鏈霉素誘變育種的方案

1、11 11級(jí)生物技術(shù)班級(jí)生物技術(shù)班第二組第二組插曲(很有必要) 所處理的細(xì)胞必須是處于對數(shù)生長期同步生長的細(xì)胞，所處理的細(xì)胞必須是處于對數(shù)生長期同步生長的細(xì)胞，并且是均勻狀態(tài)的單細(xì)胞懸液，將并且是均勻狀態(tài)的單細(xì)胞懸液，將121121滅菌滅菌的無菌水加入到培養(yǎng)有鏈霉菌斜面的試管中，的無菌水加入到培養(yǎng)有鏈霉菌斜面的試管中，用接種環(huán)輕輕刮下孢子，用接種環(huán)輕輕刮下孢子，( (所處理的細(xì)胞必須是處于對所處理的細(xì)胞必須是處于對數(shù)生長期同步生長的細(xì)胞，并且是均勻狀態(tài)的單細(xì)胞懸數(shù)生長期同步生長的細(xì)胞，并且是均勻狀態(tài)的單細(xì)胞懸液），將含有孢子的無菌水轉(zhuǎn)入三角瓶中，加入玻璃珠，液），將含有孢子的無菌水轉(zhuǎn)入三角瓶中

2、，加入玻璃珠，在搖床上打碎，經(jīng)濾膜過濾后即得到單孢子率在在搖床上打碎，經(jīng)濾膜過濾后即得到單孢子率在9898以以上的單孢子懸液。上的單孢子懸液。目的：在引起絕大多數(shù)細(xì)胞致死的同時(shí)，使存活個(gè)體中DNA的結(jié)構(gòu)變異頻率大幅度提高。 對誘變劑的敏感性高；對誘變劑的敏感性高； 具有特定生產(chǎn)性狀的能力或潛力；具有特定生產(chǎn)性狀的能力或潛力； 可采用劃線分離法和稀釋分離法進(jìn)行純化；可采用劃線分離法和稀釋分離法進(jìn)行純化； 該菌株變異幅度廣；該菌株變異幅度廣； 該菌株穩(wěn)定性較好該菌株穩(wěn)定性較好。 選擇物理誘變劑中非電離輻射即選擇物理誘變劑中非電離輻射即紫外線紫外線。 因?yàn)樽贤饩€是一種使用時(shí)間長、效果好、因?yàn)樽贤饩€是

3、一種使用時(shí)間長、效果好、設(shè)備簡單、值得推廣的誘變劑，大約有設(shè)備簡單、值得推廣的誘變劑，大約有80%80%的高產(chǎn)抗的高產(chǎn)抗生素產(chǎn)生菌都曾經(jīng)用過紫外線這一誘變方法。生素產(chǎn)生菌都曾經(jīng)用過紫外線這一誘變方法。 紫外線的誘變育種紫外線的誘變育種 紫外線的作用機(jī)制是使兩個(gè)嘧啶之間聚合，形成紫外線的作用機(jī)制是使兩個(gè)嘧啶之間聚合，形成嘧啶二聚體，堿基不能正常配對。嘧啶二聚體，堿基不能正常配對。 紫外線誘變一般采用紫外線誘變一般采用15W15W紫外線殺菌燈，紫外線殺菌燈，波長為波長為253.7nm253.7nm，燈與處理物的距離為，燈與處理物的距離為151530cm30cm，照射時(shí)間依菌種而異，一般，照射時(shí)間依

4、菌種而異，一般為幾秒至幾十分鐘。為幾秒至幾十分鐘。 在誘變育種中有兩條重要的實(shí)驗(yàn)曲線在誘變育種中有兩條重要的實(shí)驗(yàn)曲線: : 劑量劑量- -存活率曲線存活率曲線 劑量劑量- -誘變率曲線誘變率曲線 通過比較以上兩曲線，可找到劑量通過比較以上兩曲線，可找到劑量- -存活率存活率- -誘變誘變率三者的最佳結(jié)合點(diǎn)。在實(shí)際工作中，突變率往往隨劑率三者的最佳結(jié)合點(diǎn)。在實(shí)際工作中，突變率往往隨劑量的增加而提高，但到達(dá)一定程度后，再提高劑量反而量的增加而提高，但到達(dá)一定程度后，再提高劑量反而會(huì)使突變率降低。根據(jù)會(huì)使突變率降低。根據(jù)UVUV、X X射線和乙烯亞胺射線和乙烯亞胺等誘變效應(yīng)研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)正變較多地出

