臨床專(zhuān)用生化分析儀分析技術(shù)

1、第七章 臨床專(zhuān)用生化分析儀分析技術(shù)教學(xué)要求和目標(biāo)v掌握 各分析技術(shù)的基本原理和分析方法v熟悉 各分析技術(shù)儀的結(jié)構(gòu)組成特點(diǎn)，儀器的維護(hù)保養(yǎng)，質(zhì)量控制和臨床應(yīng)用v了解 各分析技術(shù)儀的分類(lèi)第一節(jié) 濁度自動(dòng)化分析技術(shù)一、濁度分析的基本原理v在一定條件下，可溶性抗原與抗體在液相中特異結(jié)合，形成有一定大小的抗原顆粒，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度v當(dāng)光線(xiàn)通過(guò)介質(zhì)中的復(fù)合物顆粒時(shí)吸收、透射、散射和折射v通過(guò)測(cè)量透射光或散射光信號(hào)強(qiáng)弱被測(cè)物的量。v濁度分析方法的分類(lèi)v檢測(cè)器的位置及接收光信號(hào)的性質(zhì)分v透射免疫濁度法（turbidimetry immunoassayv散射免疫濁度法（nephelometry immunoas

2、sayv測(cè)定方式分：v終點(diǎn)濁度法與速率濁度法v濁度形成原理分：v沉淀反應(yīng)濁度法與膠乳凝集比濁（粒子增強(qiáng)免疫濁度法）v終點(diǎn)散射濁度法v檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)與起始點(diǎn)之間信號(hào)變化的方法v速率散射濁度法v速率是指在單位時(shí)間內(nèi)抗原抗體結(jié)合反應(yīng)形成復(fù)合物的量。是在抗原與抗體反應(yīng)的最高峰測(cè)定其復(fù)合物形成的量，該峰值的高低與抗原的量成正比。v粒子增強(qiáng)免疫濁度法v選擇大小適中、均勻一致的膠乳顆粒吸附或交聯(lián)抗體；當(dāng)遇到相應(yīng)抗原時(shí)，則發(fā)生聚集。單個(gè)膠乳顆粒在入射光波長(zhǎng)之內(nèi)，光線(xiàn)可透過(guò)。當(dāng)兩個(gè)或更多膠乳顆粒凝聚時(shí)，透過(guò)光減少，光減少的程度與膠乳凝集量成正比。v靈敏感度較高。二、濁度分析儀的分類(lèi)和基本結(jié)構(gòu)v自動(dòng)生化分析儀v散射

3、濁度分析儀v應(yīng)用較為普遍的有固定時(shí)間散射分析儀、速率散射分析儀和雙光路自動(dòng)免疫濁度分析儀自動(dòng)散射濁度分析儀的組成v分析系統(tǒng)：用于加樣、稀釋、保溫和測(cè)試等。 包括散射測(cè)濁儀、加液系統(tǒng)、試劑轉(zhuǎn)盤(pán)、樣品轉(zhuǎn)盤(pán)、卡片閱讀器等v計(jì)算機(jī)系統(tǒng)：用于輸入病人數(shù)據(jù)、選擇程序菜單、計(jì)算參考曲線(xiàn)和儲(chǔ)存測(cè)試結(jié)果散射濁度分析儀光路示意圖三、濁度分析儀的保養(yǎng)v常規(guī)保養(yǎng)v日保養(yǎng)v關(guān)機(jī)前沖洗管道，以防止管道阻塞v開(kāi)機(jī)前應(yīng)檢查注射器，防止漏液v檢查D、B、A、W液面高度v光路校正v周保養(yǎng)v更換流動(dòng)比色杯和小磁棒v清潔探針的外部v檢查蠕動(dòng)泵和鉗制閥控制著管路中液體的流動(dòng)情況v月保養(yǎng)v更換注射器插桿頂端v空氣過(guò)濾網(wǎng)沖洗v疏通標(biāo)本和抗

