綿羊卵巢組織石蠟切片

1、綿羊卵巢組織石蠟切片制作條件優(yōu)化研究姜曉龍陳建偉姚曉磊趙妙妙呂麗華 (山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院山西太谷030801 ) 【摘要為觀察綿羊正常卵巢組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，采用蘇術(shù)精一伊紅(hcmatoxylirrcosin, HE)染色法制作綿羊卵巢組織石蠟切片。結(jié)果顯示，在切片制作過(guò)程中存在的問(wèn)題主要包括染色不均、染色對(duì)比不明顯、過(guò)度染色、染色過(guò)淺和切片出現(xiàn)斑點(diǎn)等。在試驗(yàn)過(guò)程中可通過(guò)充分分化、藍(lán)化、充分水洗等因素的控制來(lái)提高切片的染色效果，該方法可為動(dòng)物卵巢及卵泡染色切片制作提供技術(shù)指導(dǎo)。 關(guān)鍵詞:綿羊;HF染色;卵巢;切片;優(yōu)化 HF染色法是石蠟切片技術(shù)中常用的染色法。蘇術(shù)精堿性染液可使細(xì)胞核內(nèi)染色

2、質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)核糖體著藍(lán)紫色;伊紅酸性染料可使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著紅色，作為組織學(xué)、月王胎學(xué)、病理學(xué)教學(xué)與科研中最基木的技術(shù)方法而被一泛使用川。 木試驗(yàn)通過(guò)HF染色技術(shù)制作石蠟切片，該方法是一種多步驟、多因素決定的過(guò)程，在試驗(yàn)中由于操作不當(dāng)，經(jīng)驗(yàn)不足，以及實(shí)踐的使用和時(shí)間的掌握等諸多因素影響，出現(xiàn)切片脫落、染色不均勻、糊不清、褶皺，及細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)對(duì)比不明顯等現(xiàn)象，從而影響使用效果。HF染色切片制作過(guò)程中出現(xiàn)的問(wèn)題進(jìn)行了探究，并提出解決方案，這對(duì)相關(guān)的試驗(yàn)操作具有指導(dǎo)意義。1材料與方法1. 1試驗(yàn)材料 木試驗(yàn)選用山西省清徐縣屠宰場(chǎng)成年健康母羊，屠宰后取卵巢。1.2主要試劑和儀器 Youin

3、氏固定液、包埋紙盒、染色缸、融蠟箱、切片機(jī)、恒溫箱、載玻片、小燒杯、吸水紙、移液槍、蓋玻片、石蠟，1%鹽酸水溶液、0.500伊紅(水溶性)溶液、各梯度的乙醇、二甲苯、蘇術(shù)精染液、伊紅染液、中性樹膠、蒸餾水。1. 3試驗(yàn)方法1. 3. 1綿羊卵巢的處理:將卵巢投入預(yù)先配好的固定液中(1000福爾馬林，Youin氏固定液等)，使組織蛋白質(zhì)變性并防I I幾細(xì)胞死亡后自溶或細(xì)菌分解。1.3.2脫水透明:用低濃度到高濃度酒精作脫水劑，逐漸脫去組織中的水分，再將組織塊置于二甲苯中透明，以二甲苯替換出組織塊中的酒精，才能浸蠟包埋。1. 3. 3浸蠟包埋:將透明處理的組織塊置于熔化的石蠟中，放入熔蠟箱保溫。待

4、石蠟完全浸入組織塊后進(jìn)行包埋。1. 3.通切片與貼片:將包埋好的蠟塊固定于切片機(jī)上，切成厚度為-8 pm薄片。切卜的薄片往往皺折，要放到加熱的水中燙平，再貼到載玻片上，放朽。C恒溫箱中烘干川。1. 3.脫蠟染色:染色前，用二甲苯門)脫蠟5min，入二甲苯Ul中脫蠟 10min，用吸水紙吸干液體;入100%乙醇U)smin，入100%乙醇門1) 5min，用吸水紙吸干液體;入9500乙醇3 min并過(guò)流水2 min，用吸水紙吸干水分。蘇術(shù)精染色 -8 min，并用1%鹽酸水溶液分化5-10s，自來(lái)水洗返藍(lán)15-30 min;0. 500伊紅(水溶性)染色30 s,95%乙醇門脫水5 min，用吸

5、水紙吸干液體;95%乙醇門1)脫水5 mln，用吸水紙吸干液體;入100%乙醇門6 min,100%乙醇ll 2 min,用吸水紙吸干液體入二甲苯<1)中透明2-3 min，二甲苯Cll)中透明5 min。用移液槍吸取適量中性樹膠于載玻片上，蓋上蓋玻片待凝固后觀察結(jié)果。2結(jié)果與分析2. 1正常染色 經(jīng)顯微鏡觀察，正常HF染色切片見圖1-A,l-B。圖1-A可見卵巢上有腔卵泡的存在，圖1-B可見卵巢卵泡顆粒細(xì)胞(GCS、內(nèi)膜細(xì)胞CTC)的細(xì)胞核呈藍(lán)紫色;而周圍的細(xì)胞質(zhì)、纖維被染成粉紅色，切片染色均勻無(wú)褶皺，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)對(duì)比明顯。2.2染色異常 在切片制作尤其是染色過(guò)程中常會(huì)出現(xiàn)染色異常情

