膠質(zhì)瘤基因治療的進展-- 細胞及分子生物學(xué)

1、膠質(zhì)瘤基因治療的進展- 細胞及分子生物學(xué)    1突變補償目前對腫瘤的病因?qū)W研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生與癌基因的激活和抑癌基因的失活有關(guān)。突變補償就是消除激活的癌基因或增強抑癌基因的功能。1.1消除激活的癌基因包括反義核酸、核酶和單鏈抗體技術(shù)。反義核酸是指與體內(nèi)某 rNA或 dNA序列具有互補順序，并能通過堿基配對與互補鏈雜交，從而影響其轉(zhuǎn)錄或翻譯過程的 rNA或 dNA片段。癌基因反義核酸的導(dǎo)入，抑制了癌基因編碼蛋白質(zhì)的合成，從而抑制癌基因的功能。膠質(zhì)瘤常過表達一些生長因子。 tGF-是一種 t細胞抑制因子，用反義 tGF-表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)9L膠質(zhì)肉瘤細胞，可使

2、荷瘤鼠長期生存率達100，12周后腫瘤消失，淋巴結(jié)效應(yīng)細胞增加了34倍1。 vEGF可促進血管內(nèi)皮細胞的分裂，把 vEGF vEGFR的通路打斷，可抑制腫瘤血管的形成。 saleh等2把 c6膠質(zhì)瘤細胞用反義 vEGF的真核表達載體轉(zhuǎn)導(dǎo)， vEGF的表達水平下降，組織學(xué)檢查見腫瘤內(nèi)血管數(shù)目減少且有很大程度的壞死。肽生長因子 bFGF對膠質(zhì)瘤的增殖、浸潤有刺激作用。反義 bFGF使 u-87膠質(zhì)瘤細胞增殖被抑制703。 trogan等4發(fā)現(xiàn)惡性膠質(zhì)瘤有 iGF-1異常表達，此表達異?？纱龠M腫瘤的生長；反義 iGF-1的導(dǎo)入，成功治療了轉(zhuǎn)基因鼠的腦內(nèi)膠質(zhì)瘤。雖然反義核酸治療惡性腫瘤有一定效果，但也

3、有局限性，不能轉(zhuǎn)運足夠的反義核酸到靶細胞而達到長期逆轉(zhuǎn)腫瘤的目的，現(xiàn)已設(shè)計了一種具有催化活性的反義 rNA，又被稱為核酶（ ribozyme），它不僅可與 rNA結(jié)合，同時還能使其裂解，可反復(fù)使用。多形性膠質(zhì)母細胞瘤（ gBM）表達 cD44粘附分子，設(shè)計了兩種錘頭核酶（ ham merhead ribozymes）來抑制 cD44的表達。兩種核酶定靶于 cD44的外顯子2上，對轉(zhuǎn)錄的 cD44S、 cD44R1RNA進行剪切，流式細胞儀（ fCM）檢測顯示了其對 cD44轉(zhuǎn)錄的裂解作用，這樣降低了 cD44的表達5。單鏈抗體技術(shù)是利用抗體的特異性和高親合特征，對表達抗體的基因進行操作，使其在

4、抗原結(jié)合區(qū)表達，又被稱為內(nèi)抗體（ intrabody）。 erbB2在許多腫瘤，特別是一些腺癌中過表達，將 erbB2單鏈可變區(qū)抗體（ scFV）基因?qū)肽[瘤細胞內(nèi)，可抑制 erbB2跨膜蛋白質(zhì)的過表達，引起明顯的細胞生長抑制6。這種“敲除”（ knockout）癌基因的方法很有效，也很有前途，但這方面報道較少。1.2增強抑癌基因的功能 p53是普遍公認的抑癌基因，是一種多功能蛋白質(zhì)。它可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，監(jiān)控細胞周期，激活細胞凋亡，控制 dNA的復(fù)制與修復(fù)，也發(fā)揮著保持基因組穩(wěn)定的作用。許多腫瘤都發(fā)生 p53的點突變，突變使 p53抑癌功能喪失，而獲得了腫瘤的形成能力。 frankel等7報道，在

