分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技能操作pet system manual

1、pET System Manual第 10 版 pET 系統(tǒng)操作手冊于2002 年 7 月修訂完成。Novagen 一直致力于研制開發(fā)pET 系統(tǒng)，并將pET 系統(tǒng)的新進(jìn)展編入本手冊。欲獲取 pET 系統(tǒng)的任何最新資訊，請隨時登錄 Novagen。內(nèi)容提要14444455578899101010101111111112121212131314161617181819202122232323232425內(nèi)容提要I.系統(tǒng)介紹A. 概況B.C.使用系統(tǒng)組成及協(xié)議D. 選擇合適的 pET 載體基本考慮因素蛋白溶解性及細(xì)胞融合各種pET 載體特性列表E. pET 載體克隆策略不帶融合的天然蛋白以蛋白酶切

2、去融合不需連接反應(yīng)的克隆方F. pET 系統(tǒng)蛋白表達(dá)的調(diào)控T7lac啟動子pLysS 和 pLysE 宿主菌的天然蛋白IC)載體與宿主菌共同影響表達(dá)水平含葡萄糖的培養(yǎng)基pLacI 宿主菌pETcoco 系統(tǒng)G. 用于克隆的宿主菌H. 用于表達(dá)的宿主菌蛋白酶缺陷型調(diào)節(jié)培養(yǎng)體系中所有細(xì)胞的表達(dá)水平二硫鍵的形成及增加蛋白可溶性補(bǔ)充稀有子硒代甲硫氨酸標(biāo)記pET 系統(tǒng)各種宿主菌特性列表抗生素抗性CE6 噬菌體I.J.K. 誘導(dǎo)對照建立原核表達(dá)體系的基本知識A. pET 系統(tǒng)操作流程II.B.C.D.E.生長培養(yǎng)基菌株保存載體片段III. 目的片段克隆A. 連接反應(yīng)B. 轉(zhuǎn)化操作小訣竅操作步驟鋪板技術(shù)操作

3、手冊TB055 第 10 版默克中國技術(shù)咨詢上海代表處 北京代表處 廣州代表處Novagenbioteammerck-1 pET System ManualC. pET 重組子分析用 EcoPro 系統(tǒng)分析轉(zhuǎn)錄/翻譯水平質(zhì)粒模板PCR 模板轉(zhuǎn)錄/翻譯分析的連接 PCR 轉(zhuǎn)錄/翻譯分析的菌落 PCR 菌落篩選質(zhì)粒252626262829293030303131313132323132323333343335353435353636363737373738383838393939404141424343434344IV.表達(dá)目的A. 轉(zhuǎn)化表達(dá)用宿主菌株B. DE3 溶原菌的誘導(dǎo)誘導(dǎo)的準(zhǔn)備工作誘導(dǎo)的

4、操作步驟優(yōu)化表達(dá)條件V.增加蛋白溶解性及折疊溫度裂解緩沖液細(xì)胞周質(zhì)細(xì)胞質(zhì)宿主菌A.B.C.稀有毒性子及質(zhì)粒不穩(wěn)定性氨芐青霉素的使用補(bǔ)充葡萄糖質(zhì)粒穩(wěn)定性測試穩(wěn)定甘油菌株保存過程中氨芐抗性 pET 載體上的毒性的措施穩(wěn)定誘導(dǎo)過程中氨芐抗性 pET 載體上的毒性D. 影響表達(dá)的其它因素N-端原則翻譯起始位點(diǎn)的措施mRNA 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的意外終止子轉(zhuǎn)錄終止子結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的目的mRNA 及蛋白目的蛋白分析SDS-PAGE 電泳上樣體積標(biāo)準(zhǔn)化生長和誘導(dǎo)誘導(dǎo)培養(yǎng)物的光密度分析A. 用 PopCulture 快速分析蛋白表達(dá)水平、活性及可溶性VI.B.C.細(xì)胞總蛋白組分培養(yǎng)基組分D. 細(xì)胞周質(zhì)組分E.細(xì)胞質(zhì)可溶部

5、分組分BugBuster® 和Benzonase® 核酸酶處理rLysozyme 溶液和凍融處理機(jī)械破碎F. 細(xì)胞質(zhì)不溶部分組分BugBuster®試劑處理后的包涵體純化機(jī)械性裂解細(xì)胞的包涵體純化G. 用 PopCulture 試劑抽提物默克中國操作手冊 TB055 第 10 版技術(shù)咨詢上海代表處北京代表處廣州代表處bioteammerck- Novagen2pET System ManualVII. 目的蛋白的鑒定和定量A. 標(biāo)準(zhǔn) SDS-PAGE 凝膠電泳上樣454954647485050505151535454B. 融合的檢測/分析工具VIII.目的蛋白的純

6、化A. 純化工具B.溶解與重折疊IX. 誘導(dǎo)對照：半乳糖苷酶重組物? 半乳糖苷酶分析X. pET 系統(tǒng)宿主菌以及 噬菌體用于蛋白表達(dá)的lDE3 溶原菌用于初始克隆、對照和表達(dá)的同pET 系統(tǒng)宿主菌感受態(tài)細(xì)胞套裝pET 系統(tǒng)的? 噬菌體宿主菌XI. 附錄：蛋白功能研究突變蛋白質(zhì)相互作大全雜交系統(tǒng)T7 噬菌體展示系統(tǒng)沉默研究···關(guān)于 pET 系統(tǒng)的所有的專利、商標(biāo)信息請參考 Novagen 原版目錄。Novagen 是德國Merck KgaA所有 Novagen 出售的子公司EMD 公司的品牌之一?？蒲兄?。操作手冊TB055 第 10 版默克中國技術(shù)咨詢上海代表處

