六六六微生物降解途徑的研究進(jìn)展-1

1、101112131415161718192021222324252627282930313233343536373839六六六微生物降解途徑的研究進(jìn)展曹禮張浩黃科谷濤洪青李順鵬(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)環(huán)境微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室南京210095)摘要：六六六是一種曾在世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用的有機(jī)氯殺蟲劑,具有高毒性和長(zhǎng)殘留性,在興旺國(guó)家被限制或禁止使用,但是一些開(kāi)展中國(guó)家和地區(qū)仍然被繼續(xù)使用.即使在一些停用六六六多年的國(guó)家,六六六的殘留依然存在.本文概述了六六六的各同分異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)、六六六降解菌的多樣性和六六六四種主要同分異構(gòu)體(a-、0-、丫-、6-HCH)的微生物降解的最新研究進(jìn)展,為六六

2、六污染地區(qū)進(jìn)行經(jīng)濟(jì)可行的生物修復(fù)提供參考.關(guān)鍵詞：六六六；降解途徑；lin基因；高殘留AdvancesinmicrobialdegradationpathwayofhexachlorocyclohexaneCaoLiZhangHaoHuangKeGuTaoHongQingLiShunpeng(DepartmentofMicrobiology,KeyLabofAgriculturalEnvironmentalMicrobiology,MinistryofAgriculture,CollegeofLifeSciences,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing2

3、10095)Abstract:Hexachlorocyclohexane(HCH)isanotorioushalogenatedorganicinsecticide,whichwasonceusedwidelythroughouttheworldforagriculturalandpublichealthpurposes.Hexachlorocyclohexane(HCH)isabroadspectruminsecticidestillusedasacheapbuteffectiveinsecticideinsomeofthedevelopingcountries,thoughdevelope

4、dcountrieshavebannedorcurtaileditsusebecauseofitshightoxicityandrecalcitrantpersistenceintheenvironment.EveninthosecountrieswheretheuseofHCHhasbeendiscontinuedforanumberofyears,theproblemofresiduesofallisomersofHCHremainsbecauseofitspersistence.Inthisarticle,wesummarizedtheconfigurationofHCH-isomers

5、,thediversityofmicroorganismsdegradingHCH,thecurrentprogressregardingmainlyfourHCH-isomers(a-,-,-andS-HCH)biodegradationpathway.Keywords:Hexachlorocyclohexane；Degradationpathway；lingenes；Highpersistence基金工程：國(guó)家自然科學(xué)基金工程(No.31070099);*通訊洪青,Tel:86-25-84398685,E-mail:_E-mail:作者簡(jiǎn)介：曹禮(1977-

6、),男,安徽阜陽(yáng)人,博士研究生,研究方向?yàn)榄h(huán)境微生物學(xué)與環(huán)境工程.caolicldryahoo1234567891011121314151617181920六六六又名六氯環(huán)己烷(hexachlorocyclohexane,HCH),是一種有機(jī)氯殺蟲劑,在上個(gè)世紀(jì)七十年代前在世界范圍內(nèi)被廣泛使用1-5.六六六在環(huán)境中的自然降解緩慢,在環(huán)境中的半衰期長(zhǎng)達(dá)幾十年,甚至上百年,所以六六六的三種異構(gòu)體(優(yōu),3科丫HCH)于2021年被聯(lián)合國(guó)環(huán)境規(guī)劃署(UnitedNationsEnvironmentProgramme,簡(jiǎn)稱UNEP)列入持久性有機(jī)污染物(persistentorganicpollutan

7、ts,簡(jiǎn)稱POPs)名單6.在工業(yè)上,六六六通過(guò)苯和氯氣在紫外線照射下合成而得,它是一種含有各種異構(gòu)體的混合物,被稱為工業(yè)級(jí)六六六3.工業(yè)級(jí)六六六理論上有8種同分異構(gòu)體,圖1為a-、伊、丫、8-、匕、Y-和0-HCH的結(jié)構(gòu),這些異構(gòu)體由于氯原子在環(huán)己烷環(huán)上不同的空間排列而有不同的性質(zhì)7.但是我們通常所說(shuō)的六六六異構(gòu)體一般包括五種異構(gòu)體,即的HCH(6070%),3-HCH(5-12%),丫HCH(10-12%),&HCH(6T0%)和&HCH般不包括在所謂的六六六總量?jī)?nèi)o(3-4%)6,其他三種異構(gòu)體由于含量極少又不重要,圖1六六六七種主要的異構(gòu)體的氯原子在環(huán)己烷環(huán)上的空間排列FIG.1Axi