5、40例膠質(zhì)瘤中有16例（40）發(fā)生了 p53突變。 badie等8用 adP53轉(zhuǎn)染9L細胞進行體內(nèi)、外試驗， pCR和 westennblot證實了 p53的轉(zhuǎn)錄和表達，抑制了腫瘤細胞的生長，使腫瘤體積縮小。 morita等9對521例多形膠母細胞瘤病人進行回顧性分析，其中10例生存期7年，這10例中有4例 p53過表達，表明 gBM病人的長期生存可能與 p53的過表達有一定的關(guān)系。新近又發(fā)現(xiàn)一種抑癌基因 p21WAF1 cIP1，為野生型 p53激活片段，也是周期依賴激酶的抑制劑。用 adP21WAF1 cIP1轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤細胞，可抑制其增殖和腫瘤形成。 p16（ cDKN2 mTS1）是一種

6、具有許多特性的腫瘤抑制基因，在膠質(zhì)瘤中缺失率高達50。 fueyo等10用 ad5RSV-16將 p16基因?qū)肽z質(zhì)瘤細胞，可直接合成功能性的 p16，明顯抑制了細胞的生長，改善了被轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的惡性表型。2分子化療該方法是將毒素基因釋放到腫瘤細胞而達到化療“輻射”的作用。在這方面研究最多、最深入的是 hSV-TK gCV系統(tǒng)。 hSV-TK基因表達產(chǎn)物可使對哺乳細胞無毒或低毒的核苷類似物（ gCV或 aCV）轉(zhuǎn)換成毒性的 gCV-TP，抑制 dNA多聚酶并摻入到 dNA鏈中，導(dǎo)致腫瘤細胞的死亡。有關(guān)這方面報道較多，大多是采用產(chǎn)生 hSV-TK的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的包裝細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)各種膠質(zhì)瘤細胞， gCV

7、治療后，發(fā)現(xiàn)腫瘤完全消退。也有對轉(zhuǎn)導(dǎo)動力學(xué)和毒性進行了試驗，發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)對小鼠、大鼠和猴基本是安全的；也未檢測到插入突變和有復(fù)制能力病毒的產(chǎn)生。膠質(zhì)瘤細胞處于活躍的增殖狀態(tài)，易被自殺基因 tK轉(zhuǎn)導(dǎo)。但也存在正常細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)表達 tK基因?qū)е陆M織損傷的可能性，如腸上皮和骨髓細胞被轉(zhuǎn)導(dǎo)可引起腹瀉和骨髓抑制，為此，研究者們克隆了只在特異組織表達的啟動子基因，用 mBP啟動子與 hSV-TK結(jié)合就可只轉(zhuǎn)導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞， gCV治療后使腫瘤消退，避免了腹瀉和骨髓抑制等副作用11。對 hSV-TK基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)開始多采用逆轉(zhuǎn)錄病毒，近幾年開始嘗試用其它載體，如單純皰疹病毒本身，腺病毒及質(zhì)粒 dNA的直接注射等，對單純

8、皰疹病毒進行操作，保留其 tK基因，去除那些編碼神經(jīng)毒性的基因如 rR（核糖核酸還原酶）基因，成為單純皰疹病毒的突變體 hrR3，用此載體結(jié)合 gCV治療膠質(zhì)瘤很有效12。腺病毒以其極高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率及安全性備受青睞。 maron13用腺病毒把 hSV-TK導(dǎo)入 c6膠質(zhì)瘤中， gCV治療后，腫瘤體積縮小28倍，生存期延長了4倍。也有學(xué)者把含有 hSV-TK的質(zhì)粒直接注射來轉(zhuǎn)導(dǎo)，這種質(zhì)粒表達載體較安全，易構(gòu)建。也可應(yīng)用較強的啟動子和脂質(zhì)體包裹提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和表達時間。 hSV-TK gCV是第一個被批準(zhǔn)用于人惡性膠質(zhì)瘤臨床試驗的基因治療系統(tǒng)。 oldfield14報道7例接受 hSV-TK gCV治

