大鯢皮膚分泌液中抗菌肽的鑒定及生物活性研究

1、中國(guó)生化藥物雜志ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics201年第32卷第4期269大鯉皮膚分泌液中抗菌肽的鑒定及生物活性研究111,2王利鋒，李學(xué)英，王大忠(1.遵義醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室，貴州遵義563003;2.銅仁學(xué)院，貴州銅仁554300)摘50、G-要：目的鑒定大鯉皮膚分泌液中抗菌肽，研究其部分生物活性。方法5%醋酸浸提和SephadexG-25凝膠過(guò)濾色譜等方法分離純化抗菌肽；采用抑菌圈法檢測(cè)抗菌活性，Tricine-SDS-PAGE電泳和等電聚焦電泳鑒定其抗菌活性成份。結(jié)果大鯉皮膚分泌液中含有抗菌活性物質(zhì)。對(duì)革蘭陰性菌、革蘭陽(yáng)性菌

2、和真菌均具有較強(qiáng)具有較強(qiáng)的堿性。結(jié)論首次從大鯉皮膚分泌的抗菌活性；電泳檢測(cè)顯示該小分子多肽相對(duì)分子質(zhì)量約為4300,液中分離純化到一種抗菌肽，此抗菌肽可能是一個(gè)具有較強(qiáng)陽(yáng)離子特征的堿性肽。關(guān)鍵詞：大鯉；皮膚；抗菌肽；分離純化中圖分類號(hào)：R282.74;R961文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A1678(2011)04-0269-04文章編號(hào)：1005-CharacterizationandbioactivityofantimicrobialpeptidesfromtheskinsecretionsoftheAndriasdavidianus2WANGLi-feng1,LIXue-ying1,WANGDa-zhon

3、g1,(1.DepartmentofCellBiologyandGenetics,ZunyiMedicalCollge,Zunyi563003,China；2.TongrenUniversity,Tongren554300,China)Abstract:PurposeTocharacterizetheantimicrobialpeptidesfromtheskinsecretionsoftheAndriasdavidianusandtostudyitsbioactivity.MethodsThisantimicrobialpeptidewaspurifiedby5%aceticacidextr

4、actionandSephadexG-50G-25gelfiltrationchromatography.Theantimicrobialabilitywaschar-acterizedbyinhibitingzonedetermination.Theantimicrobialactivesubstancewasidentifiedbytricine-SDS-PAGEelectrophoresisandisoelectricfocusing(IEF)electrophoresisResultsTheskinsecretionsofnegativeGram-posi-theAndriasdavi

5、dianuscontainantibioticactivesubstanceItstronglyinhibitedGram-tivebacteriaandfungusTheelectrophoresisresultsshowedthatitsmolecularweightwasabout4300withastrongalkalineproperty.ConclusionAnantibacterialpeptidewasisolatedfromtheskinsecretionsoftheAndriasdavidianusforthefirsttimeandthisantimicrobialpep

6、tidemaybeastrongfeatureofthebasicpeptidecationKeywords:Andriasdavidianus；skin；antimicrobialpeptide;purification兩棲類皮膚濕潤(rùn)、裸露，無(wú)疑給外界微生物的侵入提供了便利條件，為了自身生存和適應(yīng)棲息地多樣化生態(tài)環(huán)境的需要，它們依靠皮膚腺體分泌出一1系列抗菌肽，防御外界病原菌的侵襲。相關(guān)研究結(jié)果顯示，兩棲類皮膚抗菌肽呈現(xiàn)出超乎想象的分05-20收稿日期：2010-基金項(xiàng)目：貴州省教育廳自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（黔教科2007039）;貴州省高層次人才科研條件特助經(jīng)費(fèi)（TZJF-2007049）E