8、alversusequatorialarrangementsofchlorineatomsinthefivemajorisomersofHCHplusthelesscommon汁andO-isomers.Notethata-HCHalsoexistsintwoenantiomeric(+and)forms.六六六的廣譜毒性和長(zhǎng)殘留性引起世界范圍內(nèi)廣泛關(guān)注.Weber等5科學(xué)家在2021年估計(jì),全世界共合成了400600萬(wàn)噸六六六釋放到環(huán)境中,在規(guī)模上相當(dāng)于其它所有持續(xù)性有機(jī)污染物(POPs)釋放數(shù)量的總和.據(jù)報(bào)道,六六六異構(gòu)體的殘留在世界許多國(guó)家的空氣、水、土壤、食物、牛奶、魚類和哺乳動(dòng)物中被

9、檢出,甚至人的血液和脂肪組織123456789101112131415161718192021222324252627282930中,也有六六六殘留8-9.即使一些遠(yuǎn)離六六六生產(chǎn)和使用基地,甚至從來(lái)沒(méi)有生產(chǎn)和使用過(guò)六六六的地方,諸如北極、南極和太平洋的環(huán)境中也被檢測(cè)出有六六六的殘留8-9.雖然六六六已經(jīng)在很多國(guó)家和地區(qū)被限制生產(chǎn)和使用,但是在印度和一些熱帶國(guó)家與地區(qū),六六六仍然在生產(chǎn)使用6,所以它在全世界的殘留污染問(wèn)題依然存在.在六六六微生物降解途徑的研究方面,主要的四種異構(gòu)體均取得了不同程度的進(jìn)展.其中yHCH與0C-HOH的微生物降解途徑已被說(shuō)明,3HCH和*HCH微生物降解的研究是目前環(huán)

10、境微生物研究領(lǐng)域的熱點(diǎn),而-HCH的微生物降解途徑研究較少而未見(jiàn)報(bào)道.1降解六六六的微生物通過(guò)微生物對(duì)六六六污染環(huán)境進(jìn)行生物修復(fù)一直是世界各國(guó)環(huán)境工作者關(guān)注的焦點(diǎn).通過(guò)富集培養(yǎng)別離出許多能夠降解hch的微生物,包括細(xì)菌、真菌等410.第一株被報(bào)道的好氧六六六降解菌是在十九世紀(jì)八十年代由日本科學(xué)家別離獲得,然后其它國(guó)家也陸續(xù)有相關(guān)菌株的報(bào)道和研究.&hch的微生物降解研究較少,其降解微生物和降解途徑未見(jiàn)報(bào)道.目前好氧降解菌雖然來(lái)自全球不同,但大多數(shù)集中在Sphingobium.第一株被報(bào)道的好氧降解菌是在十九世紀(jì)八十年代由日本科學(xué)家別離獲得,然后其它國(guó)家也陸續(xù)開(kāi)展研究.目前大局部對(duì)六六六降解的研

11、究主要集中在30個(gè)菌株中的三株4:從日本別離到的SphingobiumjaponicumUT2611,從法國(guó)別離至U的SphingobiumfrancenseSp+12和從印度別離到的SphingobiumindicumB90A13最初將這三株菌株均鑒定為Sphingomonaspaucimobilis,直到2005年才將它們重新鑒定為Sphingobium屬的三個(gè)新種14.其它六六六的降解菌,分別別離篩選于德國(guó)、西班牙、中國(guó)、日本和印度等被六六六污染的土壤中4,這些六六六的降解菌,在六六六降解的早期階段有不同的底物特異性.國(guó)內(nèi)報(bào)道的六六六菌株主要有BI菌株15和Sphingomonassp.