7、 北京代表處 廣州代表處Novagenbioteammerck-3pET System Manual系統(tǒng)介紹I.系統(tǒng)介紹A.概況p ET 系統(tǒng)是有史以來在 E.coli 中克隆表達(dá)重組蛋白的功能最強(qiáng)大的系統(tǒng)。目的被克隆到 pET質(zhì)粒載體上，受噬菌體 T7強(qiáng)轉(zhuǎn)錄及翻譯(可選擇)信號；表達(dá)由宿主細(xì)胞提供的T7 RNA 聚合酶誘導(dǎo)。T7 RNA 聚合酶機(jī)制十分有效并具選擇性：充分誘導(dǎo)時，幾乎所有的細(xì)胞都用于表達(dá)目的蛋白；誘導(dǎo)表達(dá)后僅幾個小時，目的蛋白通常可以占到細(xì)胞總蛋白的50%以上。盡管該系統(tǒng)極為強(qiáng)大，卻仍能很容易地通過降低誘導(dǎo)物的濃度來削弱蛋白表達(dá)。降低表達(dá)水平可能可以提高某些目的蛋白的可溶部分

8、產(chǎn)量。該系統(tǒng)的另一個重要優(yōu)點(diǎn)是在非誘導(dǎo)條件下，可以使目的完全處于沉默狀態(tài)而不轉(zhuǎn)錄。用不含 T7 RNA聚合酶的宿主菌克隆目的，即可避免因目的蛋白對宿主細(xì)胞的可能毒性造成的質(zhì)粒不穩(wěn)定 (詳見 I. F.部分)。如果用非表達(dá)型宿主細(xì)胞克隆，可以通過兩種方法啟動目的蛋白的表達(dá)：用帶有受 pL 和 pI 啟動子的 T7 RNA 聚合酶的CE6噬菌體侵染宿主細(xì)胞，或者將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入帶有受 lacUV5的 T7 RNA聚合酶的表達(dá)型細(xì)胞。在第二種情形下，可以通過在細(xì)菌培養(yǎng)基中加入 IPTG 來啟動表達(dá)。盡管有時(例如非毒性目的蛋白) 可以直接將目的克隆到表達(dá)型宿主細(xì)胞中，但這種策略并不是通用做法。兩種 T7

9、啟動子以及多種擁有不同抑制本底表達(dá)水平的宿主細(xì)胞共同目的蛋白得以最優(yōu)化表達(dá)。了一個極為靈活而有效的系統(tǒng)，使各種所有 pET 載體以及相關(guān)均以試劑盒形式提供，用戶可以很方便地進(jìn)行克隆、表達(dá)檢測以及純化目的蛋白的所有操作。pET 表達(dá)系統(tǒng)包括質(zhì)粒和宿主菌。您可參考系統(tǒng)組成部分，選擇符合具體需要的載體/宿主菌最佳組合。立即開始表達(dá)研究，請直接從第 18 頁開始。使用及協(xié)議B.Novagen的 T7 表達(dá)系統(tǒng)，包括細(xì)菌、噬菌體和帶有 T7 RNA 聚合酶的質(zhì)粒，均依照非商業(yè)用戶應(yīng)用相應(yīng)條款有條件提供。垂詢。C.系統(tǒng)組成pET 表達(dá)系統(tǒng)提供目的克隆和表達(dá)所需的試劑。? 選定的pET 載體DNA，10 &

10、#181;g? 宿主菌 BL21，BL21(DE3)以及 BL21(DE3)pLysS甘油菌 1, 2? 誘導(dǎo)對照克隆，甘油儲存物系統(tǒng)加感受態(tài)細(xì)胞包括所有上述組分以及一套 3 種直接用于高效轉(zhuǎn)化pET 重組子的感受態(tài)宿主細(xì)胞。每種宿主菌感受態(tài)細(xì)胞足夠用于10 次轉(zhuǎn)化：區(qū)別感受態(tài)細(xì)胞和甘油菌有一個簡單方法，即：甘油菌的包裝為旋蓋管，而感受態(tài)細(xì)胞以卡口管形式提供。?0.2 ml 分裝 NovaBlue，BL21(DE3)以及 BL21(DE3)pLysS 感受態(tài)細(xì)胞SOC 培養(yǎng)基對照質(zhì)粒1 pET 多肽表達(dá)系統(tǒng)31 包括BLR和BLR(DE3)pLysS宿主菌而非BL21 系列宿主菌。2 pET

11、Trx 融合系統(tǒng)32 包括AD494 系列以及BL21 系列宿主菌。單獨(dú)提供的組分和相關(guān)： 參見 Novagen目錄或 Novagen統(tǒng)和感受態(tài)細(xì)胞完全列表。D. 選擇合適的 pET 載體()pET 載體系p ET 載體最初由 Studier 及其同事構(gòu)建(Studier and Moffatt, 1986; Rosenberg., 1987; Studier.,1990)。 Novagen 開發(fā)的系列新 pET 載體則使目的蛋白的克隆、檢測以及純化更加容易。載體大致可分為兩大類：轉(zhuǎn)錄載體和翻譯載體。 轉(zhuǎn)錄載體用以表達(dá)本身帶有原核核糖體結(jié)合位點(diǎn)和 AUG 起始錄載體： pET -21(+)、p

