酶免疫測定技術

1、十一臨床免疫檢驗的自動化十一臨床免疫檢驗的自動化十二十二生物芯片技術（免疫測定的集成化和微型化） 類型 正向 反向 舉例？ 顆粒 舉例？ 明膠舉例？ 炭舉例？ 甲苯胺紅舉例？ 直接凝集反應直接凝集反應 玻片法：玻片法：ABO血型鑒定血型鑒定試管法：肥達試驗試管法：肥達試驗顆粒性抗原抗體（凝集素）正向間接凝集反應正向間接凝集反應如：類風濕因子的檢測如：類風濕因子的檢測可溶性抗原載體顆?？贵w（凝集素）反向間接凝集反應反向間接凝集反應抗體可溶性抗原載體顆粒 液相液相內沉淀反應液相內沉淀反應絮狀沉淀反應環(huán)狀沉淀反應如法醫(yī)學血跡鑒定+抗血清抗原抗原抗體凝膠內沉淀反應凝膠內沉淀反應免疫擴散技術免疫擴散技術

2、免疫電泳技術免疫電泳技術單向擴散試驗單向擴散試驗雙向擴散試驗雙向擴散試驗火箭電泳火箭電泳對流電泳對流電泳免疫電泳免疫電泳標記免疫技術： 將試劑抗原或試劑抗體用可以微量檢測的標記物（常用標記物：放射性核素、熒光物質、酶、化學發(fā)光劑、膠體金等）進行標記，試劑與標本中相應的抗體或抗原反應后，測定抗原抗體復合物中的標記物，這種免疫技術稱標記免疫技術 標記免疫技術的分類標記免疫技術的分類一、按測定用途分類：一、按測定用途分類：1、免疫組化技術2、免疫測定技術二、按標記物分類二、按標記物分類：1、酶免疫技術酶免疫技術2、熒光免疫技術、熒光免疫技術3、放射免疫技術、放射免疫技術4、發(fā)光免疫技術5、金免疫技術

3、主要的免疫標記物主要的免疫標記物類別類別 標記物標記物 用途用途熒光素熒光素 FITC、RB200、TRITC 免疫組化 鑭系元素螯合物 免疫分析測定放射性核素放射性核素 3H、14C、32P、57Gr 免疫分析測定 125I、131I酶酶 HRP、AP 免疫組化 免疫分析測定化學發(fā)光物 Luminol、lucigenin 免疫分析測定金屬顆粒 膠體金、鐵蛋白 免疫組化 免疫分析測定 放射免疫技術放射免疫技術酶免疫技術酶免疫技術發(fā)光免疫技術發(fā)光免疫技術三大經(jīng)典標記技術三大經(jīng)典標記技術 酶免疫試驗概述：1. 將試劑抗原或試劑抗體用酶進行標記，試劑與標本中相應的抗體或抗原反應后，測定復合物中的酶，

4、這種免疫技術，稱為酶標記免疫技術。 2.分類：酶免疫組化技術 酶免疫測定技術 均相法 異相法 固相酶免疫試驗 液相酶免疫試驗均相法：不需分離復合物與游離標記物即可直接測定的方法。異相法 需分離復合物與游離標記物后測定臨床上最常用的固相酶免疫試驗是ELISA和免疫印跡 ELISA的原理和類型一、基本要求：1. 使Ag(或Ab)結合到某種固相載體 （ ？）表面，并保持免疫活性。 免疫吸附劑2. 使Ag(或Ab)與某種酶結合，既保持免疫活性，又有酶的活性。 酶結合物3. 標本、酶標記物能按一定的次序與固相載體表面的Ag(或Ab)結合，加入酶的底物后能產(chǎn)生有色反應。 底物二、必備試劑：固相的Ag或Ab

5、-免疫吸附劑酶標記的Ab或Ag-結合物酶反應的底物-底物三、方法類型：夾心法（雙抗體或雙抗原）間接法 檢測抗體競爭法 測抗體或抗原捕獲法測IgM抗體3.競爭法 Ag AgAb + Ab Ag(標本) (定量) AgAb E E終止液標本酶標抗體底物顯色顯色固相固相標本酶標二抗底物 1.夾心法2.間接法4 4 捕獲包被法測抗體捕獲包被法測抗體 IgMIgM抗體抗體的檢測用于傳染病的早期診斷中。間接法ELISA一般僅適用于檢測總抗體或IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測定 IgM抗體，因標本中一般同時存在較高濃度的IgG抗體，后者將競爭結合固相抗原而使一部份IgM抗體不能結合到固相上。因此如 用