12、BHC-A菌株16.2六六六的厭氧微生物降解途徑的研究進(jìn)展有關(guān)六六六的厭氧降解的報(bào)道始于十九世紀(jì)六十年代,隨后厭氧降解六六六各種異構(gòu)體的微生物也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)410,最初認(rèn)為六六六的生物降解主要是一種厭氧的過(guò)程,并且“、3、丫和8異構(gòu)體的六六六的生物降解也被發(fā)現(xiàn),由于e異構(gòu)體的六六六在環(huán)境中相對(duì)而言最不穩(wěn)定,至今仍沒(méi)有報(bào)道e異構(gòu)體的六六六的厭氧降解.在六六六厭氧降解途徑中,不同的異構(gòu)體通過(guò)一系列厭氧反響最終生成苯或氯苯17-19如圖2.目前已有報(bào)道苯的厭氧礦化20-21,雖然苯和氯苯在好氧條件下很容易被礦化,但是氯苯的厭氧礦化依然未見(jiàn)報(bào)道.據(jù)我們所知,沒(méi)有任何厭氧降解六六六的相關(guān)基因和酶被報(bào)道.而

13、好氧降解六六六的相關(guān)基因lin基因已經(jīng)被別離并成功異源表達(dá),并逐漸引起政府部門、企業(yè)和科研機(jī)構(gòu)的關(guān)注,以開(kāi)展生物修復(fù)技術(shù)去改造被六六六污染的地區(qū).圖2伊和HCH厭氧代謝途徑FIG.2Consensusanaerobicdegradation5B-HCHlriEemiedidL.epathwayof伊andrHCH.Notethattwointermediatesthathavebeenproposedbutnotyetobservedempiricallyareshowninsquarebrackets.ThestructuresofTCCHandDCCHareshownintheplanar

14、formatbecausetheirstereochemistrieshavenotbeenestablished.89 3r和“-六六六的好氧微生物降解途徑的研究進(jìn)展10 丫HCH降解途徑及其相關(guān)基因的研究是上世紀(jì)九十年代以來(lái)微生物降解研究的熱點(diǎn).日11 本學(xué)者通過(guò)近十五年的努力首先從SphingobiumjaponicumUT26克隆到了16個(gè)與丫HCH降12 解直接相關(guān)基因,在2005年提出了一條完整的rHCH降解途徑22-23.如圖3,脫氯化氫酶13 基因linA;1,4-TCDN脫氯酶基因linB;2,5-DDOL脫氫酶基因linC和2,5-DDOL14 脫氫酶基因linX組成了rH

15、CH生物降解的上游階段.調(diào)節(jié)基因linR;2,5-DCHQ復(fù)原性15 脫氯酶基因linD;氯代對(duì)苯二酚1,2雙加氧酶基因linE和MA復(fù)原酶基因linF組16 成了丫HCH生物降解的下游階段23LinE和LinEb都有彳t化CHQ生成2,6-DCHQ的活性,17 但是LinE和LinEb在UT26中主要參與CHQ到2,6-CHQ的反響24.編碼琥珀酰輔酶A:3-18 ?；憾彷o酶A轉(zhuǎn)移酶基因linGH、3酮己二酸硫解酶基因linJ以及參與linGH基19因表達(dá)的調(diào)節(jié)基因linI雖然也已經(jīng)被鑒定,但是其表達(dá)類型待定23.20在六六的上游代謝途徑中,有三個(gè)代謝產(chǎn)物,即2,5-DCHQ、1,2,4

16、-TCB和2,5-DCP,21只有2,5-DCHQ可以在下游代謝途徑中進(jìn)一步被轉(zhuǎn)化,而1,2,4-TCB和2,5-DCP不能被22SphingobiumjaponicumUT26進(jìn)一步降解,稱為末端死產(chǎn)物.另外,Sphingobiumjaponicum23UT26中的脫氯化氫酶LinA;1,4-TCDN脫氯酶LinB定位在細(xì)胞的周質(zhì)空間25,而兩24個(gè)末端死產(chǎn)物1,2,4-TCB和2,5-DCP在細(xì)胞的周質(zhì)空間一旦產(chǎn)生,將對(duì)Sphingobium25japonicumUT26細(xì)胞有毒害作用26.現(xiàn)在已經(jīng)證實(shí),在UT26中有四個(gè)基因linKLMN編123456789101112131415161