6、況，從而影響了正常的組織形態(tài)觀察。圖1-C顯示細(xì)胞核染色蒼白、暗淡，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)染色對(duì)比度差。出現(xiàn)這類問(wèn)題有三種原因:切片在蘇術(shù)精染液停留時(shí)間太短;蘇術(shù)精染液過(guò)度氧化，失去染色能力;分化步驟處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)?？蛇M(jìn)行切片重新染色。如果組織在酸性固定液Zcnkcr,Bouin及非中性緩沖甲醛液固定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞核染色能力將減弱，須增加其在蘇術(shù)精染色液的時(shí)間，或用一些方法增加組織的嗜堿性，以改善細(xì)胞核的著色。 圖1 - I顯示細(xì)胞核過(guò)染，核膜、核仁等不清晰，細(xì)胞質(zhì)含有大量的蘇術(shù)精，導(dǎo)致細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)比例失調(diào)。這主要是由于在染色過(guò)程中切片在蘇術(shù)精染液停留過(guò)長(zhǎng)、切片太厚、分化步驟時(shí)間太短，造成蘇術(shù)精染液大

7、量分布而占據(jù)細(xì)胞質(zhì)位置。通過(guò)顯微鏡上卜微調(diào)觀察，如果只有1 - 2層細(xì)胞核層次，說(shuō)明不是因?yàn)榍衅瘢山?jīng)脫色、漂白、重新染色，對(duì)染色和分化時(shí)間做些適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。若是由于切片太厚導(dǎo)致的細(xì)胞核過(guò)染，則需要重新切片。 圖1-F顯示細(xì)胞核呈紅、棕色改變。這主要由于蘇術(shù)精染色液過(guò)度氧化和切片在蘇術(shù)精染液染色后返藍(lán)不足。提示染色之前檢查蘇術(shù)精染色液的染色能力，發(fā)現(xiàn)氧化過(guò)度應(yīng)及時(shí)更換;同時(shí)，可用流水、溫水或弱堿性溶液如稀氨水、0.200碳酸氫鈉溶液等在蘇術(shù)精染色后，給切片足夠的藍(lán)化時(shí)間。 圖1-F顯示伊紅著色淡，切片中央?yún)^(qū)域伊紅染色不均勻，可能為弱堿性溶液殘留導(dǎo)致伊紅拒染;也可能是藍(lán)化液殘留過(guò)多、切片太薄，

8、或切片經(jīng)伊紅染色后在乙醇脫水時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。因此，在染色前應(yīng)檢查伊紅染液的pH值，必要時(shí)可用乙酸將pH調(diào)節(jié)在. 6-5. 0之間。在脫水時(shí)切片在低濃度乙醇停留時(shí)間不可過(guò)長(zhǎng)，低濃度乙醇會(huì)將伊紅的顏色分。化掉 圖1-G顯示細(xì)胞質(zhì)過(guò)染，分色不足，這是由于伊紅深染導(dǎo)致細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)沒有層次，缺乏對(duì)比。提示在染色前適當(dāng)稀釋伊紅染液，減少伊紅染色時(shí)間;切片在乙醇脫水步驟時(shí)，停留時(shí)間要相對(duì)均勻。 圖1-H顯示切片中出現(xiàn)藍(lán)黑色沉淀物，這主要是試驗(yàn)中使用的蘇術(shù)精染液沒有過(guò)濾處理，導(dǎo)致蘇術(shù)精染液中的金屬膜熟附在玻片上。建議使用半氧化蘇術(shù)精染色液，如Gill蘇術(shù)精染液，可以避免金屬膜的產(chǎn)生。 圖1-1可見切片內(nèi)有大量水珠

9、或云霧狀改變，這是梯度乙醇處理后沒有完全脫水造成的，因此，所有用于脫水和透明的液體，在使用一定時(shí)間后應(yīng)及時(shí)更換。 圖1-J顯示由于組織切片脫蠟不徹底或分化液濃度過(guò)大、分化后沒有迅速入水終i1=分化，導(dǎo)致切片染色不均，出現(xiàn)“陰陽(yáng)臉”，出現(xiàn)這種情況需要重新取材制作切片圖1-K顯示鏡檢時(shí)切片中出現(xiàn)大片白色斑點(diǎn)，這是由于脫蠟不徹底，染色液因石蠟斑點(diǎn)的殘留不能滲透組織著色。因此，脫蠟時(shí)切片在二甲苯中停留時(shí)間相對(duì)延長(zhǎng)或更換二甲苯，脫色、漂白、重新染色。3討論在研究雌性動(dòng)物繁殖性能中，卵巢組織切片是較常用的用于了解動(dòng)物卵巢結(jié)構(gòu)與其年齡特征、生理功能、細(xì)胞凋亡、蛋白表達(dá)相關(guān)的常規(guī)技術(shù)。常青等(2001)為觀察