12、ET -24(+)和 pET-23(+)。子的目的。只有 3 種轉(zhuǎn) 翻譯載體包括來自T7 噬菌體主要衣殼蛋白的高效核糖體結(jié)合位點(diǎn)，用于表達(dá)那些不帶有核糖體結(jié)合位點(diǎn)的目的。翻譯載體的詳細(xì)信息請參考 pET 載體特點(diǎn)一覽表(第 7 頁)。翻譯載體在命名上與轉(zhuǎn)錄載體不同，多一個字母后綴，例如 pET-21a(+)，表示相對于 BamH I 克隆位點(diǎn)識別序列GGATCC 的閱讀框。所有帶后綴 a 的載體從GGA 三聯(lián)子開始表達(dá)，帶 b 的從GAT 開始，帶c 的從 BamH I 識別序列ATC 三聯(lián)子開始。帶 d 后綴的載體閱讀框和帶 c 的一樣，不同的是它們有一個上游 Nco I 克隆位點(diǎn)而非 Nd

13、e I 位點(diǎn)以便直接將目的克隆到AUG 起始子。默克中國操作手冊 TB055 第 10 版技術(shù)咨詢上海代表處北京代表處廣州代表處bioteammerck- Novagen4pET System Manual系統(tǒng)介紹基本考慮因素選擇合適的pET 載體通常要綜合考慮很多因素。其中包括下列一些基本因素：目的蛋白的應(yīng)用目的蛋白已知特定信息克隆策略pET 載體的應(yīng)用多種多樣。例如分析級表達(dá)量的蛋白用于活性分析，篩選及確定突變， 篩選配體相互作用，抗原等。大量活性蛋白用于結(jié)構(gòu)研究，作為試劑或親和基質(zhì)?？赡苡卸喾N載體都能滿足表達(dá)用于篩查或抗原 所需的分析級表達(dá)量的要求，但是，能用于大量純化的載體- 宿主菌-

14、培養(yǎng)條件的最佳組合條件往往是唯一的。如果要連續(xù)生產(chǎn)大量高活性的目的蛋白，那么多 花些功夫摸索載體-宿主菌-培養(yǎng)條件的組合以便找到最佳條件，是非常值得的。任何有關(guān)目的蛋白的信息都有助于選擇合適的載體。例些蛋白表現(xiàn)活性要求一端或兩端均無外源序列。大多數(shù) pET 載體可以克隆非融合序列；但是，如果特定翻譯起始序列在 E. coli 中不能被有效使用，表達(dá)水平也會受到一定的影響。在這種情況下，通常是構(gòu)建一種帶有高效表達(dá)的 氨基末端序列的融合蛋白(參見pET 載體特點(diǎn)總表，第7頁，N 端融合表達(dá))，并在純化完成后用特定的蛋白酶切去融合序列。不需連接反應(yīng)的克隆(LIC)在這種情況中特別有用，可以通過腸激酶

15、或 Xa 因子切去所有載體編碼的氨基末端序列(參見pET 載體特點(diǎn)總表，第7頁)。不同的克隆策略、對限制性酶切位點(diǎn)及閱讀框的不同要求，會影響對載體的選擇。許多 pET 載體具有同樣的限制性酶切位點(diǎn)，用戶可以僅準(zhǔn)備一次目的片段，將其到多個載體中。不同的要求可以考慮采用不同的 PCR 克隆策略。LIC 載體試劑盒是一種非常有用的，可以用來以PCR片段卻避免了限制性酶切消化載體和序列的操作。蛋白溶解性及細(xì)胞一旦確定了用途和克隆策略，下一步就是目的蛋白在細(xì)胞中的和可溶性。許多后續(xù)應(yīng)用要求目的蛋白以具有生物活性的可溶狀態(tài)表達(dá)。而目的蛋白的可溶性常常受很多因素影響，包括 特定的蛋白序列等。在大多數(shù)情況下，

16、可溶性并非有或無的現(xiàn)象，載體、宿主菌及培養(yǎng)基的不同 選擇可以增加或降低可溶/不溶蛋白的量。正確選用合適的載體和宿主菌組合會明顯提高目的蛋白可溶部分比例及活性。載體可以通過三種方式目的蛋白的溶解性或正確折疊：1)與本身溶解性高的多肽序列融合表達(dá) 例如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，硫氧還蛋白(Trx)及 NusA (N utilization substance A)；2) 與催化二硫鍵形成的酶融合表達(dá)(例如Trx，DsbA，及 DsbC)；或者 3) 與信號序列融合表達(dá)，輸出到細(xì)胞周質(zhì)。如采用蛋白于細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)載體，可選用二硫鍵在胞質(zhì)中形成的宿主菌株來使目的蛋白正確折疊(例如帶有 trxB 和

17、 gor 突變的菌株，參見第12頁)。要獲得可溶的活性蛋白，還可以考慮選用能將蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞周質(zhì)的載體，因?yàn)榧?xì)胞周質(zhì)的環(huán)境 更有利于蛋白折疊和二硫鍵的形成。因此應(yīng)選用那些帶有信號肽的載體。DsbA 和 DsbC 是 pET- 39b(+)及 p ET-40b(+)攜帶的催化二硫鍵形成/異構(gòu)化的細(xì)胞周質(zhì)酶。pET 系統(tǒng)中還提供許多不帶DsbA 或 DsbC 編碼區(qū)而具有信號序列的載體供選擇 (參見第7頁表)。許多情況下，目的蛋白成不溶的沒有生物活性的結(jié)構(gòu)，稱為包涵體。形成包涵體較有利于純化：1) 容易通過離心收獲濃度高而相對純凈的蛋白； 2)包涵體保護(hù)蛋白免受蛋白酶水解。另外，毒性蛋白以無活性的

