DNA瓊脂糖凝膠電泳分析(課件分享)

1、DNA瓊脂糖凝膠電泳分析（課件分享）作者：作者：Dr.FengDr.FengDNA瓊脂糖凝膠電泳分析（課件分享）DNA瓊脂糖凝膠電泳分析（課件分享）2實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康?掌握瓊脂糖凝膠電泳檢測掌握瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的原理和方法。的原理和方法。DNA瓊脂糖凝膠電泳分析（課件分享）3實驗原理實驗原理DNA分子在瓊脂糖中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，但主分子在瓊脂糖中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，但主要為分子篩效應(yīng)。要為分子篩效應(yīng)。 在在 pH 值為值為 8.08.3 時，核酸分子堿基幾乎不解離，磷酸全時，核酸分子堿基幾乎不解離，磷酸全部解離，核酸分子帶負電，在電泳時向正極移動。部解離，核酸分子

2、帶負電，在電泳時向正極移動。 采用適當濃度的凝膠介質(zhì)作為電泳支持物，在分子篩的作用下，采用適當濃度的凝膠介質(zhì)作為電泳支持物，在分子篩的作用下，使使分子大小和構(gòu)象不同的核酸分子分子大小和構(gòu)象不同的核酸分子泳動率出現(xiàn)較大的差異，從泳動率出現(xiàn)較大的差異，從而達到分離核酸片段檢測其大小的目的。而達到分離核酸片段檢測其大小的目的。 核酸分子中嵌入熒光染料（如核酸分子中嵌入熒光染料（如 EB ）后，在紫外燈下可觀察）后，在紫外燈下可觀察到核酸片段所在的位置。到核酸片段所在的位置。DNA瓊脂糖凝膠電泳分析（課件分享）4實驗器材和試劑實驗器材和試劑 實驗器材：實驗器材：橋是平板電泳槽、電泳儀、微波爐、紫外透射

3、儀橋是平板電泳槽、電泳儀、微波爐、紫外透射儀 樣品：樣品： DNA分子量標準品，質(zhì)粒分子量標準品，質(zhì)粒 試劑試劑 瓊脂糖瓊脂糖 1電泳緩沖液（電泳緩沖液（TBE） 6上樣緩沖液上樣緩沖液溴化乙錠溴化乙錠(EB) ：10mg/mlDNA瓊脂糖凝膠電泳分析（課件分享）5上樣緩沖液0.25溴酚蘭；溴酚蘭；0.25二甲苯青；二甲苯青；30甘油水溶液甘油水溶液 作用：作用：增加樣品密度，使其比重增加，以確保增加樣品密度，使其比重增加，以確保DNA均勻沉入加均勻沉入加樣孔內(nèi)樣孔內(nèi)在電泳中形成肉眼可見的指在電泳中形成肉眼可見的指示帶，可預(yù)測核酸電泳的速度和位置示帶，可預(yù)測核酸電泳的速度和位置使樣品呈色，使加

4、樣操作更方便使樣品呈色，使加樣操作更方便DNA瓊脂糖凝膠電泳分析（課件分享）6 天然瓊脂（天然瓊脂（agar）:又名瓊膠、菜燕、凍粉又名瓊膠、菜燕、凍粉 從石花菜及其它紅藻類植物提取出來的一種線狀高聚物。從石花菜及其它紅藻類植物提取出來的一種線狀高聚物。瓊脂糖（瓊脂糖（agaroseagarose）瓊脂膠（瓊脂膠（agaropectinagaropectin）: :含硫酸根和羧基的強酸性多糖，在電場含硫酸根和羧基的強酸性多糖，在電場作用下能產(chǎn)生較強的電滲現(xiàn)象。作用下能產(chǎn)生較強的電滲現(xiàn)象。瓊脂瓊脂DNA瓊脂糖凝膠電泳分析（課件分享）7瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定和純化瓊

5、脂糖凝膠電泳是分離鑒定和純化DNA片段的標準方法。片段的標準方法。 該技術(shù)操作簡便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度離心該技術(shù)操作簡便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度離心法）所無法分離的法）所無法分離的DNA片段。片段。 當用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶當用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色染色,在紫外光下至少可以檢出在紫外光下至少可以檢出1-10ng的的DNA條帶條帶,從而可以確從而可以確定定DNA片段在凝膠中的位置。片段在凝膠中的位置。 此外此外,還可以從電泳后的凝膠中回收特定的還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶條帶,用于以后用于以后

6、的克隆操作。的克隆操作。DNA瓊脂糖凝膠電泳分析（課件分享）8電泳指示劑：電泳指示劑： 核酸電泳常用的指示劑有兩種核酸電泳常用的指示劑有兩種 溴酚藍（溴酚藍（ bromophenol blue, Bb ）；）； 二甲苯青（二甲苯青（ xylene cyanol, Xc ），它攜帶的電荷量），它攜帶的電荷量比溴酚藍少，在凝膠中的遷移率比溴酚藍慢比溴酚藍少，在凝膠中的遷移率比溴酚藍慢DNA瓊脂糖凝膠電泳分析（課件分享）9核酸電泳的染色劑 最常用的染色劑最常用的染色劑溴化乙錠（溴化乙錠（ethidium bromide，EB）是一種熒光染料，是一種熒光染料，EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，在紫分