7、-作者簡(jiǎn)介：王利鋒，男，碩士研究生，主要從事生物制藥研究，mail:24102989；王大忠，男，通信作者，博士，教授；李學(xué)英，女，通信作者，教授。子和功能的多樣性2-30國(guó)內(nèi)外對(duì)于兩棲類皮膚抗菌肽的研究主要集中在無(wú)尾目?jī)蓷?，例如最廣泛它們皮膚抗菌肽在種類和數(shù)分布的蛙科（Ranidae）,4量等方面，都是極其驚人的。而對(duì)于有尾目?jī)蓷?，除紅噱疣嫄（Tylototritonverrucosus）和山溪6目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道其皮鯉（Batrachuperus外，膚分泌液存在抗菌活性物質(zhì)。大鯉（MegalobatrachusjaponicusdaridianusBlan-chard屬大型兩棲綱有尾目

8、隱鯉鯉科，是我國(guó)二級(jí)保護(hù)動(dòng)物，有活化石之稱。人們?cè)跉W洲、東亞和北美地區(qū)發(fā)現(xiàn)的大約距今300萬(wàn)至7000萬(wàn)年的大鯉化270中國(guó)生化藥物雜志ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics201年第32卷第4期7石暗示其在地球上曾廣泛分布。目前我國(guó)大鯉的人工養(yǎng)殖已經(jīng)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，為從大鯉皮膚分泌液中提取抗菌肽提供了豐富的資源。作為現(xiàn)存?zhèn)€體最大的兩棲類動(dòng)物，其皮膚腺發(fā)達(dá)，在試驗(yàn)中觀察到大鯉皮膚在受到理化刺激時(shí)能分泌大量白色狀黏液，最初呈白漿狀，后漸變?yōu)轲こ砭邼鉂瓪馕丁１緦?shí)驗(yàn)對(duì)大鯉皮膚分泌液中膠狀物，是否含有抗菌活性物質(zhì)進(jìn)行了檢測(cè)，并鑒定其部分性質(zhì)，為進(jìn)一步的研究工作奠定

9、基礎(chǔ)。1材料1.1動(dòng)物和菌種成年大鯉雌雄各一尾，購(gòu)于貴州錦江娃娃魚有限公司。菌種：大腸埃希菌(Escherichiacoli)No.ATCC25922、金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureuSNo.ATCC29213、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermi-di§No.ATCC35984、銅綠假單胞菌(PseudomonasaeruginoSaNo.ATCC27853、白色念珠菌(canidiaAlbicans)No.ATCC10213、溶血性鏈球菌(Hemolyticstreptococcus)No.CMCC(B)32264,遵義醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教

10、研室保藏。1.2試劑50和SephadexG-25GE葡聚糖凝膠SephadexG-Healthcar必司；低相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)標(biāo)準(zhǔn)蛋白，北Tris、京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司；TEMED、Tricine、250,丙烯酰胺、過(guò)硫酸錢、考馬斯亮藍(lán)R-美國(guó)Sigma公司；BCA法蛋白定量試劑盒，上海碧云大MH(A)培養(yǎng)基，北京奧生物公司；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。2方法2.1皮膚分泌液的粗提采用電刺激法誘導(dǎo)大鯉皮膚分泌黏液。按體積4c比1：1將收集到的皮膚分泌液用5%乙酸浸提，下攪拌24h。12000r/min離心30min取上清，用12000r/min離心30磷酸鹽緩沖液調(diào)pH

11、至7.2,min,取上清冷凍干燥，2.2抗菌肽分離純化粗提物用注射用水溶解，截留Mr10000的超濾收集Mr大于10000和小于膜4c下超濾分離，710000兩部分溶液，抑菌圈法篩選有抗菌活性的SephadexG-50®膠色經(jīng)0.45膜過(guò)濾后，溶液，管，測(cè)定A280nm,繪制洗脫曲線，收集各峰。同樣方法篩選具有較強(qiáng)抗菌活性的峰，冷凍干燥濃縮樣品至4.5mL,25凝膠再采用相同方法，進(jìn)行SephadexG色譜(1.6cnriX60cm)分離，得到具有抗菌活性的溶液濃縮后4c保存。2.3蛋白質(zhì)含量檢測(cè)BCA法蛋白定量試劑盒檢測(cè)抗菌肽溶液的蛋白質(zhì)含量，按試劑盒說(shuō)明書操作。2.4電泳鑒定2.

