第四章沉淀法

1、第四章第四章 沉沉 淀淀 法法 (precipitation)(precipitation)生物分離過程的一般流程生物分離過程的一般流程原料液原料液細(xì)胞分離細(xì)胞分離( (離心，過濾離心，過濾) )細(xì)胞胞內(nèi)產(chǎn)物細(xì)胞胞內(nèi)產(chǎn)物路線一路線一路線二路線二細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎碎片分離碎片分離路線一路線一A A路線一路線一B B清液胞外產(chǎn)物清液胞外產(chǎn)物粗分離粗分離( (沉淀沉淀/ /超過濾超過濾/ /萃取萃取) )純化純化( (層析、離子交換、吸附層析、離子交換、吸附) )脫鹽脫鹽( (凝膠過濾、超濾凝膠過濾、超濾) )濃縮濃縮( (超濾超濾) )精制精制( (結(jié)晶、干燥結(jié)晶、干燥) )包含體包含體溶解溶解(

2、(加鹽酸胍、脲加鹽酸胍、脲) )復(fù)性復(fù)性沉淀：利用沉析劑使生化物質(zhì)在溶液中的溶解度降低沉淀：利用沉析劑使生化物質(zhì)在溶液中的溶解度降低而形成無定形固體沉淀的過程。而形成無定形固體沉淀的過程。沉淀法的目的：沉淀法的目的：(通過沉淀達(dá)到濃縮的目的；通過沉淀達(dá)到濃縮的目的；(沉淀方法可有選擇地沉淀雜質(zhì)或有選擇地沉淀所需沉淀方法可有選擇地沉淀雜質(zhì)或有選擇地沉淀所需成分，初步純化成分，初步純化 ；(將已純化的產(chǎn)品由液態(tài)變成固態(tài)，加以保存或進(jìn)一將已純化的產(chǎn)品由液態(tài)變成固態(tài)，加以保存或進(jìn)一步處理。步處理。沉淀法是最古老的分離和純化生物物質(zhì)的方法，但目沉淀法是最古老的分離和純化生物物質(zhì)的方法，但目前仍廣泛應(yīng)用在

3、工業(yè)上和實(shí)驗(yàn)室中。前仍廣泛應(yīng)用在工業(yè)上和實(shí)驗(yàn)室中。4.1 概述沉淀法的原理：沉淀法的原理：(生物分子在水中形成穩(wěn)定的溶液是有條件的，生物分子在水中形成穩(wěn)定的溶液是有條件的，這些就是溶液的各種理化參數(shù)。任何能夠影響這些就是溶液的各種理化參數(shù)。任何能夠影響這些條件的因素都會(huì)破壞溶液的穩(wěn)定性。這些條件的因素都會(huì)破壞溶液的穩(wěn)定性。(沉淀法基本原理沉淀法基本原理就是采用適當(dāng)?shù)拇胧└淖內(nèi)芤壕褪遣捎眠m當(dāng)?shù)拇胧└淖內(nèi)芤旱睦砘瘏?shù)，控制溶液的各種成分的溶解度，的理化參數(shù)，控制溶液的各種成分的溶解度，根據(jù)不同物質(zhì)在溶劑中的溶解度不同而達(dá)到分根據(jù)不同物質(zhì)在溶劑中的溶解度不同而達(dá)到分離的目的，離的目的，(溶劑組分的改

4、變或加入某些沉淀劑以及改變?nèi)苋軇┙M分的改變或加入某些沉淀劑以及改變?nèi)芤旱囊旱膒HpH值、離子強(qiáng)度和極性都會(huì)使溶質(zhì)的溶解值、離子強(qiáng)度和極性都會(huì)使溶質(zhì)的溶解度產(chǎn)生明顯的改變。度產(chǎn)生明顯的改變。 概 述n沉淀操作常在發(fā)酵液經(jīng)過過濾和離心（除去不沉淀操作常在發(fā)酵液經(jīng)過過濾和離心（除去不溶性雜質(zhì)及細(xì)胞碎片）以后進(jìn)行，得到的沉析溶性雜質(zhì)及細(xì)胞碎片）以后進(jìn)行，得到的沉析物可直接干燥制得成品或經(jīng)進(jìn)一步提純，如透物可直接干燥制得成品或經(jīng)進(jìn)一步提純，如透析、超濾、層析或結(jié)晶制得高純度生化產(chǎn)品。析、超濾、層析或結(jié)晶制得高純度生化產(chǎn)品。n操作方式可分連續(xù)法或間歇法兩種，規(guī)模較小操作方式可分連續(xù)法或間歇法兩種，規(guī)模較小

5、時(shí)，常采用間歇法。不管哪一種方式操作步驟時(shí)，常采用間歇法。不管哪一種方式操作步驟通常按三步進(jìn)行：通常按三步進(jìn)行： 概述概述沉淀法操作步驟沉淀法操作步驟：首先加入沉淀劑，首先加入沉淀劑，沉淀劑的陳化，促進(jìn)粒子生長；沉淀劑的陳化，促進(jìn)粒子生長；離心或過濾，收集沉淀物。離心或過濾，收集沉淀物。加沉淀劑的方式和陳化條件對(duì)產(chǎn)物的純度、加沉淀劑的方式和陳化條件對(duì)產(chǎn)物的純度、收率和沉淀物的形狀都有很大影響收率和沉淀物的形狀都有很大影響。 概述概述沉淀生成動(dòng)力學(xué)溶解度值的降低是一個(gè)動(dòng)力學(xué)過程。當(dāng)體系變得不溶解度值的降低是一個(gè)動(dòng)力學(xué)過程。當(dāng)體系變得不穩(wěn)定以后，分子互相碰撞并產(chǎn)生聚并作用。通常認(rèn)穩(wěn)定以后，分子互相

6、碰撞并產(chǎn)生聚并作用。通常認(rèn)為相互碰撞由下面幾種運(yùn)動(dòng)引起：為相互碰撞由下面幾種運(yùn)動(dòng)引起：熱運(yùn)動(dòng)，熱運(yùn)動(dòng)，BromnianBromnian運(yùn)動(dòng)；運(yùn)動(dòng)；對(duì)流運(yùn)動(dòng)，由機(jī)械攪拌產(chǎn)生；對(duì)流運(yùn)動(dòng)，由機(jī)械攪拌產(chǎn)生；差示沉降，由顆粒自由沉降速度不同造成的。差示沉降，由顆粒自由沉降速度不同造成的。為了簡化沉淀過程動(dòng)力學(xué)，為了簡化沉淀過程動(dòng)力學(xué)，可把沉淀過程分成下述個(gè)步驟：可把沉淀過程分成下述個(gè)步驟：n(1) (1) 初始混合初始混合n(2) (2) 新相生成新相生成n(3) (3) 布朗運(yùn)動(dòng)凝集布朗運(yùn)動(dòng)凝集n(4) (4) 機(jī)械碰撞凝集機(jī)械碰撞凝集n(5) (5) 聚集體陳化聚集體陳化n(6) (6) 聚集體沉淀

7、聚集體沉淀沉淀生成動(dòng)力學(xué)沉淀生成動(dòng)力學(xué)沉淀法不僅用于實(shí)驗(yàn)室中，因其不需專門設(shè)備，沉淀法不僅用于實(shí)驗(yàn)室中，因其不需專門設(shè)備，且易于放大，也廣泛用于生產(chǎn)的制備過程，且易于放大，也廣泛用于生產(chǎn)的制備過程，是分離純化生物大分子，特別是制備蛋白質(zhì)和酶是分離純化生物大分子，特別是制備蛋白質(zhì)和酶時(shí)最常用的方法。時(shí)最常用的方法。l優(yōu)點(diǎn)：操作簡單、經(jīng)濟(jì)、濃縮倍數(shù)高優(yōu)點(diǎn)：操作簡單、經(jīng)濟(jì)、濃縮倍數(shù)高l缺點(diǎn)：針對(duì)復(fù)雜體系而言，分離度不高、選擇缺點(diǎn)：針對(duì)復(fù)雜體系而言，分離度不高、選擇性不強(qiáng)性不強(qiáng)概概 述述沉淀法的分類沉淀法的分類根據(jù)所加入的沉淀劑的不同，沉淀法可以分為：根據(jù)所加入的沉淀劑的不同，沉淀法可以分為：（1 1

