分子生物學(xué)總結(jié)

1、分子生物學(xué)第一章緒論分子生物學(xué)研究?jī)?nèi)容有哪些方面？1、結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)；2、基因表達(dá)的調(diào)節(jié)與控制；3、DNA重組技術(shù)及其應(yīng)用；4、結(jié)構(gòu)基因組學(xué)、功能基因組學(xué)、生物信息學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)第二章DNAandChromosome1、DNA的變性：在某些理化因素作用下，DNA雙鏈解開(kāi)成兩條單鏈的過(guò)程。2、DNA復(fù)性：變性DNA在適當(dāng)條件下，分開(kāi)的兩條單鏈分子按照堿基互補(bǔ)原則重新恢復(fù)天然的雙螺旋構(gòu)象的現(xiàn)象。3、Tm（熔鏈溫度）：DNA加熱變性時(shí)，紫外吸收達(dá)到最大值的一半時(shí)的溫度，即DNA分子內(nèi)50%的雙鏈結(jié)構(gòu)被解開(kāi)成單鏈分子時(shí)的溫度）4、退火：熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，稱(chēng)為退火5、假基因：基因組中存

2、在的一段與正?；蚍浅Ｏ嗨频荒鼙磉_(dá)的DNA序列。以里來(lái)表示。6、C值矛盾或C值悖論:C值的大小與生物的復(fù)雜度和進(jìn)化的地位并不一致，稱(chēng)為C值矛盾或C值悖論（C-ValueParadox）7、轉(zhuǎn)座：可移動(dòng)因子介導(dǎo)的遺傳物質(zhì)的重排現(xiàn)象。8、轉(zhuǎn)座子：染色體、質(zhì)?；蚴删w上可以轉(zhuǎn)移位置的遺傳成分9、DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)：1）DNA分子是由兩條相互平行的脫氧核甘酸長(zhǎng)鏈盤(pán)繞而成；2）DNA分子中的脫氧核甘酸和磷酸交替連接，排在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架，堿基排列在外側(cè)；3）DNA分子表面有大溝和小溝；4）兩條鏈間存在堿基互補(bǔ)，通過(guò)氫鍵連系，且A=T、G三C堿基互補(bǔ)原則）；5）螺旋的螺距為3.4nm,直徑為2nm,

3、相鄰兩個(gè)堿基對(duì)之間的垂直距離為0.34nm,每圈螺旋包含10個(gè)堿基對(duì)；6）堿基平面與螺旋縱軸接近垂直，糖環(huán)平面接近平行10、真核生物基因組結(jié)構(gòu)：編碼蛋白質(zhì)或RNA的編碼序列和非編碼序列，包括編碼區(qū)兩側(cè)的調(diào)控序列和編碼序列間的間隔序列。特點(diǎn)：1）真核基因組結(jié)構(gòu)龐大哺乳類(lèi)生物大于2X109bp；2）單順?lè)醋樱▎雾樂(lè)醋樱阂粋€(gè)基因單獨(dú)轉(zhuǎn)錄，一個(gè)基因一條mRNA,翻譯成一條多肽鏈；）3）基因不連續(xù)性斷裂基因（interruptedgene）、內(nèi)含子（intron）、外顯子（exon）；4）非編碼區(qū)較多，多于編碼序列（9:1）5）含有大量重復(fù)序列11、Histon（組蛋白）特點(diǎn)：極端保守性、無(wú)組織特異性、

4、氨基酸分布的不對(duì)稱(chēng)性、可修飾作用、富含Lys的H512、核小體組成：由組蛋白和200bpDNA組成13、轉(zhuǎn)座的機(jī)制：轉(zhuǎn)座時(shí)發(fā)生的插入作用有一個(gè)普遍的特征，那就是受體分子中有一段很短的被稱(chēng)為靶序列的DNA會(huì)被復(fù)制，使插入的轉(zhuǎn)座子位于兩個(gè)重復(fù)的靶序列之間。復(fù)制型轉(zhuǎn)座：整個(gè)轉(zhuǎn)座子被復(fù)制，所移動(dòng)和轉(zhuǎn)位的僅為原轉(zhuǎn)座子的拷貝。非復(fù)制型轉(zhuǎn)座：原始轉(zhuǎn)座子作為一個(gè)可移動(dòng)的實(shí)體直接被移位。第三章DNAReplicationandrepair1、半保留復(fù)制：DNA生物合成時(shí)，母鏈DNA解開(kāi)為兩股單鏈，各自作為模板（template）按堿基配對(duì)規(guī)律，合成與模板互補(bǔ)的子鏈。子代細(xì)胞的DNA,一股單鏈從親代完整地接受過(guò)來(lái)