12、4.1Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳分離膠、夾層10%和4%的丙烯酰胺凝膠、濃縮膠分別為16.5%,3種膠長(zhǎng)度比例為4：1.5：1,膠，厚度為0.75mm,陽(yáng)極緩沖液為0.2mol/LTris緩沖液(pH8.9),陰極緩沖液為0.1mol/LTris(內(nèi)含0.1mol/LTricine,0.1%SDS,pH8.25)溶液。每孔上樣量15pL30V恒壓電泳約30min,當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠時(shí)，電壓升至100V約3h。2.4,2等電聚焦電泳按中國(guó)藥典三部(2005版)方法進(jìn)行，不同之處在于配制凝膠時(shí)加入尿素，使最終的電泳膠含33%的尿素?？咕钚詸z測(cè)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、銅

13、2.5綠假單胞菌培養(yǎng)基為MH(A)培養(yǎng)基；溶血性鏈球菌的培養(yǎng)基為在MH(A)培養(yǎng)基中加入10%的脫纖維羊血；白色念珠菌培養(yǎng)基為沙氏葡萄糖蛋白陳瓊中央孔加入注射脂培養(yǎng)基(SDA)o采用抑菌圈法，用水作為陰性對(duì)照，其中一孔加入相應(yīng)抗生素為陽(yáng)37。叵溫培養(yǎng)18h(白色念珠菌28c恒溫性對(duì)照，培養(yǎng)2d),觀察抑菌圈大小。抑菌圈10mm作為樣品最小抑菌濃度的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。2.6溶血活性檢測(cè)微量溶血試驗(yàn)評(píng)估溶血活性。取健康人血液用3000r/min離心生理鹽水洗滌紅細(xì)胞至上清無(wú)色，12min,棄上清，用生理鹽水配成2%紅細(xì)胞懸液，100,50,40,將抗菌肽溶液用生理鹽水稀釋成500,30,20,10pg/m

14、L勺溶液，加入等體積的2%紅細(xì)胞100,陽(yáng)性對(duì)照為0.1%TritonX-陰性對(duì)照為生懸液，37c孵育1h,理鹽水，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行孔，離540nm波長(zhǎng)處測(cè)定心去掉完整的紅細(xì)胞。取上清，各管的吸光度值。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)100仙g/mLM菌肽?§液分50,60,70,80,90,100,121c下處理10別在40,min,冰浴冷卻，以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為試HCl譜(1.6cmX60cm)分離，用0.05mol/L的Tris-緩沖液(pH7.2)平衡色譜柱，樣品上樣后用同樣的流速為2.0mL/8min,每8min收集1緩沖液洗脫，中國(guó)生化藥物雜志Chines

15、eJournalofBiochemicalPharmaceutics201年第32卷第4期271驗(yàn)菌，未處理抗菌肽溶液為對(duì)照，測(cè)定其抑菌圈直徑，每個(gè)處理樣品重復(fù)試驗(yàn)3次，根據(jù)抑菌圈直徑大小確定其熱穩(wěn)定性。2.7.2酸堿穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)1001Ig/mL%菌肽溶液用0.1mol/LHCl溶液或0.1mol/LNaOH溶液調(diào)用磷酸鹽緩沖整樣品pH2.50;室溫放置2h,液將樣品pH值復(fù)調(diào)至7.2,未經(jīng)處理的抗菌肽溶液為對(duì)照，以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為試驗(yàn)菌，每個(gè)處理樣品重復(fù)試驗(yàn)3次，根據(jù)抑菌圈直徑大小確定其酸堿穩(wěn)定性。3結(jié)果3.1大鯉皮膚分泌物中抗菌肽的分離純化Mr小于10000的溶液超濾液抗菌活性檢