8、）鹽析法；）鹽析法；（2 2）等電點(diǎn)沉淀法；）等電點(diǎn)沉淀法；（3 3）有機(jī)溶劑沉淀法；）有機(jī)溶劑沉淀法；（4 4）非離子型聚合物沉淀法；）非離子型聚合物沉淀法；（5 5）聚電解質(zhì)沉淀法；）聚電解質(zhì)沉淀法；（6 6）復(fù)合鹽沉淀法等）復(fù)合鹽沉淀法等（7 7）親和沉淀法）親和沉淀法（8 8）選擇性沉淀法。）選擇性沉淀法。 蛋白質(zhì)的溶解特性蛋白質(zhì)的溶解特性n蛋白質(zhì)是兩性高分子電解質(zhì)（蛋白質(zhì)是兩性高分子電解質(zhì)（amphoteric amphoteric polymerpolymer），主要由疏水性各不相同的），主要由疏水性各不相同的2020種氨基酸種氨基酸組成。組成。n在水溶液中，多肽鏈中的疏水性氨基酸

9、殘基具有在水溶液中，多肽鏈中的疏水性氨基酸殘基具有向內(nèi)部折疊的趨勢(shì)，即便如此，一般仍有部分疏向內(nèi)部折疊的趨勢(shì)，即便如此，一般仍有部分疏水性氨基酸殘基暴露在外表面，形成疏水區(qū)。疏水性氨基酸殘基暴露在外表面，形成疏水區(qū)。疏水性氨基酸含量高的蛋白質(zhì)的疏水區(qū)大，疏水性水性氨基酸含量高的蛋白質(zhì)的疏水區(qū)大，疏水性強(qiáng)。強(qiáng)。n親水性氨基酸殘基基本分布在蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)的親水性氨基酸殘基基本分布在蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)的外表面。外表面。n因此，蛋白質(zhì)表面由不均勻分布的荷電基團(tuán)形成因此，蛋白質(zhì)表面由不均勻分布的荷電基團(tuán)形成荷電區(qū)、親水區(qū)和疏水區(qū)構(gòu)成荷電區(qū)、親水區(qū)和疏水區(qū)構(gòu)成。蛋白質(zhì)分子表面的憎水區(qū)域和荷電區(qū)域蛋白質(zhì)分子表面

10、的憎水區(qū)域和荷電區(qū)域蛋白質(zhì)的溶解特性蛋白質(zhì)的溶解特性n蛋白質(zhì)的溶解行為由其組成、構(gòu)象以及分子周蛋白質(zhì)的溶解行為由其組成、構(gòu)象以及分子周圍溶液性質(zhì)所決定。圍溶液性質(zhì)所決定。n蛋白質(zhì)在自然環(huán)境中通常是可溶的，所以其大蛋白質(zhì)在自然環(huán)境中通常是可溶的，所以其大部分是親水的，但其內(nèi)部大部分是疏水的。部分是親水的，但其內(nèi)部大部分是疏水的。n一般而言，小分子蛋白質(zhì)比起在化學(xué)上類似的一般而言，小分子蛋白質(zhì)比起在化學(xué)上類似的大分子蛋白質(zhì)更易溶解。大分子蛋白質(zhì)更易溶解。防止蛋白質(zhì)凝聚沉淀的屏障防止蛋白質(zhì)凝聚沉淀的屏障u蛋白質(zhì)周圍的水化層蛋白質(zhì)周圍的水化層（hydration shell)，保保護(hù)了蛋白質(zhì)粒子，避免

11、了相互碰撞，護(hù)了蛋白質(zhì)粒子，避免了相互碰撞，使蛋白質(zhì)使蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的膠體溶液。形成穩(wěn)定的膠體溶液。u蛋白質(zhì)兩性電解質(zhì)，分子間靜電排斥作用。蛋白質(zhì)兩性電解質(zhì)，分子間靜電排斥作用。（存在雙電層）蛋白質(zhì)粒子在水溶液中是帶電（存在雙電層）蛋白質(zhì)粒子在水溶液中是帶電的，帶電的原因主要是吸附溶液中的離子或自的，帶電的原因主要是吸附溶液中的離子或自身基團(tuán)的電離。蛋白質(zhì)表面的電荷與溶液中反身基團(tuán)的電離。蛋白質(zhì)表面的電荷與溶液中反離子的電荷構(gòu)成雙電層。離子的電荷構(gòu)成雙電層。4.4.鹽析鹽析鹽析鹽析概念：概念：在高濃度的中性鹽存在下，蛋白質(zhì)（酶）等在高濃度的中性鹽存在下，蛋白質(zhì)（酶）等生物大分子物質(zhì)在水溶液中的

12、溶解度降低，產(chǎn)生沉生物大分子物質(zhì)在水溶液中的溶解度降低，產(chǎn)生沉淀的過程。淀的過程。鹽析是可逆的，而變性是不可逆的鹽析是可逆的，而變性是不可逆的早在早在18591859年，中性鹽鹽析法就被用于從血液中分離年，中性鹽鹽析法就被用于從血液中分離蛋白質(zhì)，隨后又在尿蛋白、血漿蛋白等的分離和分蛋白質(zhì)，隨后又在尿蛋白、血漿蛋白等的分離和分級(jí)中使用，得到了比較滿意的結(jié)果。級(jí)中使用，得到了比較滿意的結(jié)果。 鹽析法機(jī)理鹽析法機(jī)理（1 1）破壞水化膜，分子間易碰撞聚集破壞水化膜，分子間易碰撞聚集，將大量將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中，高濃度的鹽離子有很強(qiáng)的水化鹽加到蛋白質(zhì)溶液中，高濃度的鹽離子有很強(qiáng)的水化力，于是蛋白質(zhì)分

13、子周圍的水化膜層減弱乃至消失，力，于是蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜層減弱乃至消失，使蛋白質(zhì)分子因熱運(yùn)動(dòng)碰撞聚集。使蛋白質(zhì)分子因熱運(yùn)動(dòng)碰撞聚集。（2 2）破壞水化膜，暴露出憎水區(qū)域破壞水化膜，暴露出憎水區(qū)域，由于憎水由于憎水區(qū)域間作用使蛋白質(zhì)聚集而沉淀，憎水區(qū)域越多，越區(qū)域間作用使蛋白質(zhì)聚集而沉淀，憎水區(qū)域越多，越易沉淀。易沉淀。（3 3）中和電荷，減少靜電斥力中和電荷，減少靜電斥力，中性鹽加入蛋白中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后，蛋白質(zhì)表面電荷大量被中和，靜電斥力降質(zhì)溶液后，蛋白質(zhì)表面電荷大量被中和，靜電斥力降低，導(dǎo)致蛋白溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間聚集而低，導(dǎo)致蛋白溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。沉

14、淀。鹽析過程鹽析過程 當(dāng)中性鹽加入蛋白質(zhì)分散體系時(shí)可能出現(xiàn)以下兩當(dāng)中性鹽加入蛋白質(zhì)分散體系時(shí)可能出現(xiàn)以下兩種情況：種情況：（1）“鹽溶鹽溶”現(xiàn)象現(xiàn)象(salt-in)低鹽濃度下，增加蛋低鹽濃度下，增加蛋白質(zhì)分子間靜電斥力，蛋白質(zhì)溶解度增大白質(zhì)分子間靜電斥力，蛋白質(zhì)溶解度增大 。（2）“鹽析鹽析”現(xiàn)象現(xiàn)象(salt-out)高鹽濃度下，中和高鹽濃度下，中和電荷、破壞水化膜，蛋白質(zhì)溶解度隨之下降電荷、破壞水化膜，蛋白質(zhì)溶解度隨之下降 。l鹽析作用要強(qiáng)鹽析作用要強(qiáng)l鹽析用鹽需有較大的溶解度鹽析用鹽需有較大的溶解度l鹽析用鹽必須是惰性的鹽析用鹽必須是惰性的l來源豐富、經(jīng)濟(jì)來源豐富、經(jīng)濟(jì)1）鹽析用鹽的選

15、擇）鹽析用鹽的選擇鹽析用鹽的選擇鹽析用鹽的選擇在相同離子強(qiáng)度下，鹽的種類對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響有在相同離子強(qiáng)度下，鹽的種類對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響有一定差異，一般的規(guī)律為：一定差異，一般的規(guī)律為：半徑小的高價(jià)離子的鹽析作半徑小的高價(jià)離子的鹽析作用較強(qiáng)，半徑大的低價(jià)離子作用較弱用較強(qiáng)，半徑大的低價(jià)離子作用較弱陰離子鹽析效果陰離子鹽析效果 ：檸檬酸檸檬酸PO43- SO42- CH3COO- Cl- NO3-SCN-陽離子鹽析效果：陽離子鹽析效果：NH4+ K+Na+ 高價(jià)陽離子高價(jià)陽離子陰離子的影響大于陽離子陰離子的影響大于陽離子鹽析中常用的鹽：硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀、磷酸鈉鹽析中常用的鹽：硫酸銨、硫

