轉(zhuǎn)座子插入敲除

1、轉(zhuǎn)座子(transposon)是存在于DNA上可自主復(fù)制和移位的基本單位。由Barbara McClintock 在20世紀(jì)40年代首次從玉米中發(fā)現(xiàn)，從此改變了人們對(duì)基因組序列穩(wěn)定性的認(rèn)識(shí)，打破了遺傳物質(zhì)在染色體上呈線性固定排的傳統(tǒng)理論。1983年McClintock因發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子被授予諾貝爾獎(jiǎng)特點(diǎn)： 1、所有生物的染色體都有轉(zhuǎn)座子 2、轉(zhuǎn)座相關(guān)序列可以占據(jù)物種基因的很大一部分，如人和玉米基因組的50%以上是由轉(zhuǎn)座相關(guān)序列組成 3、轉(zhuǎn)座子的含量在不同基因組中變化很大 4、當(dāng)轉(zhuǎn)座子移位時(shí)，轉(zhuǎn)座因子通常對(duì)插入位點(diǎn)幾乎沒有序列選擇性轉(zhuǎn)座子類型： 1、DNA轉(zhuǎn)座子 2、類病毒反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子 3、聚腺苷酸（

2、poly-A）反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座機(jī)制： 1、剪切-粘貼機(jī)制 2、復(fù)制-粘貼機(jī)制插入突變 轉(zhuǎn)座子插入突變是利用轉(zhuǎn)座子在染色體上可移動(dòng)的特點(diǎn)，當(dāng)其跳躍插入到某個(gè)功能基因內(nèi)部或鄰近位點(diǎn)時(shí)時(shí)，就會(huì)引起該基因的失活，并誘導(dǎo)產(chǎn)生突變型。 因此我們可以利用某些能隨機(jī)插入基因序列的轉(zhuǎn)座子，在目標(biāo)細(xì)胞基因組中進(jìn)行隨機(jī)插入突變，建立一個(gè)攜帶隨機(jī)插入突變的細(xì)胞庫，然后通過相應(yīng)的標(biāo)記（如Tn5轉(zhuǎn)座子含kan抗性基因）進(jìn)行篩選獲得相應(yīng)的基因敲除細(xì)胞。 睡美人轉(zhuǎn)座子(sleeping bueaty,轉(zhuǎn)座子SB)已證明在小鼠和人細(xì)胞中可以激活,轉(zhuǎn)座子插入新的位點(diǎn)后，該位點(diǎn)附近的基因即受到抑制呈現(xiàn)隱性的“睡美人”表型。 一旦轉(zhuǎn)

3、座子在轉(zhuǎn)座酶的作用下從這一位點(diǎn)上轉(zhuǎn)走，該位點(diǎn)的基因隱性表型又恢復(fù)為顯性表型，即“睡美人蘇醒”。調(diào)控轉(zhuǎn)座酶和轉(zhuǎn)座子活性的系統(tǒng)稱為青蛙王子(Frog Prince)。 用特異的開放閱讀框捕獲技術(shù)，可以使自然散在的轉(zhuǎn)座酶編碼基因高表達(dá)，人為催化激活轉(zhuǎn)座子使其蘇醒，執(zhí)行插入、切除等任務(wù)。目前已經(jīng)應(yīng)用于微生物、昆蟲、植物、動(dòng)物及人類基因組功能的研究。例如蛙類基因組含有Tcl水手轉(zhuǎn)座子超家族，呈自然失活狀態(tài)，轉(zhuǎn)座酶與轉(zhuǎn)座增強(qiáng)子序列末端結(jié)合,在HMGBI蛋白協(xié)助下，激活轉(zhuǎn)座子，使睡美人轉(zhuǎn)座子蘇醒。使用轉(zhuǎn)座子進(jìn)行插入突變的優(yōu)點(diǎn)有：（1 ）轉(zhuǎn)座子能夠在轉(zhuǎn)座酶的存在下從插入位點(diǎn)剪切下來，造成突變體反轉(zhuǎn)。采用這種方

4、法可進(jìn)一步確證突變體表型是否由轉(zhuǎn)座子插入突變引起。（2）大多數(shù)轉(zhuǎn)座的位點(diǎn)偏好于連鎖位點(diǎn)，所以如果有一個(gè)可轉(zhuǎn)座的元件靠近目的基因，那么可轉(zhuǎn)座的元件即會(huì)高效地移動(dòng)并插入目的基因。因此，即使在突變體庫中沒有發(fā)現(xiàn)期望的插入位點(diǎn)，仍可以采用轉(zhuǎn)座子在連鎖位點(diǎn)上的轉(zhuǎn)座獲得目的基因被插入失活的品系。（3 ）當(dāng)一個(gè)基因家族的多個(gè)成員沿染色體串連排列時(shí)，可采用復(fù)制型的轉(zhuǎn)座系統(tǒng)創(chuàng)建該基因家族全部成員均被敲除的突變體。 隨著基因敲除技術(shù)的發(fā)展，早期技術(shù)中的許多不足和缺陷都已經(jīng)解決，但基因敲除技術(shù)始終存在著一個(gè)難以克服的缺點(diǎn)，即敲掉一個(gè)基因并不一定就能獲知該基因的功能，其原因包括： 一方面，許多基因在功能上是冗余的，敲掉一個(gè)在功能上冗余的基因，并不能造成容易識(shí)別的表型，因?yàn)榛?/p>