用吸管向各管加蒸餾水使溶液達2.0ml，再各加3，5一二硝基水楊酸試劑2.0m1，置沸水浴中加熱5min。取出冷卻，用蒸餾水稀釋至25m1?；靹蚝笥梅止夤舛扔嬙?20nm波長下進行比色，記錄吸光度。以吸光度為縱坐標，以麥芽糖含量（mg）為橫坐標，繪制標準曲線。（2）樣品的測定取步驟2,3中酶作用后的各管溶液2m1,分別放入相應(yīng)的8支25ml具塞刻度試管中，各加入2m13,5-二硝基水楊酸試劑。以下操作同標準曲線制作。根據(jù)樣品比色吸光度，從標準曲