10、早期老年大鼠使用外源雌激素后卵巢結(jié)構(gòu)及功能的變化，通過(guò)建立早期老年大鼠模型，采用放射免疫法測(cè)定使用外源雌激素后外周(fi.液中促卵泡素(FSH)、促黃體素(LH),雌二醇(E)及辜酮(丁)水平，并通過(guò)卵巢組織切片觀察卵巢結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，早期老年大鼠應(yīng)用雌激素后外周血FSH明顯降低，F(xiàn)水平明顯上升，丁水平明顯降低;同時(shí)卵巢門細(xì)胞減少，卵巢基質(zhì)相對(duì)增生。土朝清等(2006)為探索家兔卵巢典型結(jié)構(gòu)與其年齡的關(guān)系，選取不同年齡段的家兔卵巢，常規(guī)石蠟切片，HE, Vnaicson和PAS染色，鏡檢并計(jì)數(shù)各級(jí)卵泡。結(jié)果表明，2月齡的家兔卵泡開始發(fā)育，隨年齡的增長(zhǎng)發(fā)育程度逐漸增強(qiáng)。 - 5月齡卵巢的皮

11、質(zhì)、髓質(zhì)分界清楚，未見黃體、閉鎖卵泡及間質(zhì)腺，發(fā)育中卵泡由周圍向中央排列，與人的卵巢結(jié)構(gòu)較為相似。7-8月齡卵巢結(jié)構(gòu)呈性成熟狀態(tài)，卵巢髓質(zhì)隨著家兔月齡增長(zhǎng)間質(zhì)腺逐漸增多川習(xí)。陳華絮等(2007)針對(duì)常規(guī)石蠟切片制作步驟瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，試驗(yàn)中所用二甲苯對(duì)人體有較大危害的缺點(diǎn)，探討提高兔卵巢組織石蠟切片質(zhì)量的制作方法，研究從脫水和透明環(huán)節(jié)進(jìn)行技術(shù)優(yōu)化，用正J醇與無(wú)水乙醇混合溶液取代常規(guī)的脫水劑和透明劑。該混合液具有較好的脫水和透明作用。鏡檢結(jié)果表明，卵巢組織結(jié)構(gòu)清晰可辨、對(duì)比度好、層次分明，組織切片鏡檢效果良好，具有工序簡(jiǎn)單、質(zhì)優(yōu)、省時(shí)和實(shí)用性較好等優(yōu)點(diǎn)2習(xí)。楊軒(2009)對(duì)家兔卵巢石蠟切片HF染色

12、過(guò)程中影響因素進(jìn)行了研究，在試驗(yàn)過(guò)程中通過(guò)改變條件進(jìn)行比較試驗(yàn)，重點(diǎn)分析了染色過(guò)程中溫度、時(shí)間、切片厚度等因素對(duì)鏡檢效果的影響。 木研究通過(guò)對(duì)綿羊卵巢組織切片的制作，并通過(guò)鏡檢效果重點(diǎn)對(duì)影響HF染色的因素如切片厚度、染液pH值、染色時(shí)間、分化、藍(lán)化等進(jìn)行分析探討，對(duì)試驗(yàn)中影響鏡檢效果的相關(guān)因素進(jìn)行了解決并加以優(yōu)化，這對(duì)相關(guān)動(dòng)物卵巢常規(guī)切片的制作具有一定的指導(dǎo)意義。 參考文獻(xiàn)C1劉ill_新.實(shí)用生物組織學(xué)技術(shù)M.北京科學(xué)出版剎_,2004,03.口汪謙.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)力法M.北京人民衛(wèi)生出版剎_,1998,06.3劉桂芝.石蠟切片標(biāo)本的制作過(guò)程CJ.通化師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2004, 26C11):9

13、0 -103.以王滿貫.HE染色切片的技術(shù)操作規(guī)范J.大同醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校學(xué) 報(bào)，2004，C2):2L一25.5J朱有華.淺談石蠟切片HE染色J.診斷病理學(xué)雜志，1997,4 C2:111一LL2.6王風(fēng)琴，孔佑華.淺談HE染色切片著色淺的原因以及改進(jìn)力法 U.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006,29(1):11.叮李成，賈維民，張希國(guó).石蠟切HE染色著色小良的原因及矯正力 法J.內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006,28(12):223一224.鄺田玉旺，李琳，朱I:艷.常規(guī)HE染色易出現(xiàn)的問(wèn)題、原因及解決 力法J.診斷病理學(xué)雜志，2008,1(6):00-X02.9曹書芬，國(guó)宏莉，張麗，等.石蠟切片HE染色力法的改進(jìn)J.鄖 陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007,26(5)308.C10常青，徐惠成，史常.雌激素對(duì)