18、包涵體形式表達(dá)，影響宿主菌的生長。純化方法中有一些于純化細(xì)胞質(zhì)中的包涵體。收集包涵體后將其溶解，可以使目的蛋白在體外重折疊。采用這種方法能夠獲得很高的蛋白產(chǎn)量并避免宿主菌中的蛋白酶降解。然而，不同蛋白重折疊為活性蛋白的效率大不相同，有時則非常低。因此，此法僅建議用于特別要求正確折疊的應(yīng)用情況。pET-17xb 以 N 端融合蛋白形式表達(dá)全長220 aa T7抗原或用于不10 蛋白，并形成包涵體。pET-31b(+)也是表達(dá)融合蛋白包涵體的代表，非常適合小蛋白和多肽。融合融合用于檢測和純化目的蛋白，有時也通過增加目的蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的可溶性或幫助將目的蛋白運(yùn)轉(zhuǎn)到細(xì)胞周質(zhì)中以提高目的蛋白的生物活性。

19、配合特定應(yīng)用的要求，你可以帶有以下的融合蛋白：STag ，T7Tag ®，GSTTag ，HisTag ®，HSVTag ® 或 NusTag ，很方便用Western Blot 檢測。這其中有些多肽(融合序列)很小，對檢測試劑的特異性和靈敏度有特別的要求。HisTag，GSTTag ，STag 以及T7Tag 亦可用相應(yīng)的樹脂及緩沖液試劑盒進(jìn)行親和純化。操作手冊TB055 第 10 版默克中國技術(shù)咨詢上海代表處 北京代表處 廣州代表處Novagenbioteammerck-5pET System Manual系統(tǒng)介紹使用 STag 及 GSTTag 檢測試劑盒可

20、以對粗提物中的融合蛋白或純化的蛋白進(jìn)行精確定量測定。FRETWorks STag分析試劑盒基于一種特別的材料能通過熒光檢測 1 fmol 以下的融合蛋白。HisTag 是常用的純化蛋白的融合，特別是那些以包涵體形式表達(dá)的蛋白?？梢詫⒌鞍自谕耆冃詶l件下溶解，繼而進(jìn)行親和純化。CBDTag 序列也常用于低成本親和純化。尤其適用于重新折疊操作pET-34b(+)和 35b(+)帶有CBDclosTag 序列；只有正確折疊的 CBDs 方能與素基質(zhì)結(jié)合，而折疊不正確的組分則可通過CBinDTM親和純化操作有效去除。盡管許多都可用于固定目的蛋白， CBDTag 卻因質(zhì)本身極低的非特異性結(jié)合和生物兼容性

21、而特別值得推薦。素基據(jù)NusTag ，TrxTag 及GSTTag 序列可以增加融合表達(dá)蛋白的溶解性。氨芐抗性的NusTag和 TrxTag 載體與Origami ，Origami B 及Rosetta-gami 等能在細(xì)胞質(zhì)中形成二硫鍵的宿主菌配合使用(參見第12頁)。下表列出了各種融合及對應(yīng)的pET 載體。有些 pET 載體可帶有多個 5'端融合(參見第7頁)。另外，許多載體能表達(dá)兩端帶有不同的多肽的融合蛋白。選用在 5'端與目的序列間有蛋白酶切位點(diǎn)(凝血酶，腸激酶， Xa因子)的載體可以在純化完成后切去一個或多個融合。表達(dá) C-端融合序列時要特別注意的是：(1)序列不含終

22、止子；(2)克隆保留正確的閱讀框。p ET 載體各種融合N/C端或內(nèi)部(I)大小(氨基酸)鑒定/純化原理應(yīng)用pET 載體T7 Tag ®11 或 260單克隆抗體N, IAP, IF, IP, WB3, 5, 9, 11, 17 17x, 21,23, 24, 28, 33S Ta gN, I15S-蛋白(104aa)親和AP, QA, WB29, 30, 32, 3437, 3944HisTag ®6, 8, 或 10金屬螯合層析(天然或變性)，單克隆抗體N, C, IAP, IF, WB1416, 1944HSVTag ®C11單克隆抗體IF, WB25, 2

23、7, 43.1, 44細(xì)胞周質(zhì)pelB/ompTN20/22PE12, 20, 22, 25, 26, 27KSIN125疏水區(qū)PP31硫氧還蛋白驅(qū)動二硫鍵形成特別是在trxB 和trxB/gor 宿主菌中TrxTagN109DB, SP32蛋白激酶A 識別位點(diǎn)PKA siteI5PS33CBDclosTagN156多克隆抗體，素結(jié)合區(qū)IP, AP, WB34, 35CBDcenATagN114多克隆抗體， 周質(zhì)/培養(yǎng)基素結(jié)合區(qū)，細(xì)胞IP, AP, PE, WB36, 37CBDcexTagC107多克隆抗體， 周質(zhì)/培養(yǎng)基素結(jié)合區(qū)，細(xì)胞IP. AP, PE, WB38細(xì)胞周質(zhì)DsbTagN2

24、08 (DsbA)236 (DsbC)DB, DI, PE, SP39, 40單克隆抗體，酶活性，谷胱甘肽親和GSTTagN220AP, IF, IP, QA, WB41, 42NusTagN, I495提高細(xì)胞質(zhì)可溶性，單克隆抗體SP, WB43.1, 44AP = 親和純化DB = 二硫鍵DI = 二硫鍵異構(gòu)化IF = 免疫熒光IP = 免疫沉淀PE = 蛋白輸出PP = 小蛋白/多肽PS = 體外磷酸化QA = 定量分析SP = 可溶蛋白WB = Western印跡默克中國操作手冊 TB055 第 10 版技術(shù)咨詢上海代表處北京代表處廣州代表處bioteammerck- Novagen6

25、pET System Manual系統(tǒng)介紹各種pET 載體特性列表下表列出用于各種克隆需要的pET 載體。其中命名后帶有(+)的載體含有 f1區(qū)，可以單鏈 DNA，適合突變及T7lacT7 Tag ®11His Tag ®T7?等應(yīng)用。S? Tag Tag260 Trx?kanRCBD? Tag HSV Tag ® Dsb Tag Nus?Tag 信號序列蛋白酶ampRT7TagKSIPKAGST Tag載體kanRT7lacT7 Tag 11T7Trx TagGST TagCBD? TagNus?載體S TagHSV TagDsb TagTag 信號序列His

