PCR技術(shù)及應用PPT課件

1、生物化學與分子生物學進展PCR反應體系PCR過程PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的基本原理1983年P(guān)CR反應條件PCR過程PCR的基本原理5533XX55?() 40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20http:/n三個水浴鍋，用手移動三個水浴鍋，用手移動 （MullisMullis等人當時用的）等人當時用的）n電加熱塊電加熱塊 自來水冷卻自來水冷卻 （PEPE，19881988）n電加熱塊電加熱塊 內(nèi)置循環(huán)液冷卻內(nèi)置循環(huán)液冷卻 （PEPE，19891989）n三個加熱塊三個加熱塊 機械手機械手 （StrategeneStrategene，199

2、41994）n半導體制冷和加熱（半導體制冷和加熱（MJ, PE, BioMetra, EppendorfMJ, PE, BioMetra, Eppendorf）n空氣加熱空氣加熱 (Roche)(Roche)n梯度梯度PCRPCR儀儀, , 實時熒光定量實時熒光定量PCRPCR儀儀nLab-on-chipLab-on-chip式的式的PCRPCR儀儀( (芯片芯片PCR)PCR)全新全新4 4通道實時熒光定量通道實時熒光定量PCRPCR儀儀普通普通PCRPCR儀、梯度儀、梯度PCRPCR儀儀 30次 12341234A：無外顯子8,12,17,19對應條帶,說明病人外顯子819缺失B：病人A中

3、未擴增外顯子帶的強度為C的一半,提示為區(qū)域缺失攜帶者C：正常人DMD基因外顯子的一般擴增形式多重PCR檢測DMD基因缺失 PCRPCR的局限：需了解靶基因片段兩側(cè)的序列的局限：需了解靶基因片段兩側(cè)的序列 對于未知序列怎么辦？對于未知序列怎么辦？錨定錨定PCR首先合成第一鏈首先合成第一鏈cDNA,然后再添加一同聚物尾（然后再添加一同聚物尾（polydG),與同聚物尾配對的與同聚物尾配對的3錨定引物（帶有限制性內(nèi)切位點錨定引物（帶有限制性內(nèi)切位點polydC)一起作一起作PCR擴增擴增可用于基因芯片的制作可用于基因芯片的制作 A.陽性對照陽性對照B.陰性對照陰性對照C.原位檢測原位檢測mRNA表達

4、表達逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈雜化雙鏈PCR擴增 I5353SGExcitationSGSGSGSGEmission 5353SGSGSGSGSGExcitationEmission RQ53535353ExcitationRQ QRQRExcitationTaqman ProbeRQExcitationRQQRExcitationEmission分子信標分子信標（Molecular Beacon Probe）熒光定量熒光定量PCR儀儀 普通普通PCR儀儀分子克隆分子克?。康幕虻墨@取和鑒定目的基因的獲取和鑒定）55 PCR(5端引入限制酶識別位點端引入限制酶識別位點)PBS g

5、roupK5 group* PBS K5 Yang X, et al. Cancer Biology & Therapy, 2006.Gu X, Yang X*, et al. Apoptosis. 2011Li L, Yang X*,et al. J Biol Chem. 2014. Yang X, et al. Journal of Cellular and Molecular Medicine, 2010Li C, Yang X, et al. Cornea. 2013臨床基因診斷臨床基因診斷A內(nèi)源性病變基因正常人A病 人遺傳疾病的基因診斷遺傳疾病的基因診斷基因缺失、插入或置換等

6、地中海貧血珠蛋白鏈合成不平衡A正常人正常人病病 人人正正常常病病人人A病原微生物基因病原微生物基因正常人 (-)病 人 (+)1：Marker2：陽性模板：陽性模板3：待測樣品：待測樣品14：已確診乙肝病人樣品：已確診乙肝病人樣品5: 待測樣品待測樣品26: 待測樣品待測樣品37: 陽性模板陽性模板陰性陰性陰性陰性乙肝病毒基乙肝病毒基因攜帶者因攜帶者藥物治療方案的確定藥物治療方案的確定（用藥：干擾素、拉米夫定、（用藥：干擾素、拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋）阿德福韋、恩替卡韋）藥物治療藥物治療（療效評價）（療效評價）前前C C區(qū)區(qū)18961896位點突變檢測試劑盒位點突變檢測試劑盒跟蹤隨訪跟蹤隨

7、訪乙乙 肝肝 病病 毒毒 定定 量量 檢檢 測測 試試 劑劑 盒盒確確診診病毒學病毒學分析分析乙肝病毒分型檢測試劑盒乙肝病毒分型檢測試劑盒拉米夫定耐藥檢測試劑盒拉米夫定耐藥檢測試劑盒阿德福韋耐藥檢測試劑盒阿德福韋耐藥檢測試劑盒共價閉合環(huán)狀共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)檢測試劑盒檢測試劑盒恩替卡韋耐藥檢測試劑盒恩替卡韋耐藥檢測試劑盒PCR-RFLPPCR-RFLP法：法：(PCR(PCR產(chǎn)物限制性酶切片斷多態(tài)性分析產(chǎn)物限制性酶切片斷多態(tài)性分析) )法醫(yī)學物證鑒定法醫(yī)學物證鑒定 個體識別；親子鑒定方法：PCR-RFLP（限制片段長度多態(tài)性） DNA指紋 PCR-ASO （等位基因特異性寡核苷酸） PCR-VNTR（可變數(shù)目串聯(lián)重復序列）多態(tài)性 PCR-STR（短串