5、，另一股單鏈則完全從新合成。兩個(gè)子細(xì)胞的DNA都和親代DNA堿基序列一致。這種復(fù)制方式稱(chēng)為半保留復(fù)制。2、復(fù)制子：生物體內(nèi)能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的單位3、前導(dǎo)鏈：以復(fù)制叉移動(dòng)的方向?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)，一條模板鏈的走向是3'-5',子代鏈復(fù)制時(shí)以5'一3'方向連續(xù)合成，這一條鏈稱(chēng)為前導(dǎo)鏈4、滯后鏈：另一條模板鏈的走向是5'-3',子代鏈通過(guò)不連續(xù)的5,-3/聚合而成，稱(chēng)為滯后鏈(laggingstrand)5、岡崎片段：滯后鏈的合成是一段一段的。DNA復(fù)制時(shí)，由滯后鏈所形成的子代DNA短鏈稱(chēng)為岡崎片段6、端粒:是真核生物線性染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)，含物種特異性(spec

6、ies-spec幣。的DNA重復(fù)序列°7、逆轉(zhuǎn)錄：以RNA為模板，按照RNA中的核甘酸順序合成DNA的過(guò)程，稱(chēng)為反轉(zhuǎn)錄(reversetranscription,RT)。該過(guò)程由逆轉(zhuǎn)錄酶催化進(jìn)行，亦稱(chēng)反轉(zhuǎn)錄8、DNA復(fù)制的主要特征：半保留復(fù)制、雙向復(fù)制、半不連續(xù)復(fù)制、保真性9、DNA復(fù)制的幾種方式：環(huán)狀DMAr單巨病毒)(unidirectional):'如凝春(adenovirus)雙向3diD：產(chǎn)"。EM艮形),翁隹始點(diǎn)值接生枷如T7嚼體(T7phage)6形:如E.coli雙向(bidirectional)滾禊(rollingcircle):Jffl<l

7、>x174單向(unidgcti口nal)DH®(D-loop):如動(dòng)物線粒體DN4Mostly,雙向等速！10、DNApolymerases(DNA聚合酶)inE.Coli及其主要功能表£coifDNA聚合酶性質(zhì)的比較三種酶均有3,外切酶活性，說(shuō)明均有校正功能DNAPolW:dinB編碼Pel1PolIIPolIII5:3,尸3+3-5'exo+5'-3Jexc新生鎰合成十生物學(xué)活性10.0515結(jié)構(gòu)基因polApc/BpolCDNAPolV:umcC,umcD編碼兩者涉及DNA的錯(cuò)誤傾向修復(fù)（error-pronerepair）o當(dāng)DNA受到較嚴(yán)重

8、損傷時(shí)，即可誘導(dǎo)產(chǎn)生這兩個(gè)酶，使修復(fù)缺乏準(zhǔn)確性（accuracy）,因而出現(xiàn)高突變率。高突變率雖會(huì)殺死許多細(xì)胞，但至少可以克服復(fù)制障礙,使少數(shù)突變的細(xì)胞得以存活。11、單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB:在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護(hù)單鏈的完整。具作用是保證被解鏈酶解開(kāi)的單鏈在復(fù)制完成之前能保持單鏈結(jié)構(gòu)。12、常見(jiàn)的真核細(xì)胞DNA聚合酶及其功能DNA-pola起始引發(fā)，有引物酶活性。DNA-pol3高保真修復(fù)將，瓊基切除修復(fù).DNA-pol在線粒體DNA復(fù)制中起催化作用.DNA-pol5延長(zhǎng)子鏈的主要爵，有解摞旋奔活性。DNA-p加£參與合成后隨鏈，在復(fù)制過(guò)程中起校讀.修復(fù)和填補(bǔ)缺口的作