4、體探針的內(nèi)部v半年保養(yǎng)v更換管道v機(jī)械潤(rùn)滑四、濁度分析的質(zhì)量控制（一）抗原過(guò)剩校正 檢測(cè)方法：v連續(xù)監(jiān)測(cè)抗原抗體反應(yīng)曲線(xiàn)，呈現(xiàn)異常v追加抗體，濁度繼續(xù)增大v標(biāo)本兩種稀釋度測(cè)定，濃度高的濁度反而低（二）減少偽濁度 偽濁度： 除待測(cè)抗原抗體復(fù)合物產(chǎn)生的濁度外，其它可引起透射光或散射光變化的濁度都稱(chēng)為偽濁度 減少偽濁度的方法：采用新鮮、合格標(biāo)本保持比色杯和稀釋杯清潔使用合格的抗體試劑嚴(yán)格控制增濁劑的濃度（三）選擇合適的入射光波長(zhǎng) 入射光波長(zhǎng)的選擇原則： 除了抗原抗體免疫復(fù)合物外，反應(yīng)體系中的其他成分對(duì)入射光的干擾應(yīng)為最小，因?yàn)槠渌煞治樟瞬糠秩肷涔?，透射比濁法測(cè)定結(jié)果將使抗原濃度偏高，而散射比濁法

5、測(cè)定將使抗原濃度偏低。（四）儀器校正 選擇合適的校準(zhǔn)品 校準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 校準(zhǔn)曲線(xiàn)的形狀取決于抗血清和促聚劑的濃度的選擇，也與免疫濁度法類(lèi)型、校正方法及校準(zhǔn)品的質(zhì)量有關(guān)。 多推薦5點(diǎn)或6點(diǎn)定標(biāo)。 適當(dāng)?shù)臄?shù)學(xué)方法進(jìn)行曲線(xiàn)擬合五、特定蛋白濁度分析的臨床應(yīng)用特定蛋白臨床常規(guī)項(xiàng)目免疫功能監(jiān)測(cè)免疫球蛋白：IgG、IgM、IgA、 C3、C4臨床意義：IgG、IgA、IgM檢測(cè)有助于了解機(jī)體抗感染能力，有助于疾病的正確診斷和有效治療。在免疫復(fù)合物疾病中，C3、 C4檢測(cè)可以了解其消耗程度。適應(yīng)癥：免疫力低，反復(fù)感染病人； 自身免疫性疾??；多發(fā)性骨髓瘤；慢性肝?。环呛谓芙鹗狭馨土?；白血病；良性單克隆免疫球蛋白

6、?。幌忍煨曰颢@得性低免疫球蛋白血癥；對(duì)白、球蛋白比例異常者的隨訪(fǎng)術(shù)后感染、移植排斥反應(yīng)第二節(jié) 電解質(zhì)自動(dòng)化分析技術(shù)一、電解質(zhì)分析的原理和方法離子選擇性電極（ion selective electrodeelectrode，ISE）是一類(lèi)用特殊敏感膜制成，對(duì)溶液中某種特定離子具有選擇性響應(yīng)的電化學(xué)傳感器。常用于測(cè)量離子的活度或濃度。ISE基 本結(jié)構(gòu)通常由電極管、內(nèi)電極、電極內(nèi)充溶液和電極膜（或稱(chēng)敏感膜）四個(gè)部分組成。電極電位產(chǎn)生基于膜材料與溶液界面發(fā)生的離子交換反應(yīng)當(dāng)電極置于溶液中時(shí)，由于離子交換和擴(kuò)散作用，改變了二相中原有的電荷分布，因而形成雙電層，其間產(chǎn)生一定的電位差即膜電位ISE的電位與溶