16、測(cè)，具有明顯的抗菌活性。SephadexG-50ft色譜分離，得到2個(gè)明顯的主峰(圖1)。抗菌試驗(yàn)表明，第2個(gè)主峰3689管收25柱色譜分集液有明顯的抗菌活性。SephadexG離，得到3個(gè)明顯的峰(圖2)?？咕囼?yàn)表明，第2個(gè)峰1140管收集液有明顯的抗菌活性。.蛋白Marker；2.大鯉皮膚分泌液粗提物；3.SephadexG-5吩離25柱色譜分離后樣品后；4.SephadexG-1ProteinMarker；2.RawsubstanceThesubstanceaftertheSephadex25chroma-G-50chromatographyThesubstanceaftertheSe

17、phadexG-tography圖3Fig.3Tricine-SDS-PAGE電泳ElectrophoresisinTricine-SDS-PAGE3.4抗菌活性檢測(cè)抗菌肽溶液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、銅綠假單胞菌、溶血性鏈球菌和白色念珠菌均有較強(qiáng)的抗菌活性，最小有效抑菌濃度分別為12,16,16,22,16,18pg/mL3.5溶血性檢測(cè)血平板檢測(cè)結(jié)果未見(jiàn)溶血現(xiàn)象。說(shuō)明不同濃度的大鯉皮膚分泌液中抗菌肽溶液對(duì)人血紅細(xì)胞沒(méi)有溶血作用。圖1SephadexG-50765432109876543210,用-V-«*VJIm111oooooooooO凝膠過(guò)濾色譜結(jié)果3.63.

18、6.1穩(wěn)定性試驗(yàn)熱穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。大鯉皮膚分泌液中抗菌肽對(duì)溫度有較好的耐受性，樣品在2040c抗菌活性沒(méi)有變化，100c煮沸10min還有抗121c保持10min后無(wú)抗菌活性0菌活性,圖2SephadexG-25H膠過(guò)濾色譜結(jié)果Fig.4aureus不同溫度處理后的抗菌肽抗菌活性EffectoftheextractsfromtheskinsecretionsoftheAn-driasdavidianusatdifferenttemperatureagainststaphylococcus3.6.2酸堿穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。大鯉皮膚分泌物中抗菌肽在pH5.08.0時(shí)抗菌活性穩(wěn)定，pH9.0

19、以上活性喪失。在pH3.0以下，272中國(guó)生化藥物雜志ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics201年第32卷第4期Temporin-1Ja由于第11位的賴氨酸分子對(duì)比發(fā)現(xiàn)，13殘基被大冬氨酸殘基取代成為陰離子肽。Lai等發(fā)現(xiàn)從大蹊鈴蟾cDNA庫(kù)中篩選至陰勺陰離子抗菌肽maximinH5(ILGPVLGLVSDTLDDVLGIL-NH2)僅具備有限的抗菌活性。本實(shí)驗(yàn)從大鯉皮膚分泌液中得通過(guò)等點(diǎn)聚焦電泳檢測(cè)顯示出較強(qiáng)的到的抗菌肽，圖5Fig.5不同pH處理后抗菌肽的抗菌活性Effectofacidandalkalionantagonisticimpacto

20、ftheex-陽(yáng)離子特征，該小分子肽也是一個(gè)堿性肽，我們推測(cè)其抗菌機(jī)制也可能是通過(guò)細(xì)胞膜而發(fā)揮作用的。目前，雖然從大鯉皮膚分泌液中純化得到了一種抗菌肽，但仍有許多問(wèn)題需要闡明，如大鯉皮膚分泌物中是否還存在其它一些活性肽(廣譜性的和抗細(xì)菌的)以及它們的結(jié)構(gòu)和功能等方面都需要做進(jìn)一步研究，以獲得將大鯉皮膚分泌液中抗菌肽開(kāi)發(fā)為新一代抗感染藥物所必須了解的信息。參考文獻(xiàn)：1張?jiān)?兩棲類動(dòng)物皮膚分泌物及其生物學(xué)適應(yīng)意義一大蹊2006,鈴蟾皮膚分泌物蛋白質(zhì)多肽組的啟示J.動(dòng)物學(xué)研究，27(1):101-l12.2茍小軍，鄒曉勇，楊燦宇.蛙皮多肽抗生素的研究進(jìn)展J.成2006,25(1):25-30.都大學(xué)

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