細胞生物學講義

1、CELL BIOLOGY第一章 緒論大綱要求理解：細胞生物學的概念了解：研究對象和任務, 細胞學說建立和經(jīng)典時期, 細胞生物學與醫(yī)學的聯(lián)系和研究熱點。知道：細胞生物學的分支學科，實驗細胞學的發(fā)展，分子生物學的興起, 細胞生物學研究熱點。討論德國媒體2001年沸沸揚揚地傳播著一條驚人消息：加拿大一個名叫UFO（飛碟）的邪教組織，正在醞釀一個秘密計劃克隆納粹頭子阿道夫希特勒。 克隆人能成功嗎？ 他倆的好惡將是相同的？ 克隆人，真的如潘多拉盒子里的魔鬼一樣可怕嗎？ 技術(shù)浪潮v 天文學（天問）推動農(nóng)業(yè)、航海業(yè)v 物理化學（物問）推動能源、材料、信息技術(shù)v 生物學（命問）推動基因農(nóng)業(yè)和基因藥物v 腦科學

2、（腦問）推動下一輪智能技術(shù)浪潮生物經(jīng)濟 預防、控制疾病: 糖尿病、心血管疾病、腫瘤等 轉(zhuǎn)基因技術(shù)與可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展：抗旱 、抗病抗蟲品種 生物質(zhì)能源：生物乙醇等，可再生 治理、保護生態(tài)環(huán)境：微生物技術(shù) 、環(huán)境生物技術(shù)、生物材料 主要內(nèi)容第一節(jié) 細胞生物學一、細胞、細胞學及細胞生物學 cytology在光學顯微鏡水平上研究細胞的化學組成、形態(tài)、結(jié)構(gòu)及功能的學科。Cell biology是在不同層次（顯微、亞顯微與分子水平）研究細胞基本生命活動規(guī)律的科學。 Three different levels At microscopic level At submicroscopic levelAt mo

3、lecular level 二、細胞生物學研究的主要任務 細胞核、染色體以及基因表達生物膜、細胞器、細胞骨架細胞增殖及其調(diào)控 細胞分化及其調(diào)控 細胞的衰老與凋亡 細胞的起源與進化 細胞工程三、細胞生物學的分支學科 基因組學（genomics）蛋白質(zhì)組學（proteomics）細胞組學（cytomics）定義： 以基因組數(shù)據(jù)庫為基礎，結(jié)合基因組學和蛋白質(zhì)組學的技術(shù)，在單細胞水平上獲取細胞分子表型的信息，進而研究細胞系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)以及內(nèi)部分子功能的學科。 兩大系列技術(shù)：細胞組分離技術(shù)；分離后再分析技術(shù)。 細胞遺傳學（cytogenetics）從細胞的角度，特別是從染色體的結(jié)構(gòu)與功能和其他細胞器的關系來

4、研究遺傳與變異的規(guī)律。細胞生理學（cytophysiology）研究細胞如何從環(huán)境中攝取營養(yǎng)，經(jīng)代謝而獲得能量，進行生長、分裂和其他功能活動，以及對環(huán)境因子產(chǎn)生反應的學科。 細胞化學（cytochemistry）以化學方法來研究細胞各化學組成及其分布，并尋找它們的特性的科學。定位、定性研究定量研究細胞社會學（cytosociology ）從系統(tǒng)論的觀點出發(fā)，研究整體和細胞群中細胞間的社會行為，包括：細胞識別：如精卵識別細胞通訊：整體和細胞群對細胞行為的調(diào)節(jié)等細胞形態(tài)學（cytomorphology）研究細胞形態(tài)及亞微結(jié)構(gòu)的科學。細胞器的起源、形成機制及發(fā)展過程等分子細胞學（molecular