9、用，13、原核生物DNA復(fù)制的過(guò)程（課本P50-P52）1）復(fù)制的起始：識(shí)別起始點(diǎn),合成引發(fā)體：在E.coli,DnaA蛋白識(shí)別并結(jié)合ori,DnaC協(xié)助DnaB蛋白（解鏈酶，helicase）結(jié)合于ori,DNA雙鏈局部被打開(kāi)，引物酶及其他蛋白加入，形成引發(fā)體。形成單鏈：促旋酶（II型拓?fù)洚悩?gòu)酶）解開(kāi)DNA超螺旋，解鏈酶解開(kāi)雙鏈，單鏈結(jié)合蛋白SSB結(jié)合于處于單鏈狀態(tài)模板鏈上。合成引物：前導(dǎo)鏈的引物由RNA聚合酶合成，滯后鏈的引物由引發(fā)酶合成。引物提供3'-OH,復(fù)制進(jìn)入延伸階段2）復(fù)制的延伸：按照與模板鏈堿基配對(duì)的原則,在DNA聚合酶III的作用下，逐個(gè)加入脫氧核糖核酸，使鏈延長(zhǎng)。D

10、NA聚合酶的即時(shí)校讀和堿基選擇功能，確保復(fù)制的保真性。由于DNA雙鏈走向相反，DNA聚合酶只能催化核甘酸從5'一3'方向合成，前導(dǎo)鏈的復(fù)制方向與解鏈方向一致，可以連續(xù)復(fù)制，而另一模板鏈沿5'一3'方向解開(kāi)，隨從鏈（滯后鏈）的復(fù)制方向與解鏈方向相反，復(fù)制只能在模板鏈解開(kāi)一定長(zhǎng)度后進(jìn)行，因此隨從鏈的合成是不連續(xù)的，形成的是若干個(gè)崗崎片段。DNA聚合酶I的3'-5'核酸外切酶活性去除RNA引物。DNA聚合酶I填補(bǔ)DNA間隙。連接酶使相鄰兩個(gè)DNA片段的3'-OH末端和5'-P末端形成3',5'磷酸二酯鍵。3）復(fù)制的終止：

11、兩個(gè)復(fù)制叉的匯合點(diǎn)就是復(fù)制的終點(diǎn)。兩個(gè)復(fù)制叉向前推移，在終止區(qū)相遇而停止復(fù)制，復(fù)制體解體14、DNA復(fù)制過(guò)程中后隨鏈的合成：后隨鏈開(kāi)始合成DNA時(shí)，需要一段RNA引物、后隨鏈的引發(fā)過(guò)程引發(fā)體來(lái)完成引發(fā)體像火車(chē)頭一樣在后隨鏈分叉的方向上前進(jìn)，并在模板上斷斷續(xù)續(xù)地引發(fā)生成后隨鏈的引物RNA短鏈，再由DNA聚合酶III作用合成DNA,直到遇到下一個(gè)引物或?qū)槠螢橹?。由RNaseH降解RNA引物并由DNA聚合酶I將缺口補(bǔ)齊，再由DNA連接酶將兩個(gè)岡崎片段連接在一起形成大分子DNA15、與原核生物相比真核生物DNA復(fù)制的特點(diǎn)：DNA復(fù)制發(fā)生在細(xì)胞周期的S期；染色體DNA有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，為多復(fù)制子；岡崎

12、片段長(zhǎng)約100200bp。每個(gè)復(fù)制子在染色體DNA全部復(fù)制完成前，不能再開(kāi)始新一輪復(fù)制；而在快速生長(zhǎng)的原核中，起點(diǎn)可以連續(xù)發(fā)動(dòng)復(fù)制。真核生物快速生長(zhǎng)時(shí)，往往采用更多的復(fù)制起點(diǎn)。復(fù)制叉移動(dòng)速度較原核生物慢（1/20真核生物線性染色體兩端有端粒結(jié)構(gòu)，防止染色體間的末端連接和核酸酶降解。由端粒酶負(fù)責(zé)新合成鏈5洲RNA引物切除后的填補(bǔ)，保持端粒的一定長(zhǎng)度。16、幾種修復(fù)機(jī)制：1）直接修復(fù)2）錯(cuò)配修復(fù)3）切除修復(fù)4）重組修復(fù)5）SOS窗復(fù)第四章轉(zhuǎn)錄概念：模板鏈與編碼鏈：DNA雙鏈中按堿基配對(duì)規(guī)律能指引轉(zhuǎn)錄生成RNA的一股單鏈，稱(chēng)為模板鏈（templatestrand）,也稱(chēng)作有意義鏈或Watson鏈。相