5、等誘變效應(yīng)研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)正變較多地出現(xiàn)在偏低的劑量中，而負(fù)變較多地出現(xiàn)在現(xiàn)在偏低的劑量中，而負(fù)變較多地出現(xiàn)在偏高的劑量中。因此，在誘變工作中，大偏高的劑量中。因此，在誘變工作中，大多傾向于采用較低劑量（致死率在多傾向于采用較低劑量（致死率在70-70-80%80%）。）。 1 1將細(xì)菌培養(yǎng)液以將細(xì)菌培養(yǎng)液以3000r3000rminmin離心離心5min5min，傾去上清液，傾去上清液，加入無菌生理鹽水洗滌再離心。加入無菌生理鹽水洗滌再離心。 2 2將菌懸液放入巳滅菌的裝有玻璃珠的三角瓶內(nèi)用手將菌懸液放入巳滅菌的裝有玻璃珠的三角瓶內(nèi)用手搖動(dòng)，以打散菌體。將菌液通過濾紙過濾，單細(xì)胞濾液搖動(dòng)，以打

6、散菌體。將菌液通過濾紙過濾，單細(xì)胞濾液裝入試管內(nèi)，使細(xì)胞數(shù)約為裝入試管內(nèi)，使細(xì)胞數(shù)約為108108個(gè)個(gè)mlml，作為待處理菌懸，作為待處理菌懸液。液。 3 3取取2 24ml4ml制備的菌液加到直徑制備的菌液加到直徑7cm7cm培養(yǎng)皿內(nèi)，放入培養(yǎng)皿內(nèi)，放入一無菌磁力攪拌子，然后置磁力攪拌器上、一無菌磁力攪拌子，然后置磁力攪拌器上、15W15W紫外線下紫外線下30cm30cm處。在正式照射前，應(yīng)先開處。在正式照射前，應(yīng)先開紫外燈預(yù)熱紫外燈預(yù)熱10min10min，然后開啟皿蓋正式在攪拌，然后開啟皿蓋正式在攪拌下照射下照射101050s50s。操作均應(yīng)在紅燈下進(jìn)行，或。操作均應(yīng)在紅燈下進(jìn)行，或用黑

7、紙包住，避免白熾光。用黑紙包住，避免白熾光。 4 4取未照射的制備菌液和照射菌液各取未照射的制備菌液和照射菌液各0.5ml0.5ml進(jìn)行稀進(jìn)行稀釋分離，計(jì)數(shù)活菌細(xì)胞數(shù)。釋分離，計(jì)數(shù)活菌細(xì)胞數(shù)。 5 5取照射菌液取照射菌液2ml2ml于液體培養(yǎng)基中于液體培養(yǎng)基中(300ml(300ml三角瓶三角瓶內(nèi)裝內(nèi)裝30ml30ml培養(yǎng)液培養(yǎng)液) )，120r120rminmin振蕩培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)4 46h6h。 6 6取中間培養(yǎng)液稀釋分離、培養(yǎng)。取中間培養(yǎng)液稀釋分離、培養(yǎng)。 7 7挑取菌落進(jìn)行篩選。挑取菌落進(jìn)行篩選。 （1 1）菌種遺傳特性）菌種遺傳特性 各菌株因遺傳特性不同，對誘變劑敏感性也不一各菌株因遺

8、傳特性不同，對誘變劑敏感性也不一 樣。樣。 （2 2）菌體細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)）菌體細(xì)胞壁結(jié)構(gòu) 絲狀菌孢子壁的厚度及表面的蠟質(zhì)會(huì)阻礙誘變劑滲絲狀菌孢子壁的厚度及表面的蠟質(zhì)會(huì)阻礙誘變劑滲 入細(xì)胞。入細(xì)胞。 （3 3）環(huán)境條件的影響）環(huán)境條件的影響 環(huán)境條件的影響包括：環(huán)境條件的影響包括： 誘變前預(yù)培養(yǎng)和誘變后培養(yǎng)誘變前預(yù)培養(yǎng)和誘變后培養(yǎng) 溫度、溫度、pHpH、氧氣等外界條件對誘變效應(yīng)的影響、氧氣等外界條件對誘變效應(yīng)的影響 由接種環(huán)以無菌操作沾取少許待分離的材料，由接種環(huán)以無菌操作沾取少許待分離的材料，在無菌平板表面進(jìn)行平行劃線、扇形劃線或其在無菌平板表面進(jìn)行平行劃線、扇形劃線或其他形式的連續(xù)劃線，使鏈霉菌