17、71819碼的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)作為一個(gè)疏水性物質(zhì)尤其對(duì)2,5-DCP的轉(zhuǎn)運(yùn)泵來(lái)解除這種毒害27SphingobiumindicumB90A和Sphingomonassp.BHC-A中也存在類似SphingobiumpaucimobilisUT26的rHCH降解途徑.而關(guān)于“-HCH的降解,目前的報(bào)道顯示六六六的a和丫異構(gòu)體有相似的代謝途徑,只有第一個(gè)脫氯酶催化的反響不同,它和yHCH采用SpontaneousClClClClClClClClClLinA卡HCl中ClLinAClLClHCl4Clsuccinate14ClClHClClClClClClClOHneoH9LinB薪ClOHClJH2

18、OLinBHCl13Spo6HO7OHClsuccinyl-CoACOOHCOOHLinGH15COOHO,、jCO-CoANAD+LinFNADH+H+度、COOHHO-COOHASpontaneou10COOHHOC=OLinEO2HOClGS-SG+HClLinD2GSH+GS-SG+HClOH2GSH12,LinJCoA.COOHCoA16COOH/CH2OO2LinEOHHOOH,NADH+HClOHClClLinCClHOTCAI17CH30CoA相同的途徑28.圖3yHCH在SphingobiumjaponicumUT26中的降解途徑Fig.3Proposeddegradatio

19、npathwaysof-HCHin聲.japonicumUT26.1,-HCH;2,-近氯環(huán)己烯(-PCCH);3,1,3,4,6-四氯-1,4-環(huán)己二烯(1,4-TCDN);4,1,2,4-三氯苯(1,2,4-TCB);5,2,4,5-三氯-2,5-環(huán)己二烯-1-酉I享(2,4,5-DNOL);6,2,5-二氯苯酚(2,5-DCP);7,2,5-二氯-2,5-環(huán)己二烯-1,4-二醇(2,5-DDOL);8,2,5-二氯對(duì)苯二酚(2,5-DCHQ);9,氯代對(duì)苯二酚(CHQ);10,對(duì)苯二酚(HQ);11,酰氯；12,松基己二烯二酸半醛(-HMSA);13,順丁烯乙酸(MA);14,-由己二酸

20、；15,3酮己二酸輔酶A;16,乙酰輔酶A;17,琥珀酰輔酶A;GSH,谷胱甘肽4伊六六六的好氧微生物降解途徑的研究進(jìn)展國(guó)際上對(duì)于3-HCH的微生物降解的研究進(jìn)展較為緩慢.已別離出的六六六降解菌中,12345678910111213141516171819202122232425262728大多數(shù)對(duì)于“和丫異構(gòu)體具有良好的降解效果,而對(duì)于3異構(gòu)體那么沒(méi)有降解效果,在少數(shù)的報(bào)道的可以降解3異構(gòu)體的細(xì)菌中,大多數(shù)對(duì)于3異構(gòu)體的降解又極為緩慢,例如SphingobiumjaponicumUT26,在使用高濃度的細(xì)胞時(shí)才能表現(xiàn)出對(duì)3異構(gòu)體極微弱的降解水平29.SphingobiumindicumB90

21、A是目前報(bào)道的具有較強(qiáng)降解水平的菌株30.最近,在研究3異構(gòu)體的降解基因方面獲得了突破,研究發(fā)現(xiàn)在SphingobiumjaponicumUT26中的linB基因編碼的酶LinB可以催化伊HCH轉(zhuǎn)化為伊五氯環(huán)己醇PCHL,而PCHL那么作為終產(chǎn)物不能再被LinB催化B解29.Sphingomonassp.BHC-A對(duì)六六六的四種異構(gòu)體都有很好的降解效果16,如圖4,從中克隆到的linB基因linB2編碼的酶LinB2不僅可以轉(zhuǎn)化&HCH為&PCHL,同時(shí)也可以繼續(xù)催化3-PCHL的轉(zhuǎn)化,形成終產(chǎn)物3-TDOL31o除此之外,還未見(jiàn)其它關(guān)于,HCH的微生物降解方面的報(bào)道.ClOHOH圖43HCH