5、cytology）從細胞遺傳信息流的角度研究細胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和表達的調(diào)控。第三節(jié) 細胞生物學與醫(yī)學一、細胞生物學與醫(yī)學關系 二、細胞生物學的重要研究領域 一、 細胞生物學與醫(yī)學關系細胞生物學是基礎醫(yī)學的基礎。細胞生物學是臨床醫(yī)學的基礎。如：膜受體異常：家族性高膽固醇血癥干細胞移植治療帕金森病 醫(yī)學新課題需從細胞生物學角度進行研究抗衰老 腫瘤（tumor or cancer）基礎醫(yī)學支柱課程老五大支柱：解剖、生理、生化、病理、藥理新五大支柱：細胞生物學、分子生物學、醫(yī)學遺傳學、神經(jīng)生物學、免疫學、第二節(jié) 細胞生物學的發(fā)展史一、細胞的發(fā)現(xiàn)與細胞學說建立二、光鏡下的細胞學研究（19世紀末）三、實

6、驗細胞學階段（20世紀初中葉）多學科滲透與細胞生物學 四、亞顯微與分子水平的相比生物學（一）細胞亞微結(jié)構(gòu) （二）分子生物學 Cell1665年，Hooke發(fā)現(xiàn)Cell theory一切生物都是由細胞組成；細胞是生物形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動的基本單位。細胞是生物形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動的基本單位Cytology研究細胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能及生活史 Mitosis Miosis實驗細胞學階段細胞學與遺傳學、生理學生物化學融合實驗技術(shù)：染色技術(shù)、組織培養(yǎng)技術(shù)、離心技術(shù)Submicroscopic structure電鏡下發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體、核糖體、線粒體高壓電鏡下發(fā)現(xiàn)細胞骨架掃描探針顯微鏡研究超微結(jié)構(gòu)（一）Subm

7、icroscopic structureMolecular biology1953，DNA double helix structure1958，the central lawMolecular cell biology細胞行為的分子機制20世紀后期的一些重要發(fā)現(xiàn)細胞膜：液態(tài)鑲嵌模型蛋白質(zhì)分選：信號肽能量轉(zhuǎn)換：化學滲透假說細胞內(nèi)運動：驅(qū)動蛋白基因表達與調(diào)控：內(nèi)含子細胞社會性：細胞信號轉(zhuǎn)導20世紀后期的一些重要發(fā)現(xiàn)細胞周期：MPF、cyclin細胞分化：克隆技術(shù)細胞衰老與死亡：PCD干細胞人類基因組計劃：HGP二、 細胞生物學研究動態(tài)與醫(yī)學 （一）細胞通訊和細胞信號轉(zhuǎn)導 （二）細胞的生長和分化

8、（三）細胞增殖及其調(diào)控 （四）細胞的衰老與凋亡 （五）基因組學、蛋白質(zhì)組學 （六）細胞工程 （七）未來展望 （一）細胞通訊和細胞信號轉(zhuǎn)導細胞間相互反映和作用的機制。是疾病機制、藥物研發(fā)的研究基礎。受體信號分子信號轉(zhuǎn)導通路（二）細胞分化與干細胞研究細胞分化與潛能胚胎干細胞用于醫(yī)學干細胞及其應用干細胞移植（stem cell transplant）造血干細胞移植胚胎干細胞移植神經(jīng)干細胞移植（三）細胞增殖及其調(diào)控 Cell cycle的研究是機體生長發(fā)育、細胞癌變的研究基礎。調(diào)控機制：三類調(diào)控因子checkpoint（四）細胞的衰老與凋亡失巢凋亡失巢凋亡” 是由于細胞與細胞外基質(zhì)或相鄰細胞脫離接觸而

9、誘發(fā)的。 （五）基因組學、蛋白質(zhì)組學基因組學研究熱點：表觀遺傳學是研究基因的核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，基因表達了可遺傳的變化的一門遺傳學分支學科。表觀遺傳的現(xiàn)象如DNA甲基化、基因組印記、母體效應、基因沉默、核仁顯性，休眠轉(zhuǎn)座子激活和RNA編輯等。蛋白質(zhì)組研究：亞細胞蛋白質(zhì)組學比較蛋白質(zhì)組學（六）細胞工程（cell project）在細胞水平上的遺傳操作，即通過細胞融合、核質(zhì)移植、染色體或基因移植以及組織和細胞培養(yǎng)等方法改造細胞的某些生物學特性，從而創(chuàng)造新物種，以獲得有價值的生物產(chǎn)品。具高效率的特點。包括：上游工程：基礎操作下游工程：應用（七）未來展望18世紀60年代，英國進入工業(yè)經(jīng)濟，2

