醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)本科畢業(yè)論文設(shè)計(jì)范例-供參考

1、畢業(yè)論文題 目：乙肝表面抗原的ELlSA法定量分析方法學(xué)驗(yàn)證姓 名：學(xué) 號(hào)：系 別：年 級(jí)：專 業(yè)：指導(dǎo)教師：-O年十二月目錄中文文獻(xiàn)英文摘要前言O(shè)1. 材料與方法O1.1試劑盒1.2儀器1.3方法1.3.2 .鋪板方案13.3 .加樣步驟2. 結(jié)果2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性圍2.2準(zhǔn)確度（回收率）的驗(yàn)證22.3精密度的驗(yàn)證2.3.1板精密度的驗(yàn)證2.3.2板間精密度的9気正2.4檢測(cè)限（LoD）計(jì)算53. 討論53.1乙B面抗原定劣析的意義53.2常用定量分析方;去63.3方法概述63.4方法學(xué)i正容63.5結(jié)果分析及應(yīng)用評(píng)價(jià)7參考文獻(xiàn)7乙肝表面抗原的EUSA法定量分析方法學(xué)驗(yàn)證摘要目的：對(duì)藍(lán)圖生

2、物工程生產(chǎn)的HBSAg的ELISA法定量分析試劑盒迸行方法學(xué)驗(yàn) 證,以判斷是否能用于臨床樣本分析。方法：ELISA法定量分析，應(yīng)用試劑盒 HBSAg標(biāo)準(zhǔn)品從濃度為8ngml做2倍稀釋的6個(gè)濃度梯度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，以6 , 3 ,1.5ngml 3個(gè)濃度梯度5復(fù)孔做準(zhǔn)確度,精密度和檢測(cè)限等方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié) 果:標(biāo)準(zhǔn)曲線 R2=0.997 ,準(zhǔn)確度 97.07% , 1.5ngml 的 RSD 為 16.78% f 不 滿足ng/ml級(jí)水平的RSD 般應(yīng)15%的要求,檢測(cè)限LOD為0.172ngml , 低濃度樣品（L5ngml）的檢測(cè)在準(zhǔn)確性和精密度方面都低于高濃度樣品，不 適合低濃度樣品的檢測(cè)。結(jié)論

3、:該HBSAg的ELISA法定量分析試劑盒不能用于 臨床標(biāo)本的分析。關(guān)鍵詞乙肝表面抗原ELlSA 定量分析 方法學(xué)驗(yàn)證The reification Of the HBSAg ELISA quantitative methodologyAbStraetObject: to Verify the quantitative methodology Of FUZhOU blueprint biological engineering COmPany to make SUre Whether it Ca be USed to the analysis Of CliniCal Sample. Metho

4、ds: ELISA quantitative methodology , make an APPIiCatiOn Of the Standard HBSAg kit from theCOnCentratiOn Of 8 ng/ml do 2 times diluted SiX COnCentratiOn gradient to ConStitUte a Standard CUrVez testing With 6z 3l 1.5 ng/ml 3 a ConCentratiOn gradient 5 accurately PreCiSe and detection .Results: Stand

5、ard CUrVerR2=0.997, the accuracy Of RSD Of 1.5ngm is 16.78% , the RSD that CannOt meet the demand Of ng/ml basic IeVel is IeSS than 15% in COmmOrL The LOD is 0.172ngmlf the testing Of LOW COnCentration SamPleS ( 1.5ngml )are IOWerthan high COnCentratiOn SamPleS in both accuracy and PreCiSiOn Z WhiCh

6、 as a result make it UnSUitable for IOW COnCentratiOn SamPle testing COnCIUSion: the ELISA quantitative analysis kit Of HBSAg CannOt be USed for the analysis Of CliniCal SamPle.Key WOrdSHBSAg QUantitatiVe analysis VenfiCatiOnMethOdOlogy.乙肝病毒感染是我國(guó)最常見(jiàn)的感染性疾病之一,而乙型肝炎血清標(biāo)志物是檢 測(cè)乙肝病毒感染最主要的病原標(biāo)志。隨看免疫學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,