22、在Sphingomonassp.BHC-A中的降解途徑Fig.4Proposedinitialpathwayfor-HCHdegradation.Compounds:1-HCH,2-PCHL,3-TDOL5六六六的好氧微生物降解途徑的研究進(jìn)展在六六六四種異構(gòu)體的微生物降解方面,&HCH是目前研究的最模糊的異構(gòu)體.主要是一些在厭氧環(huán)境下降解方面的報(bào)道32-36.目前國(guó)際上已經(jīng)報(bào)道的可以降解丫HCH的菌株SphingobiumjaponicumUT26,SphingobiumfrancenseSp+1和SphingobiumindicumB90A等雖然在好氧條件下對(duì)&HCH均有不同程度的降解作用,

23、但是&HCH的完整降解途徑還沒(méi)有解析,相關(guān)基因方面的報(bào)道更少.1993年YujiNagata報(bào)道了來(lái)源于UT26菌株的脫氯化氫酶LinA可以轉(zhuǎn)化&HCH為&PCCH37.2001年TrantirekL在研究LinA作用機(jī)理的根底上再次報(bào)道了LinA可以轉(zhuǎn)化&HCH為8-PCCH,并且&PCCH為L(zhǎng)inA轉(zhuǎn)化的終產(chǎn)物38.2006年Sharma等報(bào)道了SphingobiumindicumB90A中的脫氯酶LinB可以轉(zhuǎn)化&HCH為8-PCCH,并繼續(xù)轉(zhuǎn)化為&TDOL39.而在Sphingomonassp.BHC-A中,如圖5,8HCH可以被LinA連續(xù)脫氯化氫,轉(zhuǎn)化為占1,4-TCDN,中間產(chǎn)生

24、&PCCH.同時(shí)反響體系中的這三種物質(zhì)&HCH,&PCCH和8-1,4-TCDN又都可以作為L(zhǎng)inB2的底物,通過(guò)三種不同的脫氯反響被LinB2轉(zhuǎn)化40.這也是*HCH到目前為止文獻(xiàn)報(bào)道的最新進(jìn)展.123456789101112131415ciFig.5.由LinA和LinB2組成的&HCH的降解途徑Fig5Proposeddegradationpathwayof-HCHbySLinAandLinB2.1,8六六六(-HCH);2,8-無(wú)氯環(huán)己烷(-PCCH);3,81,3,4,6-四氯-1,4-環(huán)己二烯(-1,4-TCDN);4,1,2,4-三氯苯(1,2,4-TCB);5,82,3,4,5

25、,6-五氯環(huán)己醇(-PCHL);6,82,3,5,6-四氯-1,4-環(huán)己二醇(3TDOL);7,氾3,5-三氯-5-環(huán)己烯-1,4-二醇(32,3,5-TCDL);8,22,4,5-三氯-2,5-環(huán)己二烯-1-ol(2,4,5-DNOL);9,82,5-二氯-2,5-環(huán)己二烯-1,4-二醇(BDDOL);10,2,5-二氯苯酚l(2,5-DCP).6結(jié)論從六六六開(kāi)始使用到現(xiàn)在6070年的時(shí)間里,六六六的高毒性和長(zhǎng)期的殘留性已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注.在各種去除六六六污染的舉措中,通過(guò)微生物對(duì)六六六污染環(huán)境進(jìn)行的生物修復(fù)因其高效、平安、本錢低、無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)而具有美好的開(kāi)展前景.目前,菌株Sphin

26、gobiumjaponicumUT26和SphingobiumindicumB90A的全基因組測(cè)序已經(jīng)完成,隨著12345678910111213141516171819202122232425262728293031研究的深入,六六六代謝途徑的解析,尤其對(duì)3-HCH和8-HCH代謝途徑的徹底說(shuō)明、六六六新的降解基因的研究、以及降解酶構(gòu)象和動(dòng)力學(xué)的研究等,將會(huì)有新的進(jìn)展,這將大大有助于對(duì)六六六的污染產(chǎn)品或地區(qū)開(kāi)展高效而徹底的修復(fù)工作.參考文獻(xiàn)1 BreivikK,PacynaJM,MunchJ.Useof-,f-hexachlorocyclohexaneinEurope,1970V996J.S

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