16、酸鈉、磷酸鉀、磷酸鈉硫酸銨是最常用的蛋白質(zhì)鹽析沉淀劑硫酸銨是最常用的蛋白質(zhì)鹽析沉淀劑u（1 1）價(jià)廉；）價(jià)廉；u（2 2）溶解度大，溫度系數(shù)小，許多蛋白質(zhì)可以鹽析出來；）溶解度大，溫度系數(shù)小，許多蛋白質(zhì)可以鹽析出來；u（3 3）硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，）硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，u（4 4）不易引起蛋白質(zhì)變性。）不易引起蛋白質(zhì)變性。 鹽析用鹽的選擇鹽析用鹽的選擇缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：（1）水解變酸；）水解變酸；（2）高）高pH 釋氨，腐蝕；釋氨，腐蝕；（3）殘留產(chǎn)品有影響。）殘留產(chǎn)品有影響。鹽析操作(加鹽方式）硫酸銨的加入有以下幾種方法：硫酸銨的加入有以下幾種方法：1 1）加入固體鹽法）加

17、入固體鹽法 用于要求飽和度較高而不增大溶液體積的情用于要求飽和度較高而不增大溶液體積的情況；工業(yè)上常采用這種方法，加入速度不能太快，應(yīng)分批加入。況；工業(yè)上常采用這種方法，加入速度不能太快，應(yīng)分批加入。攪拌可加速溶解和膠體溶液的破壞，有利于蛋白質(zhì)的沉淀，但攪拌可加速溶解和膠體溶液的破壞，有利于蛋白質(zhì)的沉淀，但強(qiáng)烈攪拌會(huì)產(chǎn)生泡沫。引起蛋白質(zhì)表面變性或活力下降，并會(huì)強(qiáng)烈攪拌會(huì)產(chǎn)生泡沫。引起蛋白質(zhì)表面變性或活力下降，并會(huì)使沉淀破碎，形成細(xì)小顆粒，沉淀不完全，增加過濾的困難。使沉淀破碎，形成細(xì)小顆粒，沉淀不完全，增加過濾的困難。所以攪拌需適中。所以攪拌需適中。2 2）加入飽和溶液法）加入飽和溶液法 用于

18、要求飽和度不高而原來溶液體積不大用于要求飽和度不高而原來溶液體積不大的情況；它可防止局部過濃，但加量較多時(shí)，料液會(huì)被稀釋。的情況；它可防止局部過濃，但加量較多時(shí)，料液會(huì)被稀釋。3 3）透析平衡法）透析平衡法 先將鹽析的樣品裝于透析袋中，然后浸入飽和先將鹽析的樣品裝于透析袋中，然后浸入飽和硫酸銨中進(jìn)行透析，袋內(nèi)飽和度逐漸提高，達(dá)到設(shè)定濃度后，硫酸銨中進(jìn)行透析，袋內(nèi)飽和度逐漸提高，達(dá)到設(shè)定濃度后，目的蛋白析出。該法優(yōu)點(diǎn)在于硫酸銨濃度變化有連續(xù)性，鹽析目的蛋白析出。該法優(yōu)點(diǎn)在于硫酸銨濃度變化有連續(xù)性，鹽析效果好，但程序煩瑣，故多用于結(jié)晶。效果好，但程序煩瑣，故多用于結(jié)晶。u一般說來，離子強(qiáng)度越大，蛋

19、白質(zhì)的溶解度越一般說來，離子強(qiáng)度越大，蛋白質(zhì)的溶解度越低。低。u在進(jìn)行分離的時(shí)候，一般從低離子強(qiáng)度到高離在進(jìn)行分離的時(shí)候，一般從低離子強(qiáng)度到高離子強(qiáng)度順次進(jìn)行。子強(qiáng)度順次進(jìn)行。u每一組分被鹽析出來后，經(jīng)過過濾或冷凍離心每一組分被鹽析出來后，經(jīng)過過濾或冷凍離心收集，再在溶液中逐漸提高中性鹽的飽和度，收集，再在溶液中逐漸提高中性鹽的飽和度，使另一種蛋白質(zhì)組分鹽析出來。使另一種蛋白質(zhì)組分鹽析出來。 u組成相近的蛋白質(zhì)，分子量越大，沉淀所需鹽組成相近的蛋白質(zhì)，分子量越大，沉淀所需鹽的量越少；蛋白質(zhì)分子不對(duì)稱性越大，也越易的量越少；蛋白質(zhì)分子不對(duì)稱性越大，也越易沉淀。沉淀。2 2）鹽濃度對(duì)鹽析效果的影響

20、）鹽濃度對(duì)鹽析效果的影響 S=-S=-s sS S蛋白質(zhì)的溶解度，蛋白質(zhì)的溶解度，g/L; g/L; I I離子強(qiáng)度，離子強(qiáng)度， I=1/2mI=1/2mi iz zi i2 2 m mi i離子離子i i的摩爾濃度；的摩爾濃度；ZiZi所帶電荷所帶電荷常數(shù)，圖中常數(shù)，圖中截距截距KsKs鹽析常數(shù)，圖中直線斜率鹽析常數(shù)，圖中直線斜率CohnCohn經(jīng)驗(yàn)式經(jīng)驗(yàn)式蛋白質(zhì)溶解度與鹽濃度的關(guān)系蛋白質(zhì)溶解度與鹽濃度的關(guān)系和和Ks的物理意義的物理意義n代表截距，即當(dāng)離子強(qiáng)度為零，也就是純水中代表截距，即當(dāng)離子強(qiáng)度為零，也就是純水中的假想溶解度的對(duì)數(shù)。與蛋白質(zhì)種類、溫度、的假想溶解度的對(duì)數(shù)。與蛋白質(zhì)種類、溫

21、度、pHpH值有值有關(guān)，與鹽無關(guān)；關(guān)，與鹽無關(guān)；nKsKs鹽析常數(shù)，代表圖中直線的斜率；鹽析常數(shù)，代表圖中直線的斜率；n從一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，KsKs與溫度和與溫度和pHpH無關(guān)，但和蛋白無關(guān)，但和蛋白質(zhì)與鹽的種類有關(guān)。但這種變化不是很大，例如以硫質(zhì)與鹽的種類有關(guān)。但這種變化不是很大，例如以硫酸銨作為沉淀劑時(shí)，酸銨作為沉淀劑時(shí)，KsKs值對(duì)不同的蛋白質(zhì)來說，其變值對(duì)不同的蛋白質(zhì)來說，其變化不會(huì)超過化不會(huì)超過1 1倍。倍。用鹽析法分離蛋白質(zhì)的二種方法用鹽析法分離蛋白質(zhì)的二種方法鹽析法分為兩類，鹽析法分為兩類，第一類叫第一類叫Ks分段鹽析法，分段鹽析法，在一定在一定pH和溫度下通

22、和溫度下通過改變離子強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)，過改變離子強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)，（固定固定pH, 溫度，溫度，改變鹽改變鹽濃度濃度），），由于蛋白質(zhì)對(duì)離子強(qiáng)度的變化非常敏感，由于蛋白質(zhì)對(duì)離子強(qiáng)度的變化非常敏感，易產(chǎn)生共沉淀現(xiàn)象，易產(chǎn)生共沉淀現(xiàn)象，用于早期的粗提液；用于早期的粗提液；第二種叫第二種叫分段鹽析法，分段鹽析法，在一定離子強(qiáng)度下通過在一定離子強(qiáng)度下通過改變改變PH和溫度來實(shí)現(xiàn)，（固定離子強(qiáng)度，和溫度來實(shí)現(xiàn)，（固定離子強(qiáng)度，改變改變pH及溫度及溫度），由于溶質(zhì)溶解度變化緩慢，且變），由于溶質(zhì)溶解度變化緩慢，且變化幅度小，因此分辨率更高，用于后期進(jìn)一步分化幅度小，因此分辨率更高，用于后期進(jìn)一步分離純化和結(jié)晶。離純化和結(jié)