10、0世紀50美國進入信息時代。 生物經(jīng)濟時代特點：生產(chǎn)干擾素（440億$/kg）；改造物種，開始二次“創(chuàng)世紀”。人類遺傳病的基因治療成為常規(guī)技術(shù)。人工組織、器官用于醫(yī)學治療的目的。生物芯片應用于醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、司法等。網(wǎng)絡系統(tǒng)管理生物經(jīng)濟的遺傳信息。第四節(jié)細胞生物學的學習方法 細胞的結(jié)構(gòu)與功能的統(tǒng)一掌握理論的同時注重實驗課理論：80分平時成績20分了解相關研究進展參考書 雜志 References 細胞生物學。翟中和，高教出版社，2000細胞生物學。汪堃仁，北師大出版社，1998Alberts. Molecuar Biology of the Cell, 3rd ed. 1994Lodish. Mo

11、lecular Cell Biology. 4th ed. 2000.Gerald Karp. Cell and Molecular Biology：concepts and experiments，3rd ed. 1999Bast. Cancer Medicine. 5th ed. 2000. Becker. The World of the Cell. 4th ed. 2000ReferencesJournals The end第二章 細胞的概念與分子基礎 第一節(jié) 細胞的基本概念第二節(jié) 細胞的起源與進化第三節(jié) 細胞的分子基礎大綱要求基本要求：理解：核酸，比較原核細胞與真核細胞了解：蛋白質(zhì)知

12、道：細胞的形成與進化重點和難點：蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能第一節(jié) 細胞的基本概念一、細胞是生命活動的基本單位二、原核細胞三、真核細胞四、非細胞生命形態(tài)病毒 原核細胞和真核細胞的比較 一、細胞是生命活動的基本單位1、構(gòu)成有機體的基本單位2、具有獨立完整的代謝系統(tǒng)3、是有機體生長發(fā)育的基礎4、是遺傳的基本單位5、沒有細胞就沒有完整的生命生物的分界（ kingdom ）生物的分界（ kingdom ）二界系統(tǒng)：三界系統(tǒng)：植物、動物、原生生物五界系統(tǒng)：原核生物總界真核生物總界：植物、動物、真菌、原生生物六界系統(tǒng)：無細胞生物總界、原核生物總界、真核生物總界生物的分界（ kingdom ）二、原

13、核細胞（ prokaryotic cell ）1、支原體是最小最簡單的細胞2、細菌（bacteria）3、古細菌：1、支原體是最小最簡單的細胞直徑約0.10.3um是腦炎、肺炎和尿道炎的病原體2、細菌（bacteria）細胞壁（cell wall,含肽聚糖）莢膜（capsula） 中間體擬核有環(huán)狀DNA質(zhì)粒（plasmid）核糖體：50S+30S三、真核細胞（ eukaryotic cell ）（一）形態(tài)大?。ǘ┗窘Y(jié)構(gòu)（一）細胞形態(tài)大小一般直徑1020um（二）基本結(jié)構(gòu)生物膜結(jié)構(gòu)： 細胞核： 細胞骨架： 細胞質(zhì)溶膠:生物膜結(jié)構(gòu)細胞骨架系統(tǒng)細胞核原核細胞和真核細胞比較結(jié)構(gòu)差異：真核細胞具內(nèi)膜

14、系統(tǒng)、細胞骨架、80S核糖體原核細胞無內(nèi)膜系統(tǒng)、細胞骨架、70S核糖體遺傳系統(tǒng)差異：DNA含量：DNA分子結(jié)構(gòu)：染色質(zhì)或染色體：基因結(jié)構(gòu)：基因表達：細胞增殖差異：四、病毒（virus）DNA病毒RNA病毒類病毒（ viroid ）擬病毒朊病毒（ prion ）天花病毒狂犬病病毒煙草花葉病毒受病毒侵染的郁金香第三節(jié) 細胞的分子基礎一、生物小分子二、生物大分子一、 生物小分子（一）無機化合物水無機鹽（二）有機小分子：單糖、脂肪酸、氨基酸、核苷酸二、 生物大分子（一）核酸（二）蛋白質(zhì)（三）多糖（四）脂類（一）核酸（nucleic acid）化學組成 （一）DNA（ deoxyribonucleic