26、TagKSI蛋白酶ampRT7 Tag260PKA注： T7? Tag11 = 11aa 融合signal seq. = 用于細(xì)胞周質(zhì)T7? Tag260 = 260aa 融合信號序列I = 內(nèi)部N = N-端C = 可選的 C-端E = 腸激酶蛋白酶酶切位點(diǎn)： T = 凝血酶X = Xa 因子操作手冊TB055 第 10 版默克中國技術(shù)咨詢上海代表處 北京代表處 廣州代表處Novagenbioteammerck-7pET-3 a-dpET-9 a-dNNpET-11a-dpET-12a-cNpET-14bpET-15bNNTTpET-16bpET-17bNNXpET-17xbpET-19bN

27、NEpET-20b(+)pET-21a-d(+)CCNpET-22b(+)pET-23a-d(+)CCNpET-24a-d(+)pET-25b(+)CCNCpET-26b(+)pET-27b(+)CCCpET-28a-c(+)pET-29a-c(+)N,CCINTTpET-30a-c(+)pET-30 Ek/LICN,CN,CIIT,ET,EpET-30 Xa/LICpET-31b(+)N,CCINT,XpET-32a-c(+)pET-32 Ek/LICI,CI,CIINNT,ET,EpET-32 Xa/LICpET-33b(+)I,CN,CIINIT,XTpET-34b(+)pET-35b(

28、+)CCIINNT,ET,XpET-36b(+)pET-37b(+)CCIINNT,ET,XpET-38b(+)pET-39b(+)CI,CIICNTT,EpET-40b(+)pET-41a-c(+)I,CI,CIINNT,ET,EpET-41 Ek/LICpET-42a-c(+)I,CI,CIINNT,ET,XpET-43.1a-c(+)pET-43.1Ek/LICI,CI,CI IC CN NT,ET,EpET-44a-c(+)N,I,CICIT,EpET System Manual系統(tǒng)介紹LIC = 不需連接反應(yīng)的克隆E. pET 載體克隆策略將編碼蛋白的DNA 克隆到pET 載體上有多

29、種策略。利用多克隆位點(diǎn)中的特定限制性酶切位點(diǎn)或非連接反應(yīng)依賴性克隆方IC)能很方便地完成克隆。LIC 方法不需要進(jìn)行限制性酶切及連接反應(yīng)，LIC片段可以被迅速地克隆到多功能LIC 載體上，適用于高通量克隆。所有 pET 載體圖譜可以參閱所有 pET 翻譯載體在克隆和相關(guān)信息。區(qū)域后以 3 種閱讀框形式提供翻譯終止子以及下游T7 轉(zhuǎn)錄終止子。終止子對于大多數(shù)蛋白的高效表達(dá)并非必要，但對于一些帶有方向與目的一致的氨芐抗性(-內(nèi)酰胺酶) 的pET 質(zhì)粒情況就不同了。如果 T7 轉(zhuǎn)錄終止子在克隆時被去掉，就會出現(xiàn)隨目的蛋白增加，IPTG 依賴的 -內(nèi)酰胺酶(Mr 31.5 kDa)累積的情況，因?yàn)檫@時

30、 T7 RNA 聚合酶造成高效通讀轉(zhuǎn)錄。不同 pET 載體在鄰近克隆位點(diǎn)處具有編碼不同的多肽“”的序列，在、檢測或純化目的蛋白時提供方便。選用的克隆方式將決定這些“”或載體的附加氨基酸是否與目的蛋白一起融合表達(dá)。后續(xù)章節(jié)將介紹幾種融合或非融合表達(dá)的克隆方法。不帶融合的天然蛋白幾乎所有pET 載體都能表達(dá)不帶載體編碼序列的蛋白。許多載體提供一個 Nde I 或 Nco I位點(diǎn)，以便在編碼序列 5'-端克隆進(jìn) AUG 起始子。與此類似，在片段中帶上翻譯終止子，就可以避免在蛋白的 C-端帶有載體編碼序列。在許多 pET 載體中，Nco I位點(diǎn)(CCATGG)中的 ATG 三聯(lián)子編碼T7 RN

31、A 聚合酶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物N-端甲硫氨酸 AUG 起始子。任何目的或 PCR的片段，若在開放閱讀框的起始位置帶有 Nco I 位點(diǎn)或與 Nco I 匹配的粘末端 BspH I (TCATGA)，BspLU11 I (ACATGT)，以及 AflIII (ACRYGT)和 Sty I (CCWWGG) ，均可克隆入 Nco I 位點(diǎn)。注意，如果目的內(nèi)部編碼多個相同酶切位點(diǎn)，使用這些限制性酶切位點(diǎn)將十分復(fù)雜。此外，若每個限制性酶切位點(diǎn)作為下一個三聯(lián)子的第一個核苷酸，可能無法得到天然蛋白。如果是這種情況，可以考慮采用某些限制性酶切去識別位點(diǎn)“下游”序列，以期得到天然目的蛋白(見下表)。酶 (同裂酶)識別及切

32、割位點(diǎn)產(chǎn)生的粘端(參見pET 載體特點(diǎn)總表，第 7 頁)Bbs I (Bpi I, BI)5-GAAGAC(N)2 33-CTTCTG(N)6 -5GAAGA CTTCTGNNNNNNNNNNNNBsa I (Eco31 I)5-GGTCTC(N)1 -33-CCAGAG(N)6 -5GGTCTCNNNNNNCCAGAGNNNNNNBsmB I (Esp3 I)5-CGTCTC(N)1 -33-GCAGAG(N)5 -5CGTCTCNNNNNNGCAGAGNNNNNNBspM I5-ACCTGC(N)4 33-TGGACG(N)8 -5ACCTGNNNNNNNTGGACGNNNNNNNNN任何