23、晶。鹽析用鹽量的確定鹽析用鹽量的確定- -飽和度：飽和度：u飽和度（飽和度（Saturation）的概念：）的概念： 以硫酸銨為例：以硫酸銨為例：250C時(shí)，硫酸銨的飽和溶解度時(shí)，硫酸銨的飽和溶解度是是767g/L定義為定義為100%飽和度飽和度u目標(biāo)蛋白質(zhì)的鹽析沉淀操作之前，所需的硫酸目標(biāo)蛋白質(zhì)的鹽析沉淀操作之前，所需的硫酸銨濃度或飽和濃度可通過實(shí)驗(yàn)確定。銨濃度或飽和濃度可通過實(shí)驗(yàn)確定。u對(duì)多數(shù)蛋白質(zhì)，當(dāng)達(dá)到對(duì)多數(shù)蛋白質(zhì)，當(dāng)達(dá)到85%飽和度時(shí)，溶解度飽和度時(shí)，溶解度都小于都小于 0.l mg/L，通常為兼顧收率與純度，飽，通常為兼顧收率與純度，飽和度的操作范圍在和度的操作范圍在40%-60%

24、之間。之間。原蛋白溶液體積為原蛋白溶液體積為V，欲使其硫銨飽和度達(dá)到，欲使其硫銨飽和度達(dá)到S，需加入飽和硫酸銨溶液的體積數(shù)？需加入飽和硫酸銨溶液的體積數(shù)？ X=VS/(1-S) X：應(yīng)加入的飽和硫銨溶液的體積：應(yīng)加入的飽和硫銨溶液的體積 V：原蛋白質(zhì)的溶液的體積：原蛋白質(zhì)的溶液的體積 S：應(yīng)達(dá)到的硫銨飽和度：應(yīng)達(dá)到的硫銨飽和度原來蛋白溶液的飽和度為原來蛋白溶液的飽和度為S1，現(xiàn)希望其飽和度增加，現(xiàn)希望其飽和度增加為為S2，需加入多少體積的飽和硫酸銨溶液，需加入多少體積的飽和硫酸銨溶液? X=V (S2- S1)/(1-S2) X：應(yīng)加入的飽和硫銨體積：應(yīng)加入的飽和硫銨體積 V：原有溶液的體積：

25、原有溶液的體積 S ：原溶液硫銨的飽和度：原溶液硫銨的飽和度 S ：要達(dá)到的硫銨的飽和度：要達(dá)到的硫銨的飽和度加固體硫銨的方法加固體硫銨的方法考慮到在鹽析時(shí)，如加飽和硫銨溶液會(huì)使考慮到在鹽析時(shí)，如加飽和硫銨溶液會(huì)使溶液體溶液體積增大或使蛋白質(zhì)濃度降低積增大或使蛋白質(zhì)濃度降低，因此加入固體硫銨，因此加入固體硫銨比較適合，可用公式計(jì)算。比較適合，可用公式計(jì)算。在在20 時(shí)使時(shí)使1L M1摩爾濃度時(shí)（摩爾濃度時(shí)（NH4）2SO4溶液增溶液增至至M2摩爾濃度，所需加入（摩爾濃度，所需加入（NH4）2SO4的克數(shù)的克數(shù)C： C =533（M -M ）/(4.05-0.3M2) C：需加硫銨的g數(shù) M1：

26、原溶液的濃度摩爾數(shù) M2：需達(dá)到的濃度摩爾數(shù)在在20 時(shí)使時(shí)使1升升S1飽和度時(shí)（飽和度時(shí)（NH4）2SO4溶液增溶液增至至S2飽和度，所需加入（飽和度，所需加入（NH4）2SO4的克數(shù)：的克數(shù)：C =533（S2-S1）/(100-0.3S2) C：需加硫銨的g數(shù) S1：原溶液的飽和度 S2：需達(dá)到的飽和度以上數(shù)據(jù)都可在有關(guān)書上查到以上數(shù)據(jù)都可在有關(guān)書上查到 204060800100總蛋白總蛋白目標(biāo)蛋白質(zhì)目標(biāo)蛋白質(zhì)上清液蛋白濃度上清液蛋白濃度l由于不同的蛋白質(zhì)溶解度由于不同的蛋白質(zhì)溶解度不同，沉淀時(shí)所需的離子不同，沉淀時(shí)所需的離子強(qiáng)度也不相同，強(qiáng)度也不相同，l如果需要先除去些雜蛋白，如果需要

27、先除去些雜蛋白，然后在較高的飽和度下，然后在較高的飽和度下，沉淀目標(biāo)蛋白質(zhì)，則可采沉淀目標(biāo)蛋白質(zhì)，則可采用分段鹽析用分段鹽析改變鹽的濃度，可將混合改變鹽的濃度，可將混合液中的蛋白質(zhì)分批鹽析分液中的蛋白質(zhì)分批鹽析分開。開。l如半飽和硫酸銨可沉淀血如半飽和硫酸銨可沉淀血漿球蛋白，飽和硫酸銨則漿球蛋白，飽和硫酸銨則可沉淀包括血漿清蛋白。可沉淀包括血漿清蛋白。 分段鹽析(fractional salting out)鹽析的影響因素：3）pH值u一般來說，蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多溶解度越大，一般來說，蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多溶解度越大，凈電荷越少溶解度越小，在等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)溶解凈電荷越少溶解度越小，在等電點(diǎn)時(shí)蛋

28、白質(zhì)溶解度最小。度最小。u為提高鹽析效率，多將溶液為提高鹽析效率，多將溶液pHpH值調(diào)到目的蛋白的值調(diào)到目的蛋白的等電點(diǎn)處。等電點(diǎn)處。 u注意在水中或稀鹽液中的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)與高鹽濃注意在水中或稀鹽液中的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)與高鹽濃度下所測的結(jié)果是不同的，需根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整度下所測的結(jié)果是不同的，需根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整溶液溶液pHpH值，以達(dá)到最好的鹽析效果。值，以達(dá)到最好的鹽析效果。在進(jìn)行鹽析時(shí)，必在進(jìn)行鹽析時(shí)，必須控制須控制pHpH圖中直線都相互平圖中直線都相互平行行pH值鹽析影響因素：4）溫度的影響u在低離子強(qiáng)度或純水中，蛋白在低離子強(qiáng)度或純水中，蛋白質(zhì)溶解度在一定范圍內(nèi)隨溫度質(zhì)溶解度在一定范圍內(nèi)隨溫

29、度增加而增加。增加而增加。u但在高濃度下，蛋白質(zhì)、酶和但在高濃度下，蛋白質(zhì)、酶和多肽類物質(zhì)的溶解度隨溫度上多肽類物質(zhì)的溶解度隨溫度上升而下降。升而下降。u在一般情況下，蛋白質(zhì)對(duì)鹽析在一般情況下，蛋白質(zhì)對(duì)鹽析溫度無特殊要求，可在室溫下溫度無特殊要求，可在室溫下進(jìn)行，只有某些對(duì)溫度比較敏進(jìn)行，只有某些對(duì)溫度比較敏感的酶要求在感的酶要求在0-40-4進(jìn)行。進(jìn)行。u隨溫度升高減小，熱促失水隨溫度升高減小，熱促失水膜膜uKsKs不隨溫度而變不隨溫度而變鹽析的影響因素：5）蛋白質(zhì)濃度 沉淀蛋白質(zhì)鹽的濃度范圍并不是固定的，而是和起始濃沉淀蛋白質(zhì)鹽的濃度范圍并不是固定的，而是和起始濃度有關(guān)。度有關(guān)。Z高濃度蛋

30、白溶液可以節(jié)約鹽的用量，若蛋白濃度過高，高濃度蛋白溶液可以節(jié)約鹽的用量，若蛋白濃度過高，會(huì)發(fā)生嚴(yán)重共沉淀作用，除雜蛋白的效果會(huì)明顯下降。會(huì)發(fā)生嚴(yán)重共沉淀作用，除雜蛋白的效果會(huì)明顯下降。Z在低濃度蛋白質(zhì)溶液中鹽析，所用的鹽量較多，共沉淀在低濃度蛋白質(zhì)溶液中鹽析，所用的鹽量較多，共沉淀作用比較少，但回收率會(huì)降低。作用比較少，但回收率會(huì)降低。Z因此需要在兩者之間進(jìn)行適當(dāng)選擇。因此需要在兩者之間進(jìn)行適當(dāng)選擇。Z分步分離提純時(shí)，寧可選擇稀一些的蛋白質(zhì)溶液，多加分步分離提純時(shí)，寧可選擇稀一些的蛋白質(zhì)溶液，多加一點(diǎn)中性鹽，使共沉淀作用減至最低限度。一點(diǎn)中性鹽，使共沉淀作用減至最低限度。Z一般認(rèn)為一般認(rèn)為2.