7、液中特定離子活度的對(duì)數(shù)呈線(xiàn)性關(guān)系，即符合Nernst方程3. 電極電位測(cè)量ISE的E ISE 值不能直接測(cè)定必須將ISE與參比電極共同浸入待測(cè)樣品中組成一個(gè)原電池，通過(guò)測(cè)量E電池 來(lái)測(cè)定E ISE 值。在一定條件下，原電池的電動(dòng)勢(shì)與被測(cè)離子活度的對(duì)數(shù)呈線(xiàn)性關(guān)系。（二） ISE 電位分析方法標(biāo)準(zhǔn)比較法（或直讀法）：指在pH計(jì)或離子計(jì)上直接讀出數(shù)值的方法，適用于少量樣本的分析標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法：適用于大批量的試樣分析標(biāo)準(zhǔn)加入法：當(dāng)待測(cè)溶液組分較復(fù)雜，很難控制相同的離子強(qiáng)度時(shí)，選用標(biāo)準(zhǔn)加入法（二） ISE 樣本測(cè)定方式直接法：指樣本不經(jīng)稀釋直接測(cè)量離子活度。全血測(cè)定，迅速方便、結(jié)果準(zhǔn)確，不會(huì)因血清中水體積所

8、占比例改變而影響結(jié)果間接法：樣本經(jīng)緩沖液稀釋后由電極測(cè)量離子活度。樣品用量少，不易堵塞管道，電極壽命長(zhǎng)直接法比間接法測(cè)定結(jié)果高35 ，因?yàn)檠暗鞍踪|(zhì)等不包含有K 、Na 二、電解質(zhì)分析儀分類(lèi)和結(jié)構(gòu)（一）電解質(zhì)分析儀的分類(lèi) 半自動(dòng)和全自動(dòng)電解質(zhì)分析儀 濕式和干式電解質(zhì)分析儀 電解質(zhì)分析儀、含電解質(zhì)分析的血?dú)夥治鰞x、含電解質(zhì)分析的自動(dòng)生化分析儀離子選擇性電極組： 包括指示電極和參比電極通常采用流動(dòng)式毛細(xì)管結(jié)構(gòu)，即在毛細(xì)管的側(cè)臂開(kāi)多個(gè)小孔，孔里插入各種離子選擇性電極負(fù)壓吸樣多參數(shù)同時(shí)測(cè)量鈉、鉀、氯電極鈉電極：鉛硅酸鈉的玻璃膜電極鉀電極：纈氨霉素和聚氯乙烯（PVC）膜電極氯電極：銀氯化銀電極液路系統(tǒng)

9、常由標(biāo)本盤(pán)、溶液瓶、驅(qū)動(dòng)電機(jī)、采樣針、電極系統(tǒng)、蠕動(dòng)泵、三通閥、管道等組成。用于將樣品、定標(biāo)液和稀釋液等吸取和輸送至電極管道中，并完成電極、管道沖洗與廢液排除電路系統(tǒng)微處理器、信號(hào)放大及數(shù)據(jù)采集、蠕動(dòng)泵和三通閥控制、輸入輸出、電源電路等五大模塊組成。共同完成對(duì)儀器各部件的動(dòng)作控制，對(duì)電極mV值進(jìn)行處理和計(jì)算，并顯示或打印輸出結(jié)果。程序控制系統(tǒng)包括儀器微處理系統(tǒng)、儀器設(shè)定與測(cè)定和自動(dòng)清洗程序等。顯示操作系統(tǒng)鍵盤(pán)、液晶顯示、觸摸屏等三、電解質(zhì)分析儀的維護(hù)和保養(yǎng)每日維護(hù)檢查試劑量，清潔儀器表面及吸樣探針，棄去瓶中的廢液每周維護(hù)清洗液路，除去蛋白質(zhì)、脂類(lèi)沉積和鹽類(lèi)結(jié)晶。每月維護(hù)用酒精棉球清潔泵管和不銹

10、鋼轉(zhuǎn)軸，在泵管的彎處涂硅油或白色凡士林等潤(rùn)滑劑。每季度進(jìn)行MV值試驗(yàn)檢查電極的MV值是否符合說(shuō)明書(shū)要求。電極系統(tǒng)的保養(yǎng)定期更換電極膜和電極內(nèi)充液定期進(jìn)行去蛋白清洗及電極的活化液路系統(tǒng)的保養(yǎng)保證液路無(wú)蛋白質(zhì)、脂類(lèi)沉積和鹽類(lèi)結(jié)晶每天關(guān)機(jī)前均進(jìn)行管路的清洗沖洗完畢重新定標(biāo)v儀器的保養(yǎng)四、電解質(zhì)分析的質(zhì)量控制分析前質(zhì)量控制樣本的采集與處理采血器具干燥、清潔減少輸液對(duì)結(jié)果的影響。采血中應(yīng)避免溶血。盡快送檢，勿劇烈振蕩，避日光照射；不能立即測(cè)定應(yīng)分離血清，置于4冰箱中保存。與空氣接觸時(shí)，CO 2 ，pH抗凝劑的影響抗凝劑：不能用EDTA、檸檬酸鹽或草酸鹽等抗凝劑。肝素常不超過(guò)20U/ml血樣。藥物的影響藥