9、細(xì)胞數(shù)量將隨著他形式的連續(xù)劃線，使鏈霉菌細(xì)胞數(shù)量將隨著劃線次數(shù)的增加而減少，并逐步分散開來。如劃線次數(shù)的增加而減少，并逐步分散開來。如果劃線適宜的話，能將鏈霉菌細(xì)胞一一分散，果劃線適宜的話，能將鏈霉菌細(xì)胞一一分散，經(jīng)培養(yǎng)后，可在平板表面得到單菌落。并測定經(jīng)培養(yǎng)后，可在平板表面得到單菌落。并測定出其變異率（變異數(shù)與觀察總個(gè)體數(shù)的比值）。出其變異率（變異數(shù)與觀察總個(gè)體數(shù)的比值）。 挑出變異菌落并移植至斜面上。挑出變異菌落并移植至斜面上。 分離后得到的菌落，真正能發(fā)生性能變好的所謂正突分離后得到的菌落，真正能發(fā)生性能變好的所謂正突變個(gè)數(shù)極少，要從幾千萬個(gè)菌落中選出幾個(gè)好的，與變個(gè)數(shù)極少，要從幾千萬個(gè)

10、菌落中選出幾個(gè)好的，與自然選育中的篩選方法相同?？煞譃槌鹾Y（平板篩選、自然選育中的篩選方法相同?？煞譃槌鹾Y（平板篩選、搖瓶發(fā)酵篩選搖瓶發(fā)酵篩選) )和復(fù)篩。和復(fù)篩。 篩選的方法：隨機(jī)亂向篩選篩選的方法：隨機(jī)亂向篩選 定向篩選定向篩選 突變是隨機(jī)不定向的，但是篩選是定向的，培養(yǎng)基和突變是隨機(jī)不定向的，但是篩選是定向的，培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件是決定菌種某些特性保留或淘汰的培養(yǎng)條件是決定菌種某些特性保留或淘汰的“篩子篩子”。 初篩：初篩：以多為主，盡量擴(kuò)大篩選范圍。以多為主，盡量擴(kuò)大篩選范圍。 復(fù)篩：復(fù)篩：以質(zhì)和精為主，反復(fù)多次，結(jié)合自然分離，以質(zhì)和精為主，反復(fù)多次，結(jié)合自然分離，選育高產(chǎn)或其他優(yōu)良菌株。

11、選育高產(chǎn)或其他優(yōu)良菌株。 多級(jí)水平篩選：多級(jí)水平篩選：由于誘變產(chǎn)生高產(chǎn)突變株的頻率很由于誘變產(chǎn)生高產(chǎn)突變株的頻率很低，而且實(shí)、驗(yàn)誤差又很難避免，所以篩選工作中低，而且實(shí)、驗(yàn)誤差又很難避免，所以篩選工作中常用多級(jí)篩選，一利于優(yōu)良菌株的獲得常用多級(jí)篩選，一利于優(yōu)良菌株的獲得 平板菌落預(yù)篩平板菌落預(yù)篩 根據(jù)特定代謝產(chǎn)物的特異性，利用瓊脂平板進(jìn)行根據(jù)特定代謝產(chǎn)物的特異性，利用瓊脂平板進(jìn)行篩選和活性粗測的方法，大幅度擴(kuò)大有效篩選量，提篩選和活性粗測的方法，大幅度擴(kuò)大有效篩選量，提高篩選工作效率。高篩選工作效率。 搖瓶發(fā)酵篩選搖瓶發(fā)酵篩選 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：不管種子或發(fā)酵過程的生產(chǎn)條件、生理?xiàng)l不管種子或發(fā)酵過程