7、抗原抗體檢測(cè) 靈敏度明顯提高,使低水平乙肝病毒得以檢岀,對(duì)臨床診斷及流行病學(xué)有重要意 義。ELISA法具有較高靈敏度、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、可進(jìn)行定量和半定量測(cè) 定等優(yōu)點(diǎn)可以在酶免疫分析儀上做批量檢測(cè)。目前I缶床上多傾向于做定量分析, 若想知道檢驗(yàn)結(jié)果是否可靠,實(shí)驗(yàn)室則必須對(duì)所用試劑盒進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證,本實(shí) 驗(yàn)對(duì)藍(lán)圖生物工程生產(chǎn)的HBSAg的ELISA法定量分析試劑盒進(jìn)行準(zhǔn)確度,精密度 和檢測(cè)限等方法學(xué)驗(yàn)證，現(xiàn)報(bào)告如下。1.材料與方法1.1試劑盒乙肝表面抗原ELISA法定量分析試劑盒，藍(lán)圖生物工程出品。12儀器酶標(biāo)儀：BiO-Rad 680 ;洗板機(jī)：BiO-Rad 1575 ;超純水系統(tǒng)：MiI

8、IiPOre EliX ；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9052)精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備;振蕩器(管械，KJ-201A ); 移液器；TiP頭；EP管。13方法13.1.溶液配置1PBS 緩沖液的配置：稱取 8g NaClS 0.2g KCL 1.44g Na2HPO4和 0.24g KH2PO4 ,溶于80OmI蒸館水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的PH值至7.4 ,最后 加蒸催水定容至IL即可。標(biāo)準(zhǔn)品的配置：原始標(biāo)準(zhǔn)品濃度為8 ngmloo取6個(gè)2mlEP管，分別標(biāo)記為Sl-S6o 50ulwell,共1孑IJ需50ul ,每JL配置60ul備用，按照下表稀釋方案 進(jìn)行稀釋。編號(hào)終濃度(n g/ml)預(yù)加1PBS取

9、剩余(Ul)(UI)SI80標(biāo)準(zhǔn)品120S2460SI6060S3260S26060S4160S36060S50.560S46060S60.2560S56060質(zhì)控品的配置:50ulwell,共5復(fù)孑IJ需250ul ,配置300ul備用，取3個(gè)2mlEP管，分別標(biāo)記為Cl , C2 , C3 z按照下表稀釋方案進(jìn)行稀釋。編號(hào)終濃度(ng/ml)預(yù)加1PBS取剩余(UI)(Ul)CI6150標(biāo)準(zhǔn)品450C23300CI300300C31.5300C230030013.2 鋪板方案取出試劑盒中已包被酶標(biāo)板,取出板條,按照下表鋪板方案進(jìn) 行鋪板在相應(yīng)孑沖依次加入系列標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品及空白對(duì)照,每孔5

10、0ulo空白對(duì)照加入IXPBS緩沖液。12345ASICIC2C3PBSBS2CIC2C3PBSCS3CIC2C3DS4CIC2PBSES5CIC3PBSFS6C2C3PBS13.3加樣步驟加入酶標(biāo)抗體Z 50 ul/well ,熹蕩。37。C電熱恒溫培養(yǎng)箱溫育60min , 取出后洗板4次，加入A、B液,50 ul WeIl , 37。C電熱恒溫培養(yǎng)箱遍育15 mino加入終止液，50 ul WeIlO酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀Z蓋上蓋子Z在電腦上 打開(kāi)MiCrOPlate Manager 5.2軟件 選擇45Onm波長(zhǎng)（參照波長(zhǎng)63Onm ）, 設(shè)置LAYOUT和報(bào)告模式，測(cè)定各孔吸收值。2.結(jié)果2

11、.1標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性圍標(biāo)準(zhǔn)品理論濃度對(duì)應(yīng)的實(shí)測(cè)OD值HBSAg(ngml)84210.50.25OD1.661.000.620.390.310.27以HBSAg理論濃度為橫坐標(biāo),所測(cè)OD值為縱坐標(biāo)作圖,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線觀察線性關(guān)系，結(jié)果顯示R2=0.9973 ,顯示具有良好的相關(guān)性Qooueq-osq2.2準(zhǔn)確度(回收率)的驗(yàn)證質(zhì)控品理論稀釋濃度對(duì)應(yīng)實(shí)測(cè)濃度值HBSAg(ng/ml)測(cè)定值1234566.244.565.736.096.4033.363.293.553.283.481.51.241.271.171.171.20質(zhì)控品做了 3個(gè)濃度梯度,每個(gè)濃度做了 5個(gè)復(fù)孔，下表是對(duì)每個(gè)濃度梯 度進(jìn)