9、療的病人，其中5例腫瘤縮小，臨床效果和安全性都較好。其它研究機構(gòu)有關(guān)這方面的報道尚少，總之仍處于實驗階段。3遺傳性免疫增強法本策略是通過增強免疫反應(yīng)而獲得有效的抗腫瘤效應(yīng)?？赏ㄟ^細胞因子、導(dǎo)入腫瘤相關(guān)抗原和其刺激分子來實現(xiàn)。細胞因子是調(diào)控免疫反應(yīng)所必需的。把細胞因子導(dǎo)入腫瘤、抗腫瘤效應(yīng)細胞（ lAK， cTL， tIL）或易于移植和在體內(nèi)長期存活的載體細胞，使在腫瘤局部分泌高濃度的細胞因子，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。目前已報道用于膠質(zhì)瘤基因治療的細胞因子很多，有 iFN-、 iFN-、 iL-1、 iL-2、 iL-4、 iL-7、 m-CSF等。 wei15和 nam16分別用 nIH3T3和內(nèi)皮細胞

10、把 iL-4和 iL-2導(dǎo)入 c6和9L腫瘤內(nèi)，可見腫瘤生長明顯受抑，荷瘤鼠生存期延長。組織化學(xué)檢測在注射部位有小膠質(zhì)細胞、吞噬細胞、 cD8 nK細胞的浸潤。 sobol等17報道了1例星形細胞瘤病人，用自體腫瘤細胞混合 iL-2基因修飾的成纖維細胞，分10次皮下注射，病人細胞免疫反應(yīng)增強，治療4周后，腫痛有明顯的壞死。但是，由于細胞因子生物學(xué)作用多樣性，其與疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系相當(dāng)復(fù)雜，加上細胞因子在體內(nèi)處于一個復(fù)雜的細胞因子網(wǎng)絡(luò)（ cytokinenet-work）之中，并受到整體調(diào)節(jié)，如何在體內(nèi)充分發(fā)揮其治療作用仍需進一步研究。腫瘤的發(fā)生與腫瘤細胞逃避機體免疫反應(yīng)有關(guān)，這是由于腫瘤細胞免

11、疫原性比較差，不足以刺激機體產(chǎn)生抗腫瘤的免疫反應(yīng)。導(dǎo)入腫瘤相關(guān)抗原，提高腫瘤細胞的免疫原性，從而達到抗腫瘤的目的。 asai18把 s-myc基因與巨細胞病毒啟動子結(jié)合轉(zhuǎn)導(dǎo) c6、9L膠質(zhì)瘤，抑制了腫瘤的形成。這是由于 s-myc的表達刺激 c6、9L腫瘤相關(guān)抗原提呈給 t-淋巴細胞，激活了宿主的免疫反應(yīng)。缺陷型單純病毒型（ dlsptk）治療膠質(zhì)瘤有效，部分是由于病毒的感染，腫瘤細胞表面產(chǎn)生新抗原而誘發(fā)的免疫反應(yīng)所致。 b7是激活 cTL細胞的第二個信號， b7分子的導(dǎo)入可激活 cD8 cTL細胞，引起腫瘤消退。 yang等19把 b72cDNA用質(zhì)粒導(dǎo)入 p815細胞中，引起 p815腫瘤的消退，而且對 p815的再次攻擊產(chǎn)生抵抗。 zitvogel20把 iL-12和 b71共同導(dǎo)入腫瘤細胞中，抗腫瘤效應(yīng)更明顯。這種聯(lián)合應(yīng)用兩種或多種方法可能成為今后治療腫瘤的一