15、acid ）（二）RNA （ribonucleic acid ）（三）核酶和脫氧核酶（一）核酸的化學組成核苷酸 堿基（A、T/U、G、C）戊糖磷酸35磷酸二脂鍵 核苷酸核苷酸35磷酸二脂鍵2、DNADNA的結(jié)構(gòu)：一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu) A、B、Z型 DNA的功能：儲存、復制和傳遞遺傳信息DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)A、B、Z型遺傳信息的儲存通過堿基對數(shù)和排列順序的不同儲存遺傳信息。問題：10個堿基的DNA分子有多少種？（三）RNAmRNA rRNA tRNA snRNA miRNA 核酶 mRNA密碼子tRNA反密碼子rRNAsnRNA形成剪接體加工基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物miRNARNA干擾：mi RN

16、A、siRNA以序列同源互補的mRNA為靶點，通過促使特定基因的mRNA降解來高效、特異地阻斷體內(nèi)特定基因表達的現(xiàn)象。核酶和脫氧核酶核酶（ribozyme）：具有酶活性的RNA脫氧核酶（deoxyribozyme）：具有催化功能的DNA分子核酶（ribozyme）（二）蛋白質(zhì)1、化學組成2、分子結(jié)構(gòu)3、折疊機制4、結(jié)構(gòu)與功能的關系5、酶1、化學組成2、分子結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)：氨基酸順序二級結(jié)構(gòu)：主鏈內(nèi)相互作用而折疊三級結(jié)構(gòu)：側(cè)鏈間相互作用進一步折疊四級結(jié)構(gòu)：多個亞單位組裝復雜空間結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)3、折疊機制分子伴侶（molecular chaperone）參與折疊4、結(jié)構(gòu)與功能的

17、關系一級結(jié)構(gòu)是基礎空間結(jié)構(gòu)決定功能 結(jié)構(gòu)域（三級結(jié)構(gòu)）5、酶（enzyme）（三）糖類糖蛋白糖脂攜帶細胞信息等功能細胞的形成和進化從分子到細胞多核苷酸的形成多肽的形成原始細胞的形成從原核細胞到真核細胞從單細胞到多細胞第三章 細胞生物學技術(shù)大綱要求 主要內(nèi)容 大綱要求基本要求： 理解：顯微鏡技術(shù)，細胞培養(yǎng)細胞分級技術(shù)了解：分子生物學技術(shù)知道：細胞內(nèi)分子示蹤重點和難點：重點：顯微鏡技術(shù)和細胞培養(yǎng)技術(shù)難點：分子細胞生物學技術(shù)。主要內(nèi)容第一節(jié) 顯微鏡技術(shù) 第二節(jié) 細胞分離和培養(yǎng)技術(shù) 第三節(jié) 細胞組分的分離純化和分析 第四節(jié) 細胞化學技術(shù)（分子示蹤）第五節(jié) 細胞功能基因組學研究技術(shù) 第一節(jié) 顯微鏡技術(shù)一

18、、光學顯微鏡技術(shù) 二、電子顯微鏡技術(shù) 三、X射線衍射技術(shù) 四、核磁共振技術(shù)五、活細胞內(nèi)分子檢測技術(shù)六、掃描探針顯微術(shù) 一、光學顯微鏡技術(shù)（一）普通光學顯微鏡 （二）熒光顯微鏡 （三）相差顯微鏡 （四）暗視野顯微鏡技術(shù)（五）顯微攝影技術(shù)（六）激光掃描共焦顯微鏡 （一）普通光學顯微鏡技術(shù)分辨率 極限發(fā)大倍數(shù)人眼分辨率/光鏡分辨率生物樣品制備 顯微鏡史 分辨率分辨率（resolution）:在25cm的明視距離將鄰近兩點清晰地區(qū)分辨認的能力。人眼：0.1mm光學顯微鏡：0.2um電鏡：0.2nm掃描隧道顯微鏡：側(cè)向0.1nm;縱向0.001nm計算分辨率的公式 計算分辨率的公式R0.61 /(n s