12、行準(zhǔn)確度(回收率)的驗(yàn)證。HBSAg測(cè)定值(ng/ml)回收率(%)平均回收率3個(gè)濃度的(ngml)RR (%)平均回收率66.24103.9397.5897.07%4.5675.925.7395.576.09101.456.40106.6033.36112.13113.073.29109.573.55118.403.28109.403.48115.831.51.2482.4780.561.2784.671.1778.071.1777.671.2079.93結(jié)果顯示HBSAg 6ngml和3ngml的平均回收率為97.58% M3.07% , 滿足限度要求在85%-115%的圍,而HBSAg

13、1.5ngml的平均回收率為 80.56% Z滿足方法定量限在80%-120%的虱3個(gè)濃度梯度的平均回收率為 97.7% Z顯示準(zhǔn)確性好。2.3精密度的驗(yàn)證2.3.1板精密度的驗(yàn)證HBSAg(ng/ml)測(cè)定值X sRSD(%)1234564.55.800.7412.76.2465.736.096.4033.233.3693.553.283.483.390.123.501.21.51.2471.171.171.201.210.043.69上表中RSD(%)這一參數(shù)表示相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 也就是變異系數(shù)CV值,HBsAg 6ngml的5個(gè)復(fù)孔的變異系數(shù)CV值為12.73% ,顯示孔間差異較大Z精密度

14、不高，但是也符合ng/ml級(jí)RSD水平的一般應(yīng)15%的要求，其中有一孔濃度 為4.55 ,與其它孔比較差異較大,可能是由于操作引起例如加樣不準(zhǔn)。而3ngml, 和1.5ngml的變異系數(shù)CV為3.5% 3-7%符合顯示孔間重復(fù)性好 符合ng/ml 級(jí)RSD水平的一般應(yīng)15%的要求,精密度高。2.3.2板間精密度的驗(yàn)證從同一實(shí)驗(yàn)室中獲取2組同樣的數(shù)據(jù)J做板間精密度的驗(yàn)證。首先對(duì)同一實(shí)驗(yàn)條件下不同實(shí)驗(yàn)人員所獲得的數(shù)據(jù)是否可用于板間分析做驗(yàn)證。HBSAg(ng/ml84210.50.25)第二組OD值1.981.420.860.580.400.31第二組OD值1.310.770.360.170.09

15、0.03以HBSAg理論濃度為橫坐標(biāo)I所測(cè)OD值為縱坐標(biāo)作圖Z繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線觀 察線性關(guān)系。COnC(ngml)以上標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果顯示第二組數(shù)據(jù)的R2二0.967 ,第三組數(shù)據(jù)R2 =0.991o 第二組數(shù)據(jù)由于有一些孑L標(biāo)準(zhǔn)曲線偏離較大,但考慮到隨機(jī)抽樣與均數(shù)存在一 定誤差Z還是可以用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。下表對(duì)3組數(shù)據(jù)做板間分析。HBSA9(ngmD測(cè)定值XSRSD(%)123456.234.555.736.086.3966.105.786.086.646.845.995.396.346.495.966.040.559.103.363.283.553.283.4733.362.933.533.072.

16、993.060.3712.062.592.712.812.492.521.241.271.171.161.191.51.461.51.731.711.761.340.2316.781.191.241.251.211.11從表中3個(gè)組的數(shù)據(jù)比較可知Z HBSAg 6ngml和3ngml的RSD分別為9.10% z 12.06% ,滿足對(duì)ng/ml級(jí)水平的RSD 般應(yīng)15%的要求，精密度高。而HBSAg 1.5ngml的RSD為16.78% ,不滿足ng/ml級(jí)水平的RSD 般應(yīng)V15%的要求，顯示低濃度的孔間重復(fù)性差，精密度不是很高，故以下對(duì)HBSAg理論濃度為1.5ngml的三組數(shù)據(jù)做分析。對(duì)