33、上述限制性酶切位點(diǎn)都可以通過 PCR 引物設(shè)計(jì)得到，從而獲得與 Nco I匹配的粘端。要注意的是，和許多采用限制性酶切消化策略一樣，如果目的方法的使用就會受到一定的限制。但是，不太可能某個編碼完全雷同酶切位點(diǎn)時，這種簡便片段同時包含以上 4 種酶位點(diǎn)。默克中國操作手冊 TB055 第 10 版技術(shù)咨詢上海代表處北京代表處廣州代表處bioteammerck- Novagen8pET System Manual系統(tǒng)介紹以蛋白酶切去融合的天然蛋白GSTTag pET -41a-c(+)，42a-c(+)和 NusTag pET-43.1a -c(+)，pET-44a-c(+)載體上，在編碼Xa 因子

34、，腸激酶或凝血酶酶切位點(diǎn)序列內(nèi)帶有 PshA I 或 Sma I 限制性酶切位點(diǎn)。利用這些產(chǎn)生平末端的限制性酶(如下圖示)，Xa 因子、腸激酶或凝血酶即可從融合蛋白上切去所有載體編碼序列。凝血酶的酶切效率會受到緊鄰酶切位點(diǎn)的氨基酸影響。選用非極性或非酸性氨基酸作為起始 的 2 到 3 個氨基酸有利于提高凝血酶酶切效率(Chang，1985；Le Bonniec，1991；Le Bonniec， 1996)。不需連接反應(yīng)的克隆方IC)LIC 是設(shè)計(jì)用于不需限制性酶切和連接反應(yīng)而定向克隆PCR產(chǎn)物的方法(Aslanidis and de Jong，1990；Haun.，1992)。用 LIC備的p

35、ET 載體有不互補(bǔ)的 1215 堿基單鏈粘端，與目的插片段的引物 5'序列要與LIC 載體互補(bǔ)。T4 DNA 聚合酶的入片段上相應(yīng)粘端互補(bǔ)。擴(kuò)增目的3'? 5'外切活性經(jīng)短時間即可在片段上形成單鏈粘端。由于只能由好的片段和載體互相退火形成產(chǎn)物，這種方法非?？焖俑咝?，而且為定向克隆。pET LIC 載體上所有載體編碼的氨基酸序列都可以通過腸激酶或Xa 因子去掉。LIC克隆策略詳見操作手冊TB163 和 T B205。操作手冊TB055 第 10 版默克中國技術(shù)咨詢上海代表處 北京代表處 廣州代表處Novagenbioteammerck-9pET System Manual

36、系統(tǒng)介紹F. pET 系統(tǒng)蛋白表達(dá)的調(diào)控即使在沒有 IPTG 存在的情況下，也會有少量 lacUV5 啟動子表達(dá)的 T7 RNA聚合酶，因此存在目的蛋白的本底表達(dá)。任何重組蛋白在 E. coli 內(nèi)表達(dá)都會或多或少地影響宿主的正常功能，并對宿主產(chǎn)生“毒性”。不同的外源蛋白毒性也不同。如果目的產(chǎn)物對 E. coli 毒性極大，這種本底表達(dá)就足以阻礙細(xì)胞生長以及影響在 DE3 溶原菌中質(zhì)粒的穩(wěn)定性。pET 系統(tǒng)功能非常強(qiáng)大，你可以根據(jù)目的蛋白的特點(diǎn)，通過選用 T7/T7lac 啟動子，pLysS 或 pLysE宿主菌，以及培養(yǎng)基外加葡萄糖等方法嚴(yán)緊蛋白表達(dá)水平。也要注意，不要因?yàn)檫^度造成表達(dá)水平過

37、低。因此，仔細(xì)了解下列工具的功能特點(diǎn)，以及根據(jù)實(shí)際經(jīng)驗(yàn)為特定目的蛋白表達(dá)選擇這些工具，兩方面都很重要。T 7lac 啟動子基礎(chǔ)表達(dá)的之一是采用帶有 T7lac 啟動子的載體 (Studier.，1990；Dubendorff andStudier，1991；見第 7 頁表)。這些質(zhì)粒在緊鄰T7 啟動子的下游有一個 lac子序列。它們同樣帶有常規(guī)啟動子以及編碼 lac 阻遏蛋白(lacI)的序列，T7lac和 lacI 啟動子位置交錯。采用這種載體及DE3 溶原菌， lac 阻遏蛋白可以作用于宿主lacUV5 啟動子，抑制宿主聚合酶轉(zhuǎn)錄 T7RNA 聚合酶，也作用于載體 T7lac 啟動子，以阻

38、斷任何 T7 RNA 聚合酶導(dǎo)致的目的轉(zhuǎn)錄。只有極少數(shù)毒性極大的目的造成質(zhì)粒在 BL21 (DE3)或 HMS174 (DE3)中不穩(wěn)定 (Dubendorff andStudier，1991)。注意：結(jié)合 pLysS 或 pLysE 宿主菌，蛋白表達(dá)有被過度調(diào)節(jié)的可能(見載體與宿主菌共同影響表達(dá)水平，見本頁)。pLysS 和pLysE 宿主菌另一個為目的提供穩(wěn)定性保證的方法是在擁有兼容的氯霉素抗性、編碼表達(dá)少量 T7溶菌酶（T7 RNA 聚合酶天然抑制物）的宿主菌中表達(dá)(Moffatt and Studier，1987；Studier，1991)。T7 溶菌酶是一種雙功能蛋白：它能夠切割大腸