12、的生產(chǎn)條件、生理?xiàng)l件如何，都與發(fā)酵罐大生產(chǎn)條件相近，可以模擬進(jìn)行。件如何，都與發(fā)酵罐大生產(chǎn)條件相近，可以模擬進(jìn)行。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：在突變率小的情況下，如果菌落挑在突變率小的情況下，如果菌落挑取少，很難篩選到理想的突變株取少，很難篩選到理想的突變株 對初篩出來的菌株進(jìn)行復(fù)篩時(shí)，通常采用搖瓶培對初篩出來的菌株進(jìn)行復(fù)篩時(shí)，通常采用搖瓶培養(yǎng)法，一般一個(gè)菌株至少要重復(fù)養(yǎng)法，一般一個(gè)菌株至少要重復(fù)3535個(gè)瓶，培養(yǎng)后個(gè)瓶，培養(yǎng)后的發(fā)酵液必須采用精確分析方法測定。的發(fā)酵液必須采用精確分析方法測定。 復(fù)篩過程中，要結(jié)合各種培養(yǎng)條件進(jìn)復(fù)篩過程中，要結(jié)合各種培養(yǎng)條件進(jìn)行篩選，在不同培養(yǎng)條件下進(jìn)行試驗(yàn)。行篩選，在不同培

13、養(yǎng)條件下進(jìn)行試驗(yàn)。 1 1、步驟：、步驟：搖瓶培養(yǎng)通常分為初篩和復(fù)篩，初篩因菌搖瓶培養(yǎng)通常分為初篩和復(fù)篩，初篩因菌株多常常一株菌一瓶，進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后逐株多常常一株菌一瓶，進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后逐個(gè)進(jìn)行活性測定，將生產(chǎn)性能高的菌株用沙土管或冷個(gè)進(jìn)行活性測定，將生產(chǎn)性能高的菌株用沙土管或冷凍管保藏。復(fù)篩時(shí)取出，以一株凍管保藏。復(fù)篩時(shí)取出，以一株3-53-5瓶，振蕩培養(yǎng)后，瓶，振蕩培養(yǎng)后，測定活性，以提高精確性。測定活性，以提高精確性。 2 2、優(yōu)點(diǎn)：、優(yōu)點(diǎn)：培養(yǎng)條件與發(fā)酵罐接近，這樣篩選出來的培養(yǎng)條件與發(fā)酵罐接近，這樣篩選出來的菌容易在大生產(chǎn)中推廣。菌容易在大生產(chǎn)中推廣。3 3、注意事

14、項(xiàng)：、注意事項(xiàng)：搖瓶的條件要盡量與發(fā)搖瓶的條件要盡量與發(fā)酵罐接近。且各搖瓶間的培養(yǎng)條件要盡酵罐接近。且各搖瓶間的培養(yǎng)條件要盡量一致（搖瓶型號(hào)，裝量，瓶塞厚度或量一致（搖瓶型號(hào)，裝量，瓶塞厚度或瓶口包扎紗布的層數(shù)，搖床轉(zhuǎn)數(shù)，溫度）瓶口包扎紗布的層數(shù)，搖床轉(zhuǎn)數(shù)，溫度）培養(yǎng)基培養(yǎng)基脂肪酶脂肪酶產(chǎn)生菌產(chǎn)生菌透明圈法透明圈法成色圈法成色圈法果膠酶果膠酶產(chǎn)生菌產(chǎn)生菌培養(yǎng)基培養(yǎng)基生長圈法生長圈法抑菌圈法抑菌圈法嘌呤產(chǎn)生菌嘌呤產(chǎn)生菌青霉素青霉素產(chǎn)生菌產(chǎn)生菌一、根據(jù)平板菌落生化反應(yīng)篩一、根據(jù)平板菌落生化反應(yīng)篩選變株選變株2037二、采用冷敏感菌篩選抗生素變株二、采用冷敏感菌篩選抗生素變株加入抗生素加入抗生素不加