13、對(duì)的另一股單鏈?zhǔn)蔷幋a鏈（codingstrand）,也稱(chēng)為反義鏈或Crick鏈。啟動(dòng)子：RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合和開(kāi)始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。終止子（terminator）:提供轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的DNA序列。終止因子（terminationfactor）:協(xié)助RNA聚合酶識(shí)別終止信號(hào)的輔助因子（蛋白質(zhì)）。外顯子&內(nèi)含子：不編碼的插入序列，稱(chēng)內(nèi)含子；編碼的序列稱(chēng)外顯子。斷裂基因：大多數(shù)真核生物基因的核甘酸順序不全部反映到蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)上?；虻木幋a序列被不編碼的插入序列分割成幾段，這樣的基因稱(chēng)為斷裂基因。RNA編輯：mRNA分子由于核甘酸的缺失、插入或置換導(dǎo)致序列發(fā)生了不同于模板DNA的變化，這

14、種現(xiàn)象稱(chēng)為RNA編輯。RNA聚合酶組成：1）原核生物2個(gè)“亞基、1個(gè)3亞基、1個(gè)次3亞基、1個(gè)3亞基、1個(gè)b亞基構(gòu)成RNA聚合酶的全酶。2）真核生物一般有8-16個(gè)亞基，有兩個(gè)分子質(zhì)量超過(guò)100000的大亞基，同種生物3類(lèi)聚合酶（聚合酶I、n、出）有共享小亞基的傾向即有幾個(gè)小亞基是3類(lèi)或2類(lèi)聚合酶所共有的。（T70識(shí)別的啟動(dòng)子：E.coli中b70識(shí)別的啟動(dòng)子包含2個(gè)保守的核心序列-10區(qū)和-35區(qū)：-10區(qū)（TATAbox,Pribnowbox）中心位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游10bp處，一致序列（Consensussequence）為T(mén)80A95T45A60A50T96,所以稱(chēng)-10區(qū)。（右下角的

15、數(shù)字表示該堿基在這個(gè)位置出現(xiàn)的百分率）功能：與RNA聚合酶緊密結(jié)合；形成開(kāi)放啟動(dòng)子復(fù)合體；使RNA聚合酶定向轉(zhuǎn)錄-35區(qū)（Sextamabox）中心位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游35bp處，一致序列為T(mén)82T84G78A65C54A45=功能：RNA聚合酶的識(shí)別位點(diǎn)，為轉(zhuǎn)錄選擇模版；-10區(qū)和-35區(qū)距離相當(dāng)穩(wěn)定，過(guò)大過(guò)小會(huì)影響轉(zhuǎn)錄活性轉(zhuǎn)錄的基本過(guò)程：起始（initiation）、延伸（elongation）、終止（termination）。終止子的2個(gè)類(lèi)型：強(qiáng)終止子（內(nèi)部終止子）一一不依賴(lài)于p因子弱終止子一一依賴(lài)于p因子真核生物中的三種RNA聚合酶存在部位及作用酶ag轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物相對(duì)活性對(duì)a-鵝高蕈堿的敏

16、感性RNA聚合酶I核仁rRNA50-70%不敏感RNA聚合酶n核質(zhì)hnRNA20-40%敏感RNA聚合酶m核質(zhì)tRNA約10%存在物種特異性真核生物mRNA加工5'capping（5'加帽）3'polyadenylation（3'力口polyA尾巴）splicing（拼接）primaryproduct（原初產(chǎn)物）：hnRNA（intron,exon）RNAediting（編輯）modification（修飾）原核和真核細(xì)胞的mRNA的異同同：功能相同，即通過(guò)三聯(lián)密碼子翻譯生成蛋白質(zhì)異：1）真核細(xì)胞5'端存在帽子結(jié)構(gòu)；絕大多數(shù)具有多尾巴；2）原核細(xì)胞：mR

17、NA半衰期短；許多原核生物mRNA可能以多順?lè)醋拥男问酱嬖冢?'端無(wú)帽子結(jié)構(gòu)，3'端沒(méi)有或只有較短的多（A）結(jié)構(gòu)第五章翻譯密碼子：在mRNA的開(kāi)放閱讀框架區(qū)，以每3個(gè)相鄰的核甘酸為一組，代表一種氨基酸（或其他信息），這種三聯(lián)體形式的核甘酸序列稱(chēng)為密碼子。SD序列：在各種mRNA起始AUG上游約813核甘酸部位，存在一段由49個(gè)核甘酸組成的一致序列，富含喋吟堿基，如-AGGAGG-稱(chēng)為Shine-Dalgarno序列（S-D序列），又稱(chēng)核糖體結(jié)合位點(diǎn)（ribosomalbindingsite,RBS>密碼子的特點(diǎn)：1.方向性（directional）2.連續(xù)性（non-pu