17、HBSAg理論濃度為1.5ngml的準(zhǔn)確性,精密度分析HBSAg(ng/ml)測(cè)定值(ng/ml)回收率(%)平均回收率RR (%)SD%CV%第一組數(shù)據(jù)1.5 ng/ml1.2482.4780.562.983.701.2784.671.1778.071.1777.671.2079.93第二組數(shù)據(jù)1.5 ng/ml1.4697.60109.19.498.701.50100.001.73115.601.72114.531.77117.67第二組數(shù)據(jù)1.5 ng/ml1.1979.4780.273.804.741.2583.131.2583.531.2281.071.1174.13從上表可知第一組

18、數(shù)據(jù)和第三組數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性差，精密度高。而第二組數(shù)據(jù)準(zhǔn) 確性高,而精密度相對(duì)于第一組和第三組數(shù)據(jù)要好。綜上對(duì)于HBSAg理論濃度 為1.5ngml的這T氐濃度梯度的板準(zhǔn)確性和板間精密度相對(duì)于高濃度的線性要 差一些。2.4檢測(cè)限（LOD ）計(jì)算LOD為取空白孔的OD值的均數(shù)加2倍標(biāo)準(zhǔn)差。12345MeanSDLOD空白孔OD值0.150.150.10.160.10.160.00620.178362722由上表可知，LOD為0.172o檢測(cè)限（LOD ）表示分析方法檢測(cè)低濃度樣品的能力，也稱為方法的靈敏度,LOD通常為標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點(diǎn)，要求標(biāo)準(zhǔn) 曲線上的最低濃度點(diǎn)應(yīng)L0D ,此標(biāo)準(zhǔn)曲線上最低濃度

19、點(diǎn)為0.25 ,大于LOD (0.172 ),故此標(biāo)準(zhǔn)曲線線性好。3.討論3.1乙肝表面抗原定量分析的意義乙肝表面抗原是乙肝兩對(duì)半的其中一項(xiàng)，乙肝兩對(duì)半定性檢測(cè)對(duì)乙肝疾病 的診斷，病情監(jiān)測(cè)Z療效觀察起到了一定的作用。但隨看臨床醫(yī)學(xué)的發(fā)展, 乙肝兩對(duì)半定性檢測(cè)已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床及患者的要求,特別是在療效 觀察以及乙肝疫苗注射后抗體產(chǎn)生情況的觀察上有明顯的不足。隨看檢驗(yàn) 醫(yī)學(xué)的發(fā)展，乙肝兩對(duì)半定量測(cè)定成為可行,大大彌補(bǔ)了乙肝兩對(duì)半定性 檢測(cè)的不足。而且乙肝兩對(duì)半定量檢測(cè)可與HBV DNA熒光測(cè)定相互補(bǔ)充, 綜合評(píng)價(jià)患者病情與藥物療效,為低含量的慢性乙肝、病毒攜帶者提供了正確 判斷病情的依據(jù)O這在

20、目前的臨床治療中應(yīng)用十分廣泛。3 2常用定量分析方法此次實(shí)驗(yàn)只是對(duì)一種試劑盒的可用性進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，而目前常用的定量 方法已有很多，如TRFIA , TRFlA法又稱解離增強(qiáng)瀾系熒光免疫分析,是近十年 發(fā)展起來(lái)的一種微量分析方法。此技術(shù)集酶標(biāo)記、同位素標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)于一身, 具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好,且測(cè)定圍更寬，試劑盒貨架壽命長(zhǎng),操作 簡(jiǎn)便和非放射性等特點(diǎn)，成為最有潛力的一種標(biāo)記免疫分析方法2】O全自動(dòng)酶 免分析儀目前也廣泛應(yīng)有,自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化的操作手段使實(shí)驗(yàn)達(dá)到了全過(guò)程控制 和全過(guò)程標(biāo)準(zhǔn)化分析，大大提高了實(shí)驗(yàn)的精密度Z使檢測(cè)結(jié)果更趨穩(wěn)定Z從 而保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。3.3方法概述