15、抗生素不加抗生素三、濃度梯度法篩選法三、濃度梯度法篩選法四、復(fù)印技術(shù)快速篩選變株四、復(fù)印技術(shù)快速篩選變株測定不同酵母菌胞內(nèi)脂肪含量的簡單定量法測定不同酵母菌胞內(nèi)脂肪含量的簡單定量法蘇丹黑染色1五、瓊脂大通量篩選變株五、瓊脂大通量篩選變株200搖瓶液體培養(yǎng)寥寥無幾產(chǎn)物活性鑒定培養(yǎng)基培養(yǎng)條件調(diào)整正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 1. 1.瓊脂平板活性圈法瓊脂平板活性圈法 2. 2.紙片法紙片法: :發(fā)酵液濃度高時(shí)發(fā)酵液濃度高時(shí) 3. 3.瓊脂薄層紙片法瓊脂薄層紙片法 4. 4.自動(dòng)生化儀器分析法自動(dòng)生化儀器分析法透明圈透明圈變色圈變色圈生長圈生長圈抑菌圈抑菌圈( (水解酶、水解酶、有機(jī)酸）有機(jī)酸） ( (產(chǎn)酸菌產(chǎn)酸菌

16、) )(工具菌+待檢菌)( (抗生菌抗生菌) ) 本組方案采用瓊脂平板活性圈法本組方案采用瓊脂平板活性圈法中的抑菌圈來測定其活性。中的抑菌圈來測定其活性。 與營養(yǎng)缺陷突變有關(guān)的三類遺傳型個(gè)體與營養(yǎng)缺陷突變有關(guān)的三類遺傳型個(gè)體 野生型菌株野生型菌株wild type strain wild type strain 原始菌株原始菌株 營養(yǎng)缺陷型營養(yǎng)缺陷型auxotroph auxotroph 人工誘變或自然突變?nèi)斯ふT變或自然突變 原養(yǎng)型菌株原養(yǎng)型菌株prototroph prototroph 回復(fù)突變或重組變異回復(fù)突變或重組變異 與篩選營養(yǎng)缺陷型有關(guān)三類培養(yǎng)基與篩選營養(yǎng)缺陷型有關(guān)三類培養(yǎng)基 (1)

17、(1)基本培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基MMMM (2)(2)完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基CMCM (3)(3)補(bǔ)充培養(yǎng)基補(bǔ)充培養(yǎng)基SMSM突變株的表型 檢出方法營養(yǎng)缺陷型 補(bǔ)充培養(yǎng)基（auxotroph） 抗性突變型 藥物培養(yǎng)基（resistant mutant）條件致死型 培養(yǎng)條件改變（conditional lethal mutant） 誘發(fā)突變誘發(fā)突變 淘汰野生型菌株淘汰野生型菌株 檢出缺陷性檢出缺陷性 鑒別缺陷性鑒別缺陷性 選擇合適的誘變劑與誘變方法選擇合適的誘變劑與誘變方法 誘變劑和誘變方法都要簡便有效誘變劑和誘變方法都要簡便有效 主要的誘變劑亞硝基胍主要的誘變劑亞硝基胍, ,紫外線紫外線, ,亞硝酸亞

18、硝酸 誘變方法誘變方法 物理方法物理方法 化學(xué)方法化學(xué)方法 注意突變率還與誘變劑量有關(guān)注意突變率還與誘變劑量有關(guān) 1.抗生素法 青霉素法（細(xì)菌） 作用于細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分肽聚糖 制霉菌法（酵母菌） 作用于真菌細(xì)胞膜上的甾醇 2.菌絲過濾法 適用于真菌和放線菌 作用于絲狀菌的孢子 3.高溫殺菌法 適用于芽孢菌類 作用于芽孢菌類的芽孢和營養(yǎng)體 夾 層 培 養(yǎng) 法夾 層 培 養(yǎng) 法 限量補(bǔ)充培養(yǎng)法限量補(bǔ)充培養(yǎng)法 影 印 接 種 法影 印 接 種 法 逐個(gè)檢出法逐個(gè)檢出法 需要注意兩點(diǎn) 第一 防止菌落擴(kuò)散和蔓延，在培養(yǎng)基中加入脫氧膽酸鈉 第二 為了克服孢子擴(kuò)散而帶來不純現(xiàn)象，在操作方法上改進(jìn)。 1 、鑒定方法 一種方法是加入一種物質(zhì)測定多株缺陷型菌株 一種方法是測定一種缺陷型菌株對許多生長因子的需求情況稱為生長譜法 2、營養(yǎng)缺陷型鑒定步驟 1測定缺陷性菌株所需生長因子的類別 2具體測缺陷該類別物質(zhì)中的哪種因子 3用單一因子進(jìn)行復(fù)證試驗(yàn) 營養(yǎng)缺陷型生