11、物或其代謝產(chǎn)物引起患者體內(nèi)被測(cè)物的濃度發(fā)生改變。如利尿劑促進(jìn)K + 、Na + 、Cl 從尿中排出。藥物直接對(duì)ISE的響應(yīng)產(chǎn)生影響：如水楊酸鹽對(duì)抗凝劑的影響Cl 電極、維生素C對(duì)K + 電極響應(yīng)有干擾等分析中質(zhì)量控制定標(biāo)校正液各廠(chǎng)家的定標(biāo)校正液不能互換使用電極保養(yǎng)使用一段時(shí)間后就需要保養(yǎng)質(zhì)控品選用質(zhì)量好、性能穩(wěn)定和對(duì)離子選擇性電極響應(yīng)沒(méi)有干擾的質(zhì)控血清分析后的質(zhì)量控制異常結(jié)果的分析取舍：如Glu 、HCO 3 、K +過(guò)高：血樣放置過(guò)長(zhǎng)多項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果過(guò)低：樣品稀釋比例不對(duì)、有纖維蛋白凝塊或吸樣針部分堵塞對(duì)某些急診檢驗(yàn)項(xiàng)目特別異常的結(jié)果，應(yīng)及時(shí)與臨床聯(lián)系，以便緊急處置五、電解質(zhì)分析技術(shù)的臨床應(yīng)用

12、低鈉血癥和高鈉血癥 血清鉀增高和血清鉀降低 低氯血癥和高氯血癥電泳自動(dòng)化分析技術(shù)一、影響電泳的因素待分離物質(zhì)的性質(zhì)粒子帶的電荷量越大、直徑越小、形狀越接近球形，則其電泳遷移速度越快。緩沖液的性質(zhì)溶液的pH值影響其帶電性質(zhì)、凈電荷量。緩沖液離子強(qiáng)度一般在0.02 0.20molkg之間。電場(chǎng)強(qiáng)度電壓越高，電場(chǎng)強(qiáng)度越大，遷移率越大，帶電粒子移動(dòng)越快支持介質(zhì)的性質(zhì)包括黏性吸附對(duì)泳動(dòng)的阻礙作用，支持介質(zhì)的分子篩和電滲作用溫度升高時(shí)，介質(zhì)黏度下降，分子運(yùn)動(dòng)加劇，引起自由擴(kuò)散加快、區(qū)帶變寬和分辨率下降二、電泳儀的分類(lèi)和基本結(jié)構(gòu)電泳技術(shù)的分類(lèi) 工作原理的不同分為：移動(dòng)界面電泳、區(qū)帶電泳、穩(wěn)態(tài)電泳或稱(chēng)置換電泳

13、 有無(wú)支持物分為：自由電泳和支持物電泳（區(qū)帶電泳）。 電源控制的不同分為：恒壓電泳、恒流電泳、恒功率電泳。自動(dòng)化程度的不同分為： 手工操作、半自動(dòng)電泳、全自動(dòng)電泳、全自動(dòng)電泳分析系統(tǒng) 其他分類(lèi)方式： 支持載體的裝置形式，區(qū)帶電泳可分成水平平板電泳、垂直板狀電泳、垂直柱狀電泳、U型管電泳、倒V字形電泳、毛細(xì)管電泳等。電泳儀的基本結(jié)構(gòu)手工電泳儀電源、電泳槽、電泳條帶分析裝備(或掃描儀)三部分的結(jié)構(gòu)分離，加樣、電泳、電泳后的染色和脫色等均需手工操作，人工設(shè)置參數(shù)完成電泳。 自動(dòng)電泳分析儀 將電源、電泳槽、烘箱、染色缸等組合在一起，采用計(jì)算機(jī)對(duì)電泳過(guò)程進(jìn)行控制，部分乃至全部操作由電泳儀完成；分為半自動(dòng)