21、目前普遍使用的HBSAg試劑盡管在制備時(shí)采用了高親和力的單克隆抗體,并 且使包被抗體、酶標(biāo)抗體的結(jié)合位點(diǎn)盡可能的遠(yuǎn)。以避免競(jìng)爭(zhēng)抑制,最大程度地 解決鉤狀效應(yīng)(HOOK )的問(wèn)題。本次實(shí)驗(yàn)是對(duì)實(shí)驗(yàn)室的一種試劑盒，即 藍(lán)圖生物工程生產(chǎn)的HBSAg的ELlSA法定量分析試劑盒進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證Z以判斷 是否能用于臨床樣本分析。試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。往 預(yù)先包被HBSAg捕獲抗體的包被微孔中,依次加入標(biāo)本,標(biāo)準(zhǔn)品,HRP標(biāo)記的 檢測(cè)抗體Z經(jīng)過(guò)溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色,TMB在過(guò)氧化物的催化下 轉(zhuǎn)化為藍(lán)色，并在酸的作用下最終轉(zhuǎn)化為黃色。顏色的深淺和樣品中得HBSaAg 呈正相關(guān)

22、。用酶標(biāo)儀在45Onm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度OD值，計(jì)算樣品濃度。應(yīng)用試劑盒HBSAg標(biāo)準(zhǔn)品從濃度為8,4,2 f 1, 0.5 , 0.25ngml 6個(gè)濃度梯度 做標(biāo)準(zhǔn)曲線，以6,3 , 1.5ngml 3個(gè)濃度梯度5復(fù)孔做質(zhì)控,進(jìn)行準(zhǔn)確度，精密 度和檢測(cè)限等方法學(xué)驗(yàn)證。選擇最低濃度為0.25ngml的原因是因?yàn)椋^大多數(shù) HBV感染者外周血中可出現(xiàn)HBSAg Z含量在5ngml 600ugml之間，高者可 達(dá)200OUg / ml以上,滿足了現(xiàn)階段文獻(xiàn)報(bào)道的最低濃度值。3.4方法學(xué)驗(yàn)證容方法學(xué)驗(yàn)證容一般包括標(biāo)準(zhǔn)曲線，準(zhǔn)確度，精密度和檢測(cè)限。標(biāo)準(zhǔn)曲線亦稱 校正曲線，系指生物樣品中所測(cè)定的樣品濃度

23、與響應(yīng)的相關(guān)性，通常用回歸分析 方法所得的回歸方程來(lái)評(píng)件，此實(shí)驗(yàn)所用了6個(gè)濃度點(diǎn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。方法準(zhǔn)確 度指待測(cè)濃度與真實(shí)濃度的接近值了，一般用相對(duì)回收率表示，限度要求在85% -115%的虱 精密度則表示分析方法的可重復(fù)性，是對(duì)同一樣品每次測(cè)定結(jié)果 的一致性Z用標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,可做板和板間的驗(yàn)證，對(duì)于ug/ml 級(jí)水平的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差一般應(yīng)V10%, ng/ml級(jí)水平的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差一般應(yīng) 15%o檢測(cè)限則表示分析低濃度樣品的能力,通常又稱為靈敏度。3.5結(jié)果分析及應(yīng)用評(píng)價(jià)第一組數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線R2二0.9973 ,顯示具有良好的相關(guān)性，HBSAg濃度 為6ngml和3ngml的回收率分別為為97.58% ,符合113.07% ,符合限度 要求在85%115%的圍。但是HBSAg濃度為.5ngml的回收率為80.56%, 顯示此試劑盒對(duì)于低濃度樣品的檢測(cè)準(zhǔn)確度差。在精密度方面，6,3 ,l-5ngml 變異系數(shù)CV分別為12.73% , 3.69% , 3.50% ,而HBSAg 6ngml的5個(gè)復(fù) 孔的變異系數(shù)CV值為12.73% ,顯示孔間差異較大,精密度不高，但是也符合 ng/ml級(jí)RSD水平的一般應(yīng)15%的要求，其中有一孔濃度為4.55 ,與其它孔 鼎交差異較大，可能是由于操作引起例如加樣不準(zhǔn)不屬于試劑盒的問(wèn)題，故可以 認(rèn)為此試劑盒對(duì)