18、nctuated）3.簡(jiǎn)并性（degeneracy）4.撰動(dòng)，件（wobble）5.通用，件（universal）起始密碼子（initiationcodon）：AUG終止密碼子（terminationcodon）:uaa、uag、ugatRNA的二級(jí)構(gòu)象特點(diǎn)：三葉草型四個(gè)環(huán)一個(gè)臂tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)一一三葉草形、氨基酸臂、DHU環(huán)、反密碼環(huán)、額外環(huán)、TWC環(huán)三種RNA在蛋白質(zhì)生物合成中的作用：mRNA的功能：把DNA所攜帶的遺傳信息，按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，抄錄并傳送至核糖體，用以決定其合成蛋白質(zhì)的氨基酸排列順序。rRNA的功能：參與組成核蛋白體，作為蛋白質(zhì)生物合成的場(chǎng)所。tRNA的作用：運(yùn)載氨基酸

19、：氨基酸各由其特異的tRNA攜帶，一種氨基酸可有幾種對(duì)應(yīng)的tRNA,氨基酸結(jié)合在tRNA3,-CCA的位置，結(jié)合需要ATP供能；充當(dāng)“適配器”：每種tRNA的反密碼子決定了所攜帶的氨基酸能準(zhǔn)確地在mRNA上對(duì)號(hào)入座。蛋白質(zhì)合成的部位、過(guò)程？核糖體是蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所。蛋白質(zhì)合成過(guò)程：？翻譯的起始核糖體與mRNA結(jié)合并與氨基酰-tRNA生成起始復(fù)合物；？肽鏈的延伸核糖體?gmRNA5'端向3'端移動(dòng)，開(kāi)始從N端向C端的多肽合成；？肽鏈的終止及釋放核糖體從mRNA上解離準(zhǔn)備新一輪的合成反應(yīng)。原核細(xì)胞和真核細(xì)胞在合成蛋白質(zhì)的起始有什么區(qū)別？(起始因子、起始氨酰-tRNA、核糖體不同等)

20、原核細(xì)胞真核細(xì)胞起始因子IF-1,IF-2,IF-3elF-3,eIF-2B、eIF-3、elF-5,eIF-6起始tRNAfMet-tRNAfMetMet-tRNAMet核糖體30S小亞基首先與mRNA模板相結(jié)合，再與fMet-tRNAfMet結(jié)合，最后與50S大業(yè)基結(jié)合。40S小亞基首先與Met-tRNAMet相結(jié)合，再與模板mRNA結(jié)合，最后與60S大業(yè)基結(jié)合生成80S-mRNAMet-tRNAMet起始復(fù)合物翻譯的特點(diǎn)：真核生物原核生物遺傳密碼相同相同轉(zhuǎn)錄與翻譯不偶聯(lián)，mRNA的前體要加工偶聯(lián)起始因子多、起始復(fù)雜少mRNA5'端：帽子，3'端：尾巴，單順?lè)醋?'

21、端：Kozazk序列無(wú)需加工，多順?lè)醋樱?'端：SD序歹U核糖體人HU復(fù)雜簡(jiǎn)單起始tRNAtRNAimettRNAifmet合成過(guò)程需ATP,起始因子多，延長(zhǎng)因子少(EFT1、EFT2),一種釋放因子需ATPGTP,IF1、IF2、IF3EF-TUEF-TSEFGRF1、RF2、RF3線粒體，葉綠體獨(dú)立的蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)肽鏈延長(zhǎng)過(guò)程1.進(jìn)位(positioning)/注冊(cè)(registration)：根據(jù)mRNA下一組遺傳密碼指導(dǎo)，使相應(yīng)氨基酰-tRNA進(jìn)入核蛋白體A位。通過(guò)延伸因子EF-TsM生GTP形成EF-Tu?GTF合物重新參與下一輪循環(huán)。需要消耗GTP,并需EF-TlkEF-T