39、桿菌細(xì)胞壁肽聚糖層(Inouye.，1973)，它也可與T7RNA 聚合酶結(jié)合，轉(zhuǎn)錄(Zhang and Studier，1997；Huang.，1999)。T7 溶菌酶由克隆到pACYC184BamH I 位點(diǎn)的 T7 溶菌酶供給細(xì)胞(Chang and Cohen，1978)。克隆片段(T7 DNA 的10,66511,296bp ；Dunn and Studier，1983)在緊鄰溶菌酶處還有 T7 RNA 聚合酶? 3.8promoter啟動子。由pACYC184 的 tet 啟動子的溶菌酶，按這種序列排列的質(zhì)粒被稱為p LysE，帶有這種質(zhì)粒的菌株會高水平積累溶菌酶。序列反向排列的質(zhì)

40、粒被稱為 pLysS；帶有這種質(zhì)粒的細(xì)胞積累溶菌酶的水平要低得多。注意，從 pLysS宿主菌表達(dá)溶菌酶同樣受培養(yǎng)條件影響。因?yàn)樯嫌蔚腃AT 抗生素抗性由一個代謝產(chǎn)物抑制敏感啟動子調(diào)節(jié)，pLysS 宿主菌在沒有葡萄糖生長到平穩(wěn)期時會產(chǎn)生高水平 cAMP 和更高的 CAT 啟動子活性。而當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)到平穩(wěn)期時，高 CAT 啟動子活性會提高溶菌酶水平(Novy and Morris，2001)。而如果 T7 溶菌酶是由克隆提供的，大腸桿菌的耐受水平相對較高 (例如細(xì)胞法穿過細(xì)胞內(nèi)膜到達(dá)肽聚糖層。裂解)，這顯然是因?yàn)楸磉_(dá)出的蛋白無兩種溶菌酶質(zhì)粒都干擾對含有該種質(zhì)粒細(xì)胞的轉(zhuǎn)化；pLysS對細(xì)胞生長影響很小

41、，而 pLysE會明顯降低宿主菌的生長水平。pLysE提供的高水平的溶菌酶會大幅度增加蛋白表達(dá)的滯后時間，降低通過誘導(dǎo) T7 RNA 聚合酶表達(dá)目的的最高水平。含有相對無害的目的的宿主細(xì)胞可以在IPTG 存在下持續(xù)生長，pLysE 對這些細(xì)胞蛋白表達(dá)的有效阻滯作用在某些情況下是一個有用的特點(diǎn)。pLysS和 pLysE 溶原菌對帶毒性的載體的耐受性有所提高：不穩(wěn)定的質(zhì)粒變得穩(wěn)定，無法構(gòu)建的質(zhì)粒能夠獲得和表達(dá)。pLysE 造成細(xì)胞生長緩慢并有裂解傾向，在大多數(shù)情況下使用不便。對于毒性極大的，帶有T7lac 啟動子的質(zhì)粒和 pLysS宿主菌是最佳選擇。有pLysS (或 pLysE)存在時細(xì)胞抽提物

42、特別方便。目的蛋白表達(dá)后，收集細(xì)胞并重懸于 50mM Tris-HCl，2 mM EDTA，pH 8.0 緩沖液。簡單凍融，或加入 0.1% Triton X-100，細(xì)胞內(nèi)的 T7 溶菌酶即可有效裂解細(xì)胞。PopCulture 和 BugBuster 蛋白抽提試劑可以幫助帶有pLysS 和pLysE 質(zhì)粒的菌株充分蛋白。這個特點(diǎn)使帶有pLysS質(zhì)粒的細(xì)胞在即使不特別要求目的質(zhì)粒穩(wěn)定性的情況下，仍然不失為一種不錯的選擇。注意，在利用重組子帶有信號序列分離細(xì)胞周質(zhì)部分蛋白時，建議不使用 pLysS 或pLysE 質(zhì)粒 (因?yàn)樗拗鳟a(chǎn)生的T7 溶菌酶會使細(xì)胞膜)。載體與宿主菌共同影響表達(dá)水平實(shí)際操作

43、中，通常需要嘗試多種不同載體/宿主菌組合以期獲得擁有正確結(jié)構(gòu)的目的蛋白的高水平 表達(dá)。當(dāng)使用“普通”T7 啟動子時，pLysS 提供的低水平溶菌酶對T7 RNA 聚合酶誘導(dǎo)后的目的蛋白表達(dá)影響很小，只是在出現(xiàn)目的產(chǎn)物時有短時延滯。顯然，產(chǎn)生的 T7 RNA 聚合酶比被少量溶菌酶抑制的要多。(估計(jì)誘導(dǎo)時溶菌酶水平有所提高，因?yàn)門7 RNA 聚合酶能夠開始使 pLysS質(zhì)粒完全轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生溶菌酶 mRNA。但是，3.8 啟動子是相對較弱的啟動子 (McAllister etal.，1981)，主要轉(zhuǎn)錄仍然來自于目的質(zhì)粒采用的強(qiáng)啟動子 10。) 當(dāng)采用 T 7lac 啟動子時，我們觀默克中國操作手冊 T

44、B055 第 10 版技術(shù)咨詢上海代表處北京代表處廣州代表處bioteammerck- Novagen10pET System Manual系統(tǒng)介紹察到特定誘導(dǎo)條件下，pLysS宿主菌中的表達(dá)水平比非 pLysS 宿主菌相對較低。具體實(shí)例見Mierendorf 等 1994年綜述，兩個目的蛋白在不同 T7/T7lac 啟動子和pLysS 及 pLysE 宿主菌中的表達(dá)差異比較。含葡萄糖的培養(yǎng)基Grossman 等(1998)首次描述，培養(yǎng)基中添加葡萄糖可以維持pET 系統(tǒng)中低水平本底表達(dá)。當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞到達(dá)穩(wěn)定期時， 葡萄糖會作為第一碳源首先被利用，而后才是甘油等碳源。替代碳源的代謝導(dǎo)致lDE3