31、5%-3.0%2.5%-3.0%的蛋白質(zhì)濃度比較適中。相當(dāng)于的蛋白質(zhì)濃度比較適中。相當(dāng)于25 25 mg/mLmg/mL30mg/mL30mg/mL。u對(duì)起始濃度為對(duì)起始濃度為 30g/L30g/L的的COMbCOMb溶液，大部分蛋白質(zhì)在硫溶液，大部分蛋白質(zhì)在硫酸銨飽和度為酸銨飽和度為 58-6558-65之間沉淀出來；之間沉淀出來；u但對(duì)稀釋但對(duì)稀釋1010倍的倍的 COMbCOMb溶液，飽和度達(dá)到溶液，飽和度達(dá)到66%66%時(shí)才開始時(shí)才開始沉淀，而相應(yīng)的沉淀范圍為沉淀，而相應(yīng)的沉淀范圍為66-73%66-73%飽和度。飽和度。鹽析注意事項(xiàng)鹽析注意事項(xiàng)(選擇適宜飽和度選擇適宜飽和度(采用分步

32、鹽析采用分步鹽析(鹽析的成敗決定于溶液的鹽析的成敗決定于溶液的pHpH值與離子強(qiáng)度，穩(wěn)定值與離子強(qiáng)度，穩(wěn)定pHpH用磷酸緩用磷酸緩沖液沖液(在加入鹽時(shí)應(yīng)該緩慢均勻，攪拌也要緩慢，越到后來速度應(yīng)在加入鹽時(shí)應(yīng)該緩慢均勻，攪拌也要緩慢，越到后來速度應(yīng)該更注意緩慢，如果出現(xiàn)一些未溶解的鹽，應(yīng)該等其完全溶該更注意緩慢，如果出現(xiàn)一些未溶解的鹽，應(yīng)該等其完全溶解后再加鹽，以免引起局部的鹽濃度過高，導(dǎo)致酶失活。解后再加鹽，以免引起局部的鹽濃度過高，導(dǎo)致酶失活。(鹽析后最好緩慢攪拌一個(gè)小時(shí)而且再在冰浴中放置一段時(shí)間。鹽析后最好緩慢攪拌一個(gè)小時(shí)而且再在冰浴中放置一段時(shí)間。(為了避免鹽對(duì)酶的影響，一般脫鹽處理后再測

33、酶活性。為了避免鹽對(duì)酶的影響，一般脫鹽處理后再測酶活性。(鹽析后的蛋白質(zhì)最好盡快脫鹽處理，以免變性，透析較慢，鹽析后的蛋白質(zhì)最好盡快脫鹽處理，以免變性，透析較慢，一般可用超濾一般可用超濾鹽析注意事項(xiàng)鹽析注意事項(xiàng)硫酸銨的使用硫酸銨的使用硫酸銨中常含有少量的重金屬離子，對(duì)蛋白質(zhì)巰基有敏感硫酸銨中常含有少量的重金屬離子，對(duì)蛋白質(zhì)巰基有敏感作用，使用前用作用，使用前用H H2 2S S處理處理高濃度的硫酸銨溶液一般呈酸性（高濃度的硫酸銨溶液一般呈酸性（PH=5.0PH=5.0左右），使用前左右），使用前也需要用氨水調(diào)節(jié)至所需也需要用氨水調(diào)節(jié)至所需PHPH。硫酸銨容易吸潮，計(jì)算飽和度需注意硫酸銨容易吸潮

34、，計(jì)算飽和度需注意固體硫酸銨加入后體積變大固體硫酸銨加入后體積變大加入固體鹽后體積的變化已考加入固體鹽后體積的變化已考慮在表中；慮在表中；鹽析后一般放置半小時(shí)至一小時(shí)，待沉淀完全后才過濾或鹽析后一般放置半小時(shí)至一小時(shí)，待沉淀完全后才過濾或離心。過濾多用于高濃度硫酸銨溶液，因?yàn)榇朔N情況下，離心。過濾多用于高濃度硫酸銨溶液，因?yàn)榇朔N情況下，硫酸銨密度較大，若用離心法需要較高離心速度和長時(shí)間硫酸銨密度較大，若用離心法需要較高離心速度和長時(shí)間的離心操作，耗時(shí)耗能。離心多用于較低濃度硫酸銨溶液。的離心操作，耗時(shí)耗能。離心多用于較低濃度硫酸銨溶液。鹽析法特點(diǎn)：鹽析法特點(diǎn)：n成本低，不需要特別昂貴的設(shè)備。成

35、本低，不需要特別昂貴的設(shè)備。n操作簡單、安全。操作簡單、安全。n不會(huì)引起蛋白質(zhì)變性，經(jīng)透析去鹽后，能得不會(huì)引起蛋白質(zhì)變性，經(jīng)透析去鹽后，能得到保持生物活性的純化蛋白質(zhì)。到保持生物活性的純化蛋白質(zhì)。1.分離效果不理想，通常只是作為初步的分離分離效果不理想，通常只是作為初步的分離純化，還需要結(jié)合其它的純化方法。純化，還需要結(jié)合其它的純化方法。 4.等電點(diǎn)沉淀法等電點(diǎn)沉淀法 isoelectric point 等電點(diǎn)沉淀法等電點(diǎn)沉淀法在低的離子強(qiáng)度下，調(diào)在低的離子強(qiáng)度下，調(diào)pHpH至等電點(diǎn)，使蛋白質(zhì)至等電點(diǎn)，使蛋白質(zhì)所帶凈電荷為零，降低所帶凈電荷為零，降低了靜電斥力，而疏水力了靜電斥力，而疏水力能使

36、分子間相互吸引，能使分子間相互吸引，形成沉淀的操作稱為等形成沉淀的操作稱為等電點(diǎn)沉淀電點(diǎn)沉淀不同的兩性電解質(zhì)具有不同的兩性電解質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)，以此為不同的等電點(diǎn)，以此為基礎(chǔ)可進(jìn)行分離。基礎(chǔ)可進(jìn)行分離。生產(chǎn)胰島素時(shí)，在粗提生產(chǎn)胰島素時(shí)，在粗提液中先調(diào)液中先調(diào)pH8.0pH8.0去除堿性去除堿性蛋白質(zhì)，再調(diào)蛋白質(zhì)，再調(diào)pH3.0pH3.0去除去除酸性蛋白質(zhì)。酸性蛋白質(zhì)。pH=pIn蛋白質(zhì)的離子化情況既與蛋白質(zhì)的詳細(xì)結(jié)構(gòu)有關(guān)，也與蛋白質(zhì)的離子化情況既與蛋白質(zhì)的詳細(xì)結(jié)構(gòu)有關(guān)，也與溶液的溶液的pHpH值有關(guān)。一般來說，溶液的值有關(guān)。一般來說，溶液的pHpH值高，蛋白質(zhì)帶值高，蛋白質(zhì)帶負(fù)電；負(fù)電；pH

37、pH值低，蛋白質(zhì)帶正電。當(dāng)溶液的值低，蛋白質(zhì)帶正電。當(dāng)溶液的pHpH值為某一值值為某一值時(shí)，蛋白質(zhì)幾乎不帶電，即時(shí)，蛋白質(zhì)幾乎不帶電，即凈電荷為零凈電荷為零，或者說它帶相，或者說它帶相等的正電荷和負(fù)電荷，這時(shí)的等的正電荷和負(fù)電荷，這時(shí)的pHpH值稱為等電點(diǎn)，常用值稱為等電點(diǎn)，常用pIpI表示。表示。n兩性電解質(zhì)在溶液中兩性電解質(zhì)在溶液中pHpH處于等電點(diǎn)處于等電點(diǎn)pIpI時(shí)，分子表面靜電時(shí)，分子表面靜電荷為零，導(dǎo)致賴以穩(wěn)定的荷為零，導(dǎo)致賴以穩(wěn)定的雙電層及水化膜削弱或破壞雙電層及水化膜削弱或破壞，分子間引力增加，溶解度降低并沉淀析出。分子間引力增加，溶解度降低并沉淀析出。等電點(diǎn)沉淀法等電點(diǎn)沉淀法