22、s兩種延伸因子2.成肽(peptidebondformation):是由轉(zhuǎn)肽酶(transpeptidase)催化的肽鍵形成過(guò)程3.轉(zhuǎn)位(translocation)：核糖體向mRNA3'端方向移動(dòng)一個(gè)密碼子。需要消耗GTP,并需EF-G延伸因子真核生物肽鏈合成的延長(zhǎng)過(guò)程與原核基本相似，但有不同的反應(yīng)體系和延長(zhǎng)因子。另外，真核細(xì)胞核蛋白體沒(méi)有E位，轉(zhuǎn)位時(shí)卸載的tRNA直接從P位脫落。蛋白質(zhì)合成后的加工修飾有哪些內(nèi)容翻譯后加工一級(jí)結(jié)構(gòu)的修飾：N-端Met(fMet)去除一硫鍵的形成個(gè)別氨基酸的修飾羥化作用：羥脯氨酸羥賴(lài)氨酸酶活性中心的磷酸化多蛋白的加工一條合成后的多肽鏈經(jīng)加工產(chǎn)生多種不同

23、活性的蛋白質(zhì)/多肽高級(jí)結(jié)構(gòu)的修飾：業(yè)基的聚合HbA亞單位聚合結(jié)合蛋白質(zhì)的合成糖蛋白的合成輔基連接輔基(輔酶)與肽鏈的結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的2種機(jī)制：翻譯中轉(zhuǎn)運(yùn)(cotranslationaltransport):蛋白質(zhì)合成與跨膜運(yùn)送是同時(shí)進(jìn)行的。翻譯后轉(zhuǎn)運(yùn)(posttranslationaltransport):蛋白質(zhì)在核糖體上合成后釋放到胞質(zhì)中。當(dāng)它們跨膜運(yùn)送時(shí)，合成過(guò)程已完成，故稱(chēng)為“轉(zhuǎn)譯后運(yùn)送”第六章分子生物學(xué)研究法限制性核酸內(nèi)切酶：(RE層一類(lèi)核酸內(nèi)切酶，能識(shí)別雙鏈DNA分子內(nèi)部的特異序列，并裂解磷酸二酯鍵。載體：指基因工程中攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的運(yùn)載工具，其本質(zhì)是DNA復(fù)制子。核酸分子雜

24、交：在DNA復(fù)性過(guò)程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對(duì)關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex)Southern雜交：即將DNA經(jīng)限制性酶切，凝膠電泳后，再轉(zhuǎn)移至膜上與標(biāo)記探針雜交的一種核酸分子雜交技術(shù)。特異性，敏感性，準(zhǔn)確性具佳。主要用于檢測(cè)基因組中特定的基因和序列，也常用于鑒定克隆DNA的特殊序列。Northern雜交：即將電泳分離后的變性RNA吸印到適當(dāng)?shù)哪ど显龠M(jìn)行分子雜交的技術(shù)。重組DNA技術(shù)中常用的工具酶：限制性核酸內(nèi)切酶、DNA聚合酶I、逆轉(zhuǎn)錄酶、T4DNA連接酶、堿性

25、磷酸酶、末端轉(zhuǎn)移酶、TaqDNA聚合酶。重組DNA技術(shù)中常用的載體：載體按功能分為克隆載體:為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱(chēng)為克隆載體。質(zhì)粒、噬菌體、柯斯質(zhì)粒載體（又稱(chēng)黏粒載體）、酵母人工染色體、細(xì)菌人工染色體、動(dòng)物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）表達(dá)載體：為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱(chēng)為表達(dá)載體。根據(jù)宿主細(xì)胞分為：原核表達(dá)載體、真核表達(dá)載體。PCR的反應(yīng)體系：模板DNA、特異性引物、耐熱DNA聚合酶、dNTP&Mg2+。PCR的原理：針對(duì)目的DNA的5?-和3?-端，設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，在每條引物的5?-端分別加

26、上不同的RE位點(diǎn)，然后以目的DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增便可得到帶有引物序列的目的DNA,再用相應(yīng)RE切害UPCR產(chǎn)物，產(chǎn)生黏端，隨后便可與帶有相同黏端的線性化載體進(jìn)行有效連接。PCR的用途：（一）目的基因的克?。ǘ┗蛲蛔儯ㄈ〥NA和RNA的微量分析（四）DNA序列測(cè)定（五）基因突變分析第七章原核基因表達(dá)調(diào)控操縱子：在原核生物中受同一蛋白質(zhì)調(diào)控的一個(gè)車(chē)t錄功能單位，由啟動(dòng)子（promoter）、操縱基因（operator）和結(jié)構(gòu)基因（structuralgene）組成。結(jié)構(gòu)基因：編碼蛋白質(zhì)或RNA的基因。調(diào)節(jié)基因：產(chǎn)生調(diào)控蛋白，調(diào)控結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的基因。弱化子：指原核生物操縱子中，能顯著減弱