6、抗人IgM作為二抗，間接測定IgM抗體，必須先將標本用A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的干擾。在臨床檢驗中測定抗 體IgM時多采用捕獲包被法捕獲包被法。先用抗人先用抗人IgMIgM抗體包被固相，抗體包被固相，以捕獲血清標本中的以捕獲血清標本中的IgMIgM（其中包括針對抗原的特異性（其中包括針對抗原的特異性IgMIgM抗體和非抗體和非 特異性的特異性的IgMIgM）。然后加入抗原，此抗原）。然后加入抗原，此抗原僅與特異性僅與特異性IgMIgM相結合。繼而加酶標記針對抗原的特異相結合。繼而加酶標記針對抗原的特異性抗體。再與底物作用，呈色即與標性抗體。再與底物作用，呈色即與標 本中的本中的I

7、gMIgM成正相成正相關。關。此法常用于病毒性感染的早期診斷。 特點一：靈敏性特點一：靈敏性 該測定法的靈敏度來自作為報告集團的酶。該測定法的靈敏度來自作為報告集團的酶。眾所周知眾所周知, , 酶是一種有機催化劑，很少量的酶即酶是一種有機催化劑，很少量的酶即可誘導大量的催化反應可誘導大量的催化反應 ，產(chǎn)生可供觀察的顯色，產(chǎn)生可供觀察的顯色反應現(xiàn)象。因此該體系常被稱為酶放大體系。反應現(xiàn)象。因此該體系常被稱為酶放大體系。ELISAELISA實現(xiàn)了在細胞或亞細胞水平上示蹤抗原或實現(xiàn)了在細胞或亞細胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納克水平上對抗體的所在部位，或在微克、甚至納克水平上對其進

8、行定量。其進行定量。 例如，在測定血清中某一物質的含量時，化例如，在測定血清中某一物質的含量時，化學比色法的敏感度為學比色法的敏感度為mg/mlmg/ml水平，酶反應測定法水平，酶反應測定法的敏感度約為的敏感度約為510g/ml 510g/ml 。 特點二：特異性特點二：特異性 其特異性來自抗體或抗原的選擇性。其特異性來自抗體或抗原的選擇性?？乖贵w的結合實質上只發(fā)生在抗原的抗原抗體的結合實質上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結合位點之間?？乖瓫Q定簇與抗體的抗原結合位點之間。由于兩者在化學結構和空間構型上呈互由于兩者在化學結構和空間構型上呈互補關系，所以抗原抗體反應具有高度的補關系，所以抗

9、原抗體反應具有高度的特異性。特異性。 ELISA的技術要點一、試劑制備 免疫吸附劑 酶標記抗原或抗體二、反應條件的選擇 酶標二抗?jié)舛冗x擇 包被抗原濃度的選擇三、操作標準化一、試劑制備： 免疫吸附劑固相載體 要求： 吸附力強 能保持Ag或Ab活性 不參與化學反應 孔間性能一致或十分接近 載體性能檢查 載體材料：+、- 結果差別大1. ELISA板：10ug/L IgG包被,加酶標抗IgG，顯色后，測20孔的OD，要求CV5%): 校準加樣器，或更換加樣器 2.洗滌不均勻或留有氣泡: 洗滌時應將氣泡用洗耳球吹去 3.試劑未混勻: 混勻 4.酶標儀質量問題或預熱不夠: 選用高質量的儀器,預熱充分,按

10、儀器操作 手冊操作. 5.試劑盒未平衡至室溫:(平衡至室溫) 6.溫育溫度不平衡: 溫育溫度平衡,嚴格按 標準化操作條件進行. 陰性對照顯色過深: 1.試劑污染 ; 更換試劑 2.洗滌不充分: 延長洗滌時間,增加洗滌次數(shù) 3.對照交叉污染: 重復進行試驗p免疫功能檢查免疫功能檢查p自身免疫檢測自身免疫檢測p感染免疫檢測感染免疫檢測p腫瘤標志物檢測腫瘤標志物檢測(tumor marker)p器官與骨髓移植的檢測器官與骨髓移植的檢測 p病毒肝炎血清標志物病毒肝炎血清標志物p其它其它如如生殖生殖免疫檢測免疫檢測 等等 1.抗原抗體反應的影響因素（抗原抗體反應的影響因素（3點）點） 2.ELISA基本方法類型基本方法類型 3.臨床免疫檢驗技術常用的標記物有哪幾類臨床免疫檢驗技術常用的標記物有哪幾類