38、等電點(diǎn)沉淀法操作十分簡便，試劑消耗少，給體等電點(diǎn)沉淀法操作十分簡便，試劑消耗少，給體系引入的外來物系引入的外來物( (雜質(zhì)雜質(zhì)) )也少。也少。是一種常用的分離是一種常用的分離純化方法，純化方法，收率低：收率低：但兩性溶質(zhì)（蛋白質(zhì)）在等電點(diǎn)附近但兩性溶質(zhì)（蛋白質(zhì)）在等電點(diǎn)附近（處）仍有一定的溶解度，（處）仍有一定的溶解度，( (有時(shí)甚至比較大有時(shí)甚至比較大) )，所以所以等電點(diǎn)沉淀往往不完全。等電點(diǎn)沉淀往往不完全。即等電點(diǎn)沉淀法往即等電點(diǎn)沉淀法往往不能獲得高的回收率。往不能獲得高的回收率。等電點(diǎn)沉淀的特點(diǎn)：等電點(diǎn)沉淀的特點(diǎn)：分辨率較低：許多分子的等電點(diǎn)比較接近，容易分辨率較低：許多分子的等電點(diǎn)

39、比較接近，容易發(fā)生共沉淀，所以分辨率較低。發(fā)生共沉淀，所以分辨率較低。因此很少單獨(dú)使因此很少單獨(dú)使用等電點(diǎn)沉淀法作為主要純化手段，往往與鹽析，用等電點(diǎn)沉淀法作為主要純化手段，往往與鹽析，有機(jī)溶劑沉淀等方法結(jié)合使用，在實(shí)際應(yīng)用種主有機(jī)溶劑沉淀等方法結(jié)合使用，在實(shí)際應(yīng)用種主要用于去雜蛋白。要用于去雜蛋白。n在蛋白質(zhì)疏水性比較大和結(jié)合水比較小時(shí)的沉淀在蛋白質(zhì)疏水性比較大和結(jié)合水比較小時(shí)的沉淀更有效。更有效。n最大缺點(diǎn)：最大缺點(diǎn)：無機(jī)酸有引起較大的蛋白質(zhì)不可逆變無機(jī)酸有引起較大的蛋白質(zhì)不可逆變性的危險(xiǎn)。性的危險(xiǎn)。 等電點(diǎn)沉淀注意事項(xiàng)等電點(diǎn)沉淀注意事項(xiàng)(1) 生物高分子的等電點(diǎn)易受鹽離子的影響發(fā)生變化。

40、生物高分子的等電點(diǎn)易受鹽離子的影響發(fā)生變化。 由于無機(jī)離子的影響，蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)通常會(huì)發(fā)生由于無機(jī)離子的影響，蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)通常會(huì)發(fā)生“漂移漂移”，陽，陽-高，陰高，陰-低。即：若蛋白質(zhì)分子結(jié)合低。即：若蛋白質(zhì)分子結(jié)合多量陽離子如：如多量陽離子如：如Zn2+、Ca2+ 、Mg2+等，會(huì)造成等等，會(huì)造成等電點(diǎn)升高；若蛋白質(zhì)分子結(jié)合多量陰離子如：如電點(diǎn)升高；若蛋白質(zhì)分子結(jié)合多量陰離子如：如Cl-、SO42-、HPO42-等，則等電點(diǎn)降低。等，則等電點(diǎn)降低。n自然界中許多蛋白質(zhì)較易結(jié)合陰離子，自然界中許多蛋白質(zhì)較易結(jié)合陰離子，使等電點(diǎn)向使等電點(diǎn)向酸側(cè)移動(dòng)酸側(cè)移動(dòng)。(2)在使用等電點(diǎn)沉淀時(shí)還應(yīng)考慮目的

41、物的穩(wěn)定性。在使用等電點(diǎn)沉淀時(shí)還應(yīng)考慮目的物的穩(wěn)定性。 有些蛋白質(zhì)或酶在等電點(diǎn)附近不穩(wěn)定。如有些蛋白質(zhì)或酶在等電點(diǎn)附近不穩(wěn)定。如-糜蛋糜蛋白酶白酶(pI=8.18.6)，胰蛋白酶，胰蛋白酶(pI=10.1)，它們?cè)?，它們?cè)谥行曰蚱珘A的環(huán)境中由于自身或其他蛋白水解酶中性或偏堿的環(huán)境中由于自身或其他蛋白水解酶的作用而部分降解失活。所以在實(shí)際操作中應(yīng)避的作用而部分降解失活。所以在實(shí)際操作中應(yīng)避免溶液免溶液pH上升至上升至5以上。以上。(3)生物大分子在等電點(diǎn)附近鹽溶作用很明顯。生物大分子在等電點(diǎn)附近鹽溶作用很明顯。 所以無論是單獨(dú)使用或與溶劑沉淀法合用，都必所以無論是單獨(dú)使用或與溶劑沉淀法合用，都必

42、須控制溶液的離子強(qiáng)度。須控制溶液的離子強(qiáng)度。4.4. 有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法organic sovent organic sovent precipitationprecipitationl概念：在含有溶質(zhì)的水溶液中加入一定量親水的有機(jī)溶劑，概念：在含有溶質(zhì)的水溶液中加入一定量親水的有機(jī)溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出。降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出。l有機(jī)溶劑對(duì)于許多蛋白質(zhì)（酶）、核酸、多糖和小分子生有機(jī)溶劑對(duì)于許多蛋白質(zhì)（酶）、核酸、多糖和小分子生化物質(zhì)都能發(fā)生沉淀作用，是較早使用的沉淀方法之一?；镔|(zhì)都能發(fā)生沉淀作用，是較早使用的沉淀方法之一。l優(yōu)點(diǎn)在于：優(yōu)點(diǎn)在于：1 1）分辨

43、能力比鹽析法高，即蛋白質(zhì)等只在一）分辨能力比鹽析法高，即蛋白質(zhì)等只在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑濃度下沉淀；個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑濃度下沉淀；2 2）沉淀不用脫鹽，過）沉淀不用脫鹽，過濾較為容易；濾較為容易；l缺點(diǎn)是缺點(diǎn)是:1:1）對(duì)具有生物活性的大分子容易引起變性失活，）對(duì)具有生物活性的大分子容易引起變性失活，2 2）操作要求在低溫下進(jìn)行。）操作要求在低溫下進(jìn)行。3 3）成本高）成本高l總體來說，蛋白質(zhì)和酶的有機(jī)溶劑沉淀法不如鹽析法普遍。總體來說，蛋白質(zhì)和酶的有機(jī)溶劑沉淀法不如鹽析法普遍。有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法機(jī)理有機(jī)溶劑沉淀法機(jī)理 *A 降低溶劑介電常數(shù)降低溶劑介電常數(shù)（介電常數(shù)（

44、介電常數(shù)D有機(jī)有機(jī) D水）水） ，減小溶劑的極性，從而削弱了溶劑分子與蛋白質(zhì)減小溶劑的極性，從而削弱了溶劑分子與蛋白質(zhì)分子間的相互作用力，增加了酶、蛋白質(zhì)、核酸分子間的相互作用力，增加了酶、蛋白質(zhì)、核酸等帶電粒子之間的作用力，因相互吸引而聚合沉等帶電粒子之間的作用力，因相互吸引而聚合沉淀。淀。*B 破壞水化膜：破壞水化膜：由于使用的有機(jī)溶劑與水互溶，由于使用的有機(jī)溶劑與水互溶，它們?cè)谌芙庥谒耐瑫r(shí)從蛋白質(zhì)分子周圍的水化它們?cè)谌芙庥谒耐瑫r(shí)從蛋白質(zhì)分子周圍的水化層中奪走了水分子，破壞水化層，降低蛋白質(zhì)分層中奪走了水分子，破壞水化層，降低蛋白質(zhì)分子的溶劑化能力，破壞蛋白質(zhì)的水化層，使蛋白子的溶劑化

45、能力，破壞蛋白質(zhì)的水化層，使蛋白質(zhì)沉淀。質(zhì)沉淀。*C 相反力：相反力：疏水基團(tuán)暴露并有機(jī)溶劑疏水基團(tuán)結(jié)疏水基團(tuán)暴露并有機(jī)溶劑疏水基團(tuán)結(jié)合形成疏水層。合形成疏水層。有機(jī)溶劑沉淀法機(jī)理有機(jī)溶劑沉淀法機(jī)理降低介電常數(shù)破壞水化膜 后來又提出了另外一種說法，后來又提出了另外一種說法，認(rèn)為有機(jī)溶劑沉淀認(rèn)為有機(jī)溶劑沉淀法的機(jī)理是有機(jī)溶劑可能破壞蛋白質(zhì)的某種鍵比法的機(jī)理是有機(jī)溶劑可能破壞蛋白質(zhì)的某種鍵比如氫鍵，使其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某種程度的變化，致如氫鍵，使其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某種程度的變化，致使一些原來包在內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露于表面，并使一些原來包在內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露于表面，并與有機(jī)溶劑的疏水基團(tuán)結(jié)合形成疏水作用，從而