27、或終止轉(zhuǎn)錄作用的一段核甘酸序列。轉(zhuǎn)錄因子：包括轉(zhuǎn)錄激活因子和轉(zhuǎn)錄阻遏因子。這類(lèi)調(diào)節(jié)蛋白能識(shí)別并結(jié)合轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游序列或遠(yuǎn)端增強(qiáng)子元件，通過(guò)DNA一蛋白質(zhì)相互作用。魔斑核甘酸：是細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中在缺乏氨基酸供應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的一個(gè)應(yīng)急產(chǎn)物。主要是三磷酸鳥(niǎo)甘（GTR）合成的四磷酸鳥(niǎo)昔（ppGpp）和五磷酸鳥(niǎo)昔（pppGpp）。主要功能是干擾RNA聚合酶與啟動(dòng)子結(jié)合的專(zhuān)一性，誘發(fā)細(xì)菌的應(yīng)急反應(yīng)，幫助細(xì)菌在不良環(huán)境條件下得以存活。簡(jiǎn)述乳糖操縱子在無(wú)乳糖、添加乳糖、葡萄糖和乳糖都存在時(shí)的工作原理。1沒(méi)有乳糖，只有葡萄糖時(shí)，不產(chǎn)生利用乳糖的酶。有葡萄糖及cAMP濃度低時(shí)，CAP活性低，沒(méi)有正調(diào)控。沒(méi)有乳糖，沒(méi)有

28、半乳糖時(shí)，阻遏蛋白可與操縱序列結(jié)合，起負(fù)調(diào)控作用。由于、轉(zhuǎn)錄受抑制，不產(chǎn)生利用乳糖的酶。2 .有葡萄糖.又有乳糖時(shí).不利用乳糖。有葡萄糖及cAMP濃度低時(shí)，CAP活性低，沒(méi)有正調(diào)控。有乳糖，有半乳糖，阻遏蛋白不可與操縱序列結(jié)合，無(wú)負(fù)調(diào)控。由于沒(méi)有正調(diào)控，轉(zhuǎn)錄處于低水平狀態(tài)，不產(chǎn)生利用乳糖的酶，細(xì)菌優(yōu)先利用葡萄糖。沒(méi)有葡萄糖，只有乳糖時(shí)，利用乳糖。3 .沒(méi)有葡萄糖：只有乳糖時(shí)：利用乳糖。沒(méi)有葡萄糖及cAMP濃度高時(shí)，CAP活性高，有正調(diào)控。有乳糖，有半乳糖，阻遏蛋白不可與操縱序列結(jié)合，無(wú)負(fù)調(diào)控。轉(zhuǎn)錄處于高水平，利用乳糖酶大量合成。乳糖操縱子的組成和作用機(jī)制1、孚L糖操縱子的組成：大腸桿菌乳糖操縱

29、子含Z、Y、A三個(gè)結(jié)構(gòu)基因，分別編碼半乳糖甘酶、透酶和半乳糖昔乙酰轉(zhuǎn)移酶，此外還有一個(gè)操縱序列O,一個(gè)啟動(dòng)子P和一個(gè)調(diào)節(jié)基因I.2、作用機(jī)制：1）阻遏蛋白的負(fù)性調(diào)節(jié)：沒(méi)有乳糖存在時(shí)，1基因編碼的阻遏蛋白結(jié)合于操縱序列O處，乳糖操縱子處于阻遏狀態(tài)，不能合成分解乳糖的三種酶；有乳糖存在時(shí)，乳糖作為誘導(dǎo)物誘導(dǎo)阻遏蛋白變構(gòu)，不能結(jié)合于操縱序列乳糖操縱子被誘導(dǎo)開(kāi)放合成分解而的三種酶.所以，乳糖操縱子的這種調(diào)控機(jī)制為可誘導(dǎo)的負(fù)調(diào)控.2）CAP的正性調(diào)節(jié)：在啟動(dòng)子上游有CAP結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)大腸桿菌從以葡萄糖為碳源的環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)橐匀樘菫樘荚吹沫h(huán)境時(shí),cAMP濃度升高，與CAP結(jié)合，使CAP發(fā)生變構(gòu)，CAP結(jié)合于乳