14、或全自動(dòng)電泳儀。三、自動(dòng)電泳儀的使用和保養(yǎng)每天保養(yǎng)重點(diǎn)是電極的維護(hù)，每天電泳后，應(yīng)當(dāng)用干濾紙擦凈電極，避免緩沖鹽沉積于電極上或酸堿對(duì)電極的腐蝕。每月保養(yǎng)重點(diǎn)是掃描系統(tǒng)的比色濾鏡及光源。四、電泳分析的質(zhì)量控制電泳分析前質(zhì)量控制電泳分析方法的選擇 加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室與臨床醫(yī)生的溝通，宣傳實(shí)驗(yàn)室所開(kāi)展的電泳技術(shù)及應(yīng)用；全面了解電泳儀的結(jié)構(gòu)和原理、電泳結(jié)果的意義，合理使用電泳分析方法。v標(biāo)本采集： 宜采 用 新鮮 血清， 避免標(biāo)本溶血。腦脊液 ( CSF) 標(biāo)本新鮮 最 佳； CSF免 疫固定電泳必須對(duì)同一病人同時(shí)采集CSF和血清標(biāo)本。尿液標(biāo)本以新鮮的晨尿?yàn)榧?。v標(biāo)本保存： 不能立即電泳的 血樣， 應(yīng)先分離血

15、清再保存。血清、腦脊液和尿液標(biāo)本，在 2 8 冷藏保存可穩(wěn)定 1 周， - 20 至少可保存 1 個(gè)月， - 40 保存可長(zhǎng)達(dá)5 年。如血清標(biāo)本加入 0.2g L 的疊氮鈉，冷凍保存的穩(wěn)定性更好電泳試劑的保存應(yīng)遵照試劑使用說(shuō)明書(shū)的要求保存大多數(shù)廠(chǎng)家的電泳載體是瓊脂糖凝膠，其保存期至少在半年以上。凝膠片在干燥的室溫條件下保存，具有生物活性的試劑(如抗體、酶等)需嚴(yán)格按要求保存，其他配套保存試劑應(yīng)在有效期內(nèi)使用電泳分析中的質(zhì)量控制標(biāo)本準(zhǔn)備和使用標(biāo)本是否需要稀釋或濃縮，根據(jù)需要而定冷凍后的血清標(biāo)本有時(shí)會(huì)變得黏稠或混濁，在電泳分析前要置室溫平衡冷凍標(biāo)本-脂蛋白可向陰極漂移；越陳舊的血清標(biāo)本漂移越明顯標(biāo)本量的要求盡可能做到嚴(yán)格和精確電泳操作應(yīng)注意加樣、電泳、染色等因素對(duì)電泳結(jié)果的干擾，如樣品是否同時(shí)“點(diǎn)”在凝膠片上，電泳方式的選擇是否正確，染色液是否足夠，掃描膠片是否“對(duì)號(hào)入座”等。質(zhì)控物正確應(yīng)用較成熟的商業(yè)性控物主要用于血清蛋白電泳分析在無(wú)合適商品化質(zhì)控物的情況下，可以考慮用正常人血清電泳分析后的質(zhì)量控制 主要包括對(duì)分析結(jié)果的正確解釋和應(yīng)用、電泳結(jié)果的及時(shí)發(fā)送以及自動(dòng)電泳儀的維護(hù)和保養(yǎng)等。五、電泳分析技術(shù)的臨床應(yīng)用蛋白質(zhì)電泳血清蛋白電泳 許多疾病具有一定特征的血清蛋白電泳圖譜。免疫固定電泳 可對(duì)各類(lèi)Ig及其輕鏈進(jìn)行分型，最常用于臨床常規(guī)M蛋