46、與有機(jī)溶劑的疏水基團(tuán)結(jié)合形成疏水作用，從而使蛋白質(zhì)沉淀。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變形超使蛋白質(zhì)沉淀。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變形超過一定程度時(shí)，便會(huì)導(dǎo)致完全的變性。過一定程度時(shí)，便會(huì)導(dǎo)致完全的變性。常用的有機(jī)溶劑沉析劑常用的有機(jī)溶劑沉析劑選擇依據(jù)：選擇依據(jù)：(水溶性要好，沉淀用溶劑一般需能與水無限混溶，水溶性要好，沉淀用溶劑一般需能與水無限混溶，一些與水部分混溶或微溶的溶劑如氯仿、乙醚等一些與水部分混溶或微溶的溶劑如氯仿、乙醚等也有使用，但使用對(duì)象和方法不盡相同。也有使用，但使用對(duì)象和方法不盡相同。(沉淀作用要強(qiáng)，介電常數(shù)要小沉淀作用要強(qiáng)，介電常數(shù)要小(致變性作用要小致變性作用要小(毒性要小、揮發(fā)

47、性適中。沸點(diǎn)過低雖有利于除去毒性要小、揮發(fā)性適中。沸點(diǎn)過低雖有利于除去和回收，但揮發(fā)損失較大，且不安全。給勞動(dòng)保和回收，但揮發(fā)損失較大，且不安全。給勞動(dòng)保護(hù)及安全生產(chǎn)帶來麻煩。護(hù)及安全生產(chǎn)帶來麻煩。(容易獲取容易獲取 沉淀蛋白質(zhì)和酶常用的是沉淀蛋白質(zhì)和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮乙醇、甲醇和丙酮。沉淀。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的是乙醇。核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的是乙醇。乙醇乙醇是最常用的沉淀劑。是最常用的沉淀劑。(乙醇：乙醇：沉析作用強(qiáng)，揮發(fā)性適中，無毒，常用于蛋沉析作用強(qiáng)，揮發(fā)性適中，無毒，常用于蛋白質(zhì)、核酸、多糖等生物大分子的沉析；白質(zhì)、核酸、多糖等生物大分子的沉析；(丙酮丙

48、酮：沉析作用大于乙醇，用量小。如代替乙醇可：沉析作用大于乙醇，用量小。如代替乙醇可減少用量減少用量1/4-1/3，但沸點(diǎn)低、揮發(fā)大、著火點(diǎn)低、，但沸點(diǎn)低、揮發(fā)大、著火點(diǎn)低、對(duì)肝臟有一定毒性。應(yīng)用范圍不廣；對(duì)肝臟有一定毒性。應(yīng)用范圍不廣；(甲醇：甲醇：沉析作用與乙醇相當(dāng)，對(duì)蛋白質(zhì)的變性作用沉析作用與乙醇相當(dāng)，對(duì)蛋白質(zhì)的變性作用比乙醇和丙酮都小，但由于口服有強(qiáng)毒，限制了它比乙醇和丙酮都小，但由于口服有強(qiáng)毒，限制了它的使用。的使用。(其他溶劑：其他溶劑：如二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、如二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、2-甲甲基基-2,4-戊二醇戊二醇(MPD)，乙腈，也可作沉淀劑用，乙腈，也可作沉淀劑用，但

49、遠(yuǎn)不如上述乙醇、丙酮、甲醇使用普遍。但遠(yuǎn)不如上述乙醇、丙酮、甲醇使用普遍。(60%乙醇的介電常數(shù)是乙醇的介電常數(shù)是48，丙酮的介電常數(shù)是，丙酮的介電常數(shù)是22，2.5mol/L甘氨酸的介電常數(shù)很大，可以用甘氨酸的介電常數(shù)很大，可以用作蛋白質(zhì)等生物高分子溶液的穩(wěn)定劑。作蛋白質(zhì)等生物高分子溶液的穩(wěn)定劑。溶劑濃度的計(jì)算溶劑濃度的計(jì)算 V=V0(S2-S1)/( 100-S2) V- V-需加入的有機(jī)溶劑的體積；需加入的有機(jī)溶劑的體積； V Vo o-原溶液體積；原溶液體積； S S1 1-原溶液中有機(jī)溶劑的濃度；原溶液中有機(jī)溶劑的濃度； S S2 2-需達(dá)到的有機(jī)溶劑的濃度；需達(dá)到的有機(jī)溶劑的濃度；

50、該公式與鹽析公式一樣該公式與鹽析公式一樣未考慮混合后體積的變化未考慮混合后體積的變化，實(shí)，實(shí)際上等體積的乙醇和水相混后體積會(huì)縮小際上等體積的乙醇和水相混后體積會(huì)縮小5，如此，如此的體積變化對(duì)大多數(shù)工作影響不大，在有精確要求的的體積變化對(duì)大多數(shù)工作影響不大，在有精確要求的場合可按摩爾比計(jì)算，這樣可將體積變化因素抵消。場合可按摩爾比計(jì)算，這樣可將體積變化因素抵消。（1）溫度）溫度n低溫有利于防止溶質(zhì)變性；低溫有利于防止溶質(zhì)變性；有機(jī)溶劑與水混合時(shí)要產(chǎn)生相有機(jī)溶劑與水混合時(shí)要產(chǎn)生相當(dāng)數(shù)量的熱量，從而使體系的溫度升高，增加有機(jī)溶劑對(duì)當(dāng)數(shù)量的熱量，從而使體系的溫度升高，增加有機(jī)溶劑對(duì)蛋白質(zhì)的變性作用。因

51、此，在使用有機(jī)溶劑沉淀生物高分蛋白質(zhì)的變性作用。因此，在使用有機(jī)溶劑沉淀生物高分子時(shí)子時(shí)務(wù)必要控制在低溫下進(jìn)行。務(wù)必要控制在低溫下進(jìn)行。n另外低溫有利于提高收率（溫度越低，溶解度越?。?。另外低溫有利于提高收率（溫度越低，溶解度越?。Ｓ捎捎诖蠖鄶?shù)蛋白質(zhì)在乙醇于大多數(shù)蛋白質(zhì)在乙醇- -水混合溶液中的溶解度隨溫度下水混合溶液中的溶解度隨溫度下降而減少，低溫對(duì)提高收率也是有利的。降而減少，低溫對(duì)提高收率也是有利的。有機(jī)溶劑沉淀法的影響因素有機(jī)溶劑沉淀法的影響因素n用有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)時(shí)必須嚴(yán)格控制溫度。用有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)時(shí)必須嚴(yán)格控制溫度。n蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑存在時(shí)，溶解度多隨溫度升高蛋白質(zhì)在有機(jī)溶

52、劑存在時(shí)，溶解度多隨溫度升高而增加，如果形成沉淀后溫度升高，沉淀可能重而增加，如果形成沉淀后溫度升高，沉淀可能重新溶解，如果溫度下降可能使沉淀增多新溶解，如果溫度下降可能使沉淀增多( (雜蛋白雜蛋白) )。n一般都要低溫操作。一般都要低溫操作。n在有的情況下，把沉淀后清液的溫度降低可沉淀在有的情況下，把沉淀后清液的溫度降低可沉淀出另一種產(chǎn)品，這就是所謂出另一種產(chǎn)品，這就是所謂溫差分級(jí)沉淀。溫差分級(jí)沉淀。A A、預(yù)冷、預(yù)冷：為了達(dá)此目的，常將待分離的溶液和有機(jī)溶劑分別：為了達(dá)此目的，常將待分離的溶液和有機(jī)溶劑分別進(jìn)行預(yù)冷。后者最好預(yù)冷至進(jìn)行預(yù)冷。后者最好預(yù)冷至-10-10-20-20，在具體操作