30、糖操縱子啟動(dòng)序列附近的CAP結(jié)合位點(diǎn)，激活RNA聚合酶活性，促進(jìn)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合于操縱子后促進(jìn)結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄，對(duì)乳糖操縱子實(shí)行正調(diào)控，加速合成分解乳糖的三種酶.3）協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)：乳糖操縱子中的I基因編碼的阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控與CAP的正調(diào)控兩種機(jī)制，互相協(xié)調(diào)、互相制約.色氨酸調(diào)控機(jī)制：大腸桿菌色氨酸操縱子的轉(zhuǎn)錄受阻遏機(jī)制和弱化機(jī)制兩種機(jī)制的控制,前者通過(guò)阻遏蛋白和操縱基因的作用控制轉(zhuǎn)錄的起始，后者通過(guò)前導(dǎo)序列形成特殊的空間結(jié)構(gòu)控制轉(zhuǎn)錄起始后是否進(jìn)行下去。）色氨酸操縱子的可阻遏系統(tǒng)：在阻遏系統(tǒng)中，起負(fù)調(diào)控的調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是一個(gè)無(wú)活性的阻遏蛋白，色氨酸是輔阻遏物；當(dāng)色氨酸不足時(shí)，阻遏蛋白無(wú)活性，

31、不能和操縱基因結(jié)合，色氨酸操縱子能夠轉(zhuǎn)錄；當(dāng)色氨酸充足時(shí)，阻遏蛋白和它結(jié)合而被激活，從而結(jié)合到操縱基因上，而色氨酸操縱子的操縱基因位于啟動(dòng)基因內(nèi)，因此，活性阻遏物的結(jié)合排斥了RNA聚合酶的結(jié)合，從而抑制了結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。弱化子工作的原理及其生物學(xué)意義原理：原核生物中，轉(zhuǎn)錄和翻譯偶連。前導(dǎo)區(qū)的轉(zhuǎn)錄緊接著前導(dǎo)mRNA的翻譯；前導(dǎo)肽mRNA含2個(gè)連續(xù)的Trp密碼子，其翻譯對(duì)運(yùn)載色氨酸的tRNA濃度敏感。如果細(xì)胞中Trp濃度很低，核糖體就會(huì)在此暫停；核糖體的暫停改變前導(dǎo)mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，4區(qū)被轉(zhuǎn)錄完成時(shí)核糖體才進(jìn)行到1區(qū),前導(dǎo)區(qū)結(jié)構(gòu)為2&3配對(duì)，不形成內(nèi)在性終止子（3-4配對(duì)）結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄繼續(xù)

32、。如果細(xì)胞中Trp濃度高，核糖體很快通過(guò)2個(gè)連續(xù)的Trp密碼子，在4區(qū)被轉(zhuǎn)錄之前就到達(dá)2區(qū)，3&4配對(duì)，形成內(nèi)在性終止子結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄終止。生物學(xué)意義：氨基酸合成中的反饋抑制。經(jīng)濟(jì)的原則。細(xì)菌利用阻遏和弱化雙重機(jī)制感受細(xì)胞內(nèi)外Trp的變化，精確調(diào)控Trp的合成。反應(yīng)靈敏。單獨(dú)的弱化作用的效率很高，其他氨基酸操縱子如His、Leu,沒(méi)有阻遏蛋白，全靠弱化作用調(diào)節(jié)。效率高。提供了一條不依靠調(diào)節(jié)蛋白，只依賴(lài)RNA結(jié)構(gòu)的基因表達(dá)調(diào)控途徑?？茖W(xué)上，把培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)缺乏，蛋白質(zhì)合成停止后，RNA合成也趨于停止這種現(xiàn)象稱(chēng)為嚴(yán)緊控制（rel+）;反之則稱(chēng)為松散控制（rel-）。魔斑的主要作用：（1） ppGpp一四磷酸鳥(niǎo)甘（魔斑ImagicspotI）調(diào)控一些反應(yīng)的效應(yīng)物，主要功能是： 抑制rRNA基因的啟動(dòng)子與RNA聚合酶與結(jié)合的專(zhuān)一性； 抑制多數(shù)或大多數(shù)基因轉(zhuǎn)錄的延伸。（2） pppGpp一五磷酸鳥(niǎo)甘（魔斑IImagicspotII）當(dāng)細(xì)胞缺乏氨基酸時(shí)產(chǎn)生ppGpp,可在很大范圍內(nèi)做出應(yīng)急反應(yīng)，如抑制核糖體和其他大分子的合成，活化某些氨基酸操縱