7、子可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出桔紅色熒光外線激發(fā)下，發(fā)出桔紅色熒光可在凝膠電泳液中加入終濃度為可在凝膠電泳液中加入終濃度為0.5ug/ml的的EB，有時亦可在電，有時亦可在電泳后，將凝膠浸入該濃度的溶液中染色泳后，將凝膠浸入該濃度的溶液中染色1015min EB染料有許多優(yōu)點，如染料有許多優(yōu)點，如染色操作簡便、快速，靈敏度高，染色操作簡便、快速，靈敏度高，10ng或更少的或更少的DNA即可檢出即可檢出。（注意：（注意：EB被認為是一種強致癌物質(zhì)，操作時應(yīng)盡量小心，配置被認為是一種強致癌物質(zhì)，操作時應(yīng)盡量小心，配置和使用和使用EB時都應(yīng)帶上手套，且注意不要把時都應(yīng)帶上手套，且

8、注意不要把EB灑到桌面或地板灑到桌面或地板上。上。 ）銀染色銀染色DNA瓊脂糖凝膠電泳分析（課件分享）10影響瓊脂糖凝膠電泳的因素影響瓊脂糖凝膠電泳的因素DNA分子的大?。簩嶒炞C明，分子的大?。簩嶒炞C明，DNA片段遷移距片段遷移距離與其分子量的對數(shù)成反比；離與其分子量的對數(shù)成反比； 瓊脂糖的濃度：一定大小的瓊脂糖的濃度：一定大小的DNA片段在不同濃片段在不同濃度的瓊脂凝膠中，電泳遷移率不相同；度的瓊脂凝膠中，電泳遷移率不相同；DNA分子的構(gòu)型：不同構(gòu)型的分子的構(gòu)型：不同構(gòu)型的DNA在瓊脂糖凝在瓊脂糖凝膠中的電泳速度差別較大膠中的電泳速度差別較大DNA瓊脂糖凝膠電泳分析（課件分享）11(1) 操

9、作簡單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可進行電泳。操作簡單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可進行電泳。(2)瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)均勻，對樣品吸附極微，因此電泳圖譜清晰，瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)均勻，對樣品吸附極微，因此電泳圖譜清晰，分辨率高，重復(fù)性好。分辨率高，重復(fù)性好。(3)瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結(jié)果可直接用紫外監(jiān)測及瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結(jié)果可直接用紫外監(jiān)測及定量分析。定量分析。(4)電泳后區(qū)帶易染色，樣品易洗脫，便于定量測定。制成干膜可電泳后區(qū)帶易染色，樣品易洗脫，便于定量測定。制成干膜可長期保存。長期保存。DNA瓊脂糖凝膠電泳分析（課件分享）12DNA瓊脂糖凝膠電泳分析（課件分享）

10、13 銀染色銀染色銀染色液中的銀離子銀染色液中的銀離子(Ag+)可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物，然可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物，然后用還原劑如甲醛使后用還原劑如甲醛使Ag+還原成銀顆粒，可把核酸電泳帶還原成銀顆粒，可把核酸電泳帶染成黑褐色。染成黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色，也用于瓊脂糖凝膠染主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色，也用于瓊脂糖凝膠染色。色。靈敏度比靈敏度比EB高高200倍，但銀染色后，倍，但銀染色后，DNA不宜回收不宜回收DNA瓊脂糖凝膠電泳分析（課件分享）14實驗操作實驗操作 制備瓊脂凝膠 膠板的制備 加樣 電泳 紫外透射儀檢測DNA瓊脂糖凝膠電泳分析（課件分享）15操作步驟1. 準

11、備準備用蒸餾水將電泳用蒸餾水將電泳槽和梳子沖洗槽和梳子沖洗干凈，放在水干凈，放在水平桌面上，并平桌面上，并架好梳子架好梳子DNA瓊脂糖凝膠電泳分析（課件分享）162. 配制配制1%瓊脂糖凝膠及倒膠瓊脂糖凝膠及倒膠具體步驟：具體步驟： 三角瓶內(nèi)：三角瓶內(nèi)：0.6g瓊脂糖瓊脂糖 +60ml(0.5TBE) 煮膠溶解煮膠溶解 冷卻至冷卻至60(不燙手不燙手) 加加EB 倒板倒板 室溫下充分凝固室溫下充分凝固 垂直向上拔出梳子垂直向上拔出梳子 將膠板放入電泳槽將膠板放入電泳槽 向電泳槽中加入向電泳槽中加入0.5xTBE緩沖液至剛沒過凝膠表面緩沖液至剛沒過凝膠表面12nm。DNA瓊脂糖凝膠電泳分析（課件

12、分享）173. 加樣加樣 將將DNA樣品（樣品（5ul）與）與6 上樣上樣緩沖液（緩沖液（1ul） 混勻后，用微混勻后，用微量加樣槍小心加入樣品孔內(nèi)。量加樣槍小心加入樣品孔內(nèi)。注意加樣槍的槍頭不可插入注意加樣槍的槍頭不可插入過深，以免刺穿凝膠，導(dǎo)致過深，以免刺穿凝膠，導(dǎo)致樣品外溢。樣品外溢。 每加完一個樣品要更換槍頭，每加完一個樣品要更換槍頭，以防止以防止EB污染。污染。 DNA瓊脂糖凝膠電泳分析（課件分享）184. 電泳電泳 接通電源，一般紅色為正極，黑色為負極，切記接通電源，一般紅色為正極，黑色為負極，切記DNA樣品由樣品由負極往正極泳動（靠近加樣孔的一端為負），電壓為負極往正極泳動（靠近加樣孔的一端為負），電壓為5 V/cm（長度以兩個電極之間的距離計算）（長度以兩個電極之間的距離計算） 根據(jù)指示劑泳動的位置，判斷是否終止電泳根據(jù)指示劑泳動的位置，判斷是否終止電泳 當溴酚藍染料移動到距凝膠前沿當溴酚藍染料移動到距凝膠前沿12cm處，停止電泳處