45、溶原菌AMP (cAMP) 水平提高，從而刺激 lacUV5 啟動子指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，T7 RNA 聚合酶表達(dá)。與野生型 lac 啟動子相比， lacUV5 啟動子對cAMP 刺激不如野生型敏感(Eron andBlock，1971；Fried and Crothers，1984)。但研究顯示，足夠的刺激可以提高 T7 RNA 聚合酶水平，繼而 T7 啟動子調(diào)的表達(dá)(Kelley，1995；Grossman.，1998；Pan and Malcom，2000；Novy and Morris，2001)。已觀察到當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入穩(wěn)定期時，在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中補(bǔ)充加入葡萄糖，lacUV5 啟動子帶來的本底表達(dá)大幅度

46、下降(Grossman Novy and Morris，2001)。.，1998；Pan and Malcom，2000；最低限度的本底表達(dá)對于pET 載體在不帶有 pLysS 質(zhì)粒的宿主菌中表達(dá)性時，要生長達(dá)到穩(wěn)定期(16 h 或過夜培養(yǎng))就更是如此 (Grossman，特別是當(dāng)目的., 1998; Novy andMorris, 2001)。沒有了來自 pLysS 質(zhì)粒的 T7 溶菌酶，細(xì)胞穩(wěn)定期本底表達(dá)水平就會提高。如果外性，在液體培養(yǎng)基和瓊脂平板中加入0.51%葡萄糖以維持質(zhì)粒穩(wěn)定是非常必要的。包源含 pLysS 質(zhì)粒的宿主菌達(dá)到穩(wěn)定期時溶菌酶表達(dá)水平較高，而目的蛋白表達(dá)水平降低。造成

47、這種情況的溶菌酶可能是CAT啟動子在沒有葡萄糖時也對 cAMP 刺激敏感，而且位于 pLysS 的 T7 的上游(Novy and Morris, 2001)。注意：在非表達(dá)宿主菌中進(jìn)行克隆步驟時，不必要也不建議外加葡萄糖。雖然細(xì)菌生長到穩(wěn)定期 時不建議這樣做，葡萄糖可以維持 pET 系統(tǒng)在lDE3 宿主菌中最低水平本底表達(dá)目的蛋白，T7 溶菌酶過表達(dá)。pLacI宿主菌特別的(DE3)pLacI 表達(dá)菌株只用于高拷貝質(zhì)粒，如 pETBlue 和 pTriEx (1.1，2，3 及 4)系列載體。這種宿主菌由共生的pLacI 質(zhì)粒提供 lac 阻遏蛋白以保證非誘導(dǎo)條件下的嚴(yán)緊抑制。p ETBlu

48、e和 pTriEx不帶有 lac 阻遏蛋白，要求宿主菌提供 lac 阻遏蛋白。請參考 pETBlue 系統(tǒng)操作手冊(TB249)和 pTriEx系統(tǒng)操作手冊(TB250)了解 pLacI 宿主菌的使用。pETcoco 系統(tǒng)另一個降低lDE 溶原菌本底表達(dá)的辦法是采用 pETcoco載體。這類載體通常以單拷貝存在于細(xì)胞中，而一般pET 載體常常是每個細(xì)胞2050 拷貝。在只有一個拷貝的情況下，目的變得十分穩(wěn)定，重組和重排的可能極小，減少了本底轉(zhuǎn)錄水平，僅相當(dāng)于 pET 載體的 1/40。以IPTG誘導(dǎo)pETcoco 重組蛋白表達(dá)，表達(dá)水平則與 pET 相近。詳細(xì)信息參閱Sektas and Sz

49、ybalski，2002以及操作手冊 TB333。用于克隆的宿主菌G.如前所述，pET 系統(tǒng)功能強(qiáng)大，特性之一是能夠?qū)⒛康目寺≡谵D(zhuǎn)錄活性極低的條件下，即缺乏 T7 RNA 聚合酶來源的情況下。由于宿主 T7 RNA 聚合酶不是來源于 T7 啟動子，所以在缺乏T7 RNA 聚合酶時，pET 質(zhì)粒上處于大腸桿菌 T7 啟動子轉(zhuǎn)錄通讀（如果存在）區(qū)域的克隆序列僅會有微弱轉(zhuǎn)錄，本底表達(dá)水平極低。盡管少數(shù)情況下 (例如無毒目的蛋白)，可以直接將重組子克隆到表達(dá)宿主菌中，一般不建議采用這種策略。即使 pET 載體上的T7 啟動子只是造成低水平本底表達(dá)，通常也會造成宿主生長以及表達(dá)宿主中質(zhì)粒不穩(wěn)定。用于克隆的宿主菌通常是K12 系列 NovaBlue，JM109 以及 DH5 a。這些菌株是 recA endA 型， 轉(zhuǎn)化效率很高，且質(zhì)粒產(chǎn)量高，適合用于保存帶有克隆目的的pET 載體。NovaBlue 還有另外的優(yōu)點(diǎn)，由于帶有可供篩選的F 因子，便于輔助噬菌體，NovaBlue 還可以用于突變的單鏈 DNA (只適合質(zhì)粒上帶有 f1區(qū)的情況)。請注意，pET 載體不編碼 lacZ a-肽，因此也沒有藍(lán)/白斑篩選功能。如果要求 T7 表達(dá)載體具有藍(lán)/白斑篩選功能，