53、時(shí)還應(yīng)，在具體操作時(shí)還應(yīng)不斷攪拌。不斷攪拌。 攪拌的作用一方面是為了散熱，一方面為了防止溶劑局部過攪拌的作用一方面是為了散熱，一方面為了防止溶劑局部過濃引起的變性作用和分辨率下降現(xiàn)象發(fā)生。為了以上目的，濃引起的變性作用和分辨率下降現(xiàn)象發(fā)生。為了以上目的，溶劑的加入速度也須控制，不宜太快。溶劑的加入速度也須控制，不宜太快。B B、短時(shí)間的老化處理：、短時(shí)間的老化處理：為減少溶劑對(duì)蛋白的變性作用，通常為減少溶劑對(duì)蛋白的變性作用，通常使沉淀在低溫下作短時(shí)間的老化處理（使沉淀在低溫下作短時(shí)間的老化處理（0.5-2h0.5-2h）后即進(jìn)行離）后即進(jìn)行離心分離，接著真空抽去剩余的溶劑，或?qū)⒊恋砣苋氪罅康木?/p>

54、心分離，接著真空抽去剩余的溶劑，或?qū)⒊恋砣苋氪罅康木彌_液中以稀釋溶劑，減少有機(jī)溶劑與目的產(chǎn)物的接觸。沖液中以稀釋溶劑，減少有機(jī)溶劑與目的產(chǎn)物的接觸。 控制溫度的具體做法：控制溫度的具體做法：（2）pHnpH對(duì)溶劑的沉淀效果影響很大，適宜的對(duì)溶劑的沉淀效果影響很大，適宜的pH可使沉淀效果可使沉淀效果增強(qiáng)，提高產(chǎn)品的收率，同時(shí)還可提高分辨率。增強(qiáng)，提高產(chǎn)品的收率，同時(shí)還可提高分辨率。n許多蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)附近有較好的沉淀效果，但不是所有的蛋白質(zhì)都是這樣，甚至有少數(shù)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)附近不太穩(wěn)定。n在控制溶液pH時(shí)有一點(diǎn)要特別注意，即：務(wù)必使溶液中大務(wù)必使溶液中大多數(shù)蛋白質(zhì)分子帶有相同電荷，而不要讓目的物

55、與主要雜多數(shù)蛋白質(zhì)分子帶有相同電荷，而不要讓目的物與主要雜質(zhì)分子帶相反電荷，以致出現(xiàn)較嚴(yán)重的共沉作用。質(zhì)分子帶相反電荷，以致出現(xiàn)較嚴(yán)重的共沉作用。（3）離子強(qiáng)度）離子強(qiáng)度 n較低離子強(qiáng)度的存在往往有利于沉淀作用，甚至還有保護(hù)較低離子強(qiáng)度的存在往往有利于沉淀作用，甚至還有保護(hù)蛋白質(zhì)，防止變性，減少水和溶劑相互溶解及穩(wěn)定介質(zhì)蛋白質(zhì)，防止變性，減少水和溶劑相互溶解及穩(wěn)定介質(zhì)pH的作用。的作用。n用溶劑沉淀蛋白質(zhì)時(shí)離子強(qiáng)度以用溶劑沉淀蛋白質(zhì)時(shí)離子強(qiáng)度以0.01-0.05mol/L為好，通為好，通常不應(yīng)超過常不應(yīng)超過5%的含量。的含量。n如離子強(qiáng)度過高則溶劑用量大，沉淀物還會(huì)夾帶許多的鹽。如離子強(qiáng)度過高

56、則溶劑用量大，沉淀物還會(huì)夾帶許多的鹽。（4）樣品濃度）樣品濃度n與鹽析相似，樣品較稀時(shí)增加了溶劑投入量和損耗，降低與鹽析相似，樣品較稀時(shí)增加了溶劑投入量和損耗，降低了溶質(zhì)收率，還易產(chǎn)生稀釋變性，但共沉作用小，分離效了溶質(zhì)收率，還易產(chǎn)生稀釋變性，但共沉作用小，分離效果較好。果較好。n反之，濃的樣品會(huì)增強(qiáng)共沉作用，降低分辨率，然而減少反之，濃的樣品會(huì)增強(qiáng)共沉作用，降低分辨率，然而減少了溶劑用量，提高了回收率，變性的危險(xiǎn)性也小于稀溶液。了溶劑用量，提高了回收率，變性的危險(xiǎn)性也小于稀溶液。一般認(rèn)為蛋白質(zhì)的初濃度以一般認(rèn)為蛋白質(zhì)的初濃度以0.5%2%為好，粘多糖則以為好，粘多糖則以1%2%較合適。較合適

57、。 （5）金屬離子助沉作用）金屬離子助沉作用n在用溶劑沉淀生物高分子時(shí)還須注意到一些金屬離在用溶劑沉淀生物高分子時(shí)還須注意到一些金屬離子如子如ZnZn2+2+，CaCa2+2+等可與某些呈陰離子狀態(tài)的蛋白質(zhì)等可與某些呈陰離子狀態(tài)的蛋白質(zhì)形成復(fù)合物。形成復(fù)合物。n這種復(fù)合物的溶解度大大降低而不影響生物活性，這種復(fù)合物的溶解度大大降低而不影響生物活性，有利于沉淀形成，并降低溶劑耗量，有利于沉淀形成，并降低溶劑耗量，0.005-0.005-0.02mol/L0.02mol/L的的ZnZn2+2+可使溶劑用量減少可使溶劑用量減少l/3l/3至至1/21/2，使，使用時(shí)要避免會(huì)與這些金屬離子形成難溶鹽的

58、陰離子用時(shí)要避免會(huì)與這些金屬離子形成難溶鹽的陰離子的存在的存在( (如磷酸根如磷酸根) )。實(shí)際操作時(shí)往往先加溶媒沉淀。實(shí)際操作時(shí)往往先加溶媒沉淀除去雜蛋白，再加除去雜蛋白，再加ZnZn2+2+沉淀目的物。沉淀目的物。n某些大分子聚合物，具有沉淀蛋白質(zhì)的作用。某些大分子聚合物，具有沉淀蛋白質(zhì)的作用。n非離子多聚物是非離子多聚物是20世紀(jì)世紀(jì)60年代發(fā)展起來的一類重年代發(fā)展起來的一類重要沉淀劑，最早應(yīng)用于提純免疫球蛋白要沉淀劑，最早應(yīng)用于提純免疫球蛋白(IgG)和沉和沉淀一些細(xì)菌與病毒，近年來逐漸廣泛應(yīng)用于核酸淀一些細(xì)菌與病毒，近年來逐漸廣泛應(yīng)用于核酸和酶的分離純化。和酶的分離純化。n所用非離子

59、多聚物包括所用非離子多聚物包括各種不同分子量各種不同分子量的：的：聚乙聚乙二醇二醇(PEG)、壬苯乙烯化氧、壬苯乙烯化氧(NPEO)、葡聚糖、右、葡聚糖、右旋糖苷硫酸酯。旋糖苷硫酸酯。4.5 非離子型聚合物非離子型聚合物聚乙二醇聚乙二醇n結(jié)構(gòu)式：結(jié)構(gòu)式：HO-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-OHnPEG相對(duì)分子質(zhì)量從相對(duì)分子質(zhì)量從200D到到20KDa的不同聚合程的不同聚合程度的產(chǎn)品都是有效的。度的產(chǎn)品都是有效的。n通常在蛋白質(zhì)沉淀中使用通常在蛋白質(zhì)沉淀中使用PEG-6000或或PEG-4000。使用使用PEG沉淀分離蛋白質(zhì)方法的優(yōu)點(diǎn)沉淀分離蛋白質(zhì)方法的優(yōu)點(diǎn) 沉淀溫度只需控制在室溫條

60、件下；沉淀溫度只需控制在室溫條件下； 沉淀的顆粒往往比較大，產(chǎn)物比較容易收集；沉淀的顆粒往往比較大，產(chǎn)物比較容易收集； PEG非但不會(huì)使蛋白質(zhì)變性，而且可以提高它的非但不會(huì)使蛋白質(zhì)變性，而且可以提高它的穩(wěn)定性。穩(wěn)定性。使用使用PEG沉淀分離蛋白質(zhì)方法的缺點(diǎn)沉淀分離蛋白質(zhì)方法的缺點(diǎn)1、PEG比其他沉淀劑更難從蛋白質(zhì)溶液中除去，為比其他沉淀劑更難從蛋白質(zhì)溶液中除去，為此需用超濾和液液萃取來解決。此需用超濾和液液萃取來解決。2、價(jià)格較昂貴。、價(jià)格較昂貴。n一是一是選用兩種水溶性非離子多聚物組成液選用兩種水溶性非離子多聚物組成液- -液兩相系統(tǒng)。液兩相系統(tǒng)。使使生物大分子或微粒在兩相系統(tǒng)中不等量分配，