19、in)/2 光鏡 R0.2um 當兩點相距小于/2時難以區(qū)分。提高分辨率的方法：提高折射系數(shù)（n）降低波長（）(wavelength)分辨能力與波長（ ）負相關高速電子的波長很短n sin n：折射率（11.5）：1/2*孔徑張角 (A) 生物樣品制備涂片、滴片：液態(tài)材料（血液、骨髓）、表皮、黏膜切片：固態(tài)材料（肝、腦、腎）固定、脫水、包埋、切片、染色染色：蘇木精（核酸）、伊紅（細胞質(zhì)）、蘇丹（脂肪）、吉姆薩（染色體）不同細胞或結(jié)構(gòu)用不同染料顯示。顯微鏡史（二）熒光顯微鏡（Fluorescence M）以紫外線為光源激發(fā)生物標本的熒光物質(zhì)產(chǎn)生能觀察到的熒光的光學顯微鏡。特點：光源為紫外光 ；有

20、濾光片 熒光染料(三)相差顯微鏡（Phase contrast M）將相位差轉(zhuǎn)變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。 環(huán)形光闌（annular diaphragm）：位于光源與聚光器之間，形成空心光錐，焦聚到標本上。相位板（annular phase plate）：加在物鏡中，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4。常見倒置相差顯微鏡（inverted phase contrast microscope）.annular diaphragm and phase plateannular diaphragm and phase platephase image inver

21、ted phase contrast microscope光源和聚光鏡在載物臺上方相差物鏡在載物臺下方可觀察培養(yǎng)瓶底部的活細胞暗視野顯微鏡只允許被標本反射和衍射的光線進入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。（六）激光掃描共焦顯微鏡（Laser scanning confocal microscope）照明針孔：形成點光源檢測器：焦平面的點分別在檢測針孔成像掃描馬達：改變焦平面以形成三維圖像LSCM排除焦平面以外光的干擾，增強圖像反差和提高分辨率，可重構(gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu)LSCM二、電子顯微鏡技術(shù)（Electron microscope）（一）透射電鏡（transmission EM, T

22、EM） （二）掃描電鏡(scanning EM, SEM) 其他：分析電鏡(analytic, AEM)、高壓電鏡 （三）電鏡樣品制備技術(shù) 附：不同顯微鏡結(jié)構(gòu)特征 不同顯微鏡的結(jié)構(gòu)特征電鏡與光鏡的比較1、透射電鏡（TEM）Transmission electron microscope鏡體系統(tǒng)照明系統(tǒng)：電子槍，聚光鏡成像系統(tǒng)：電子透鏡觀察系統(tǒng)真空系統(tǒng)電子系統(tǒng)2、掃描電鏡（SEM）10nm電子探針沖擊樣品表面，激發(fā)出次級電子，次級電子信號被收集、放大成像。3、分析電鏡帶有特殊附件。如波譜儀、能譜儀如：X射線衍射電鏡4、高壓電鏡一般加速電壓200kV，可穿透37um切片500kV可穿透10um切片

23、。(三)電鏡樣品制備技術(shù)（1）超薄切片術(shù) （2）冷凍制樣技術(shù) （3）負染色技術(shù) （4）真空鍍膜技術(shù) （5）冷凍蝕刻技術(shù) （6）掃描電鏡樣品的制備 （1）超薄切片術(shù)固定：鋨酸脫水：遞增濃度包埋：環(huán)氧樹脂切片：4050nm染色：醋酸鈾（2）冷凍制樣技術(shù)快速冷凍固定：104 /s致冷劑：液氮（liquid nitrogen, -196）、氟利昂（3）負染色技術(shù)（negative stain）磷鎢酸（4倍標本密度）（4）真空鍍膜技術(shù)replica and shadowing technique碳膜和金屬（Pt）膜（5）冷凍蝕刻技術(shù)冷凍：斷裂：蝕刻：冰升華復型：剝膜：（6）掃描電鏡樣品的制備固定干燥（臨

24、界點干燥法） ：臨界狀態(tài)（臨界溫度和壓力）下，固液兩相界面消失，氣體不會液化。含水標本在臨界狀態(tài)后緩慢放氣減壓，水分會氣化干燥。復膜三、X射線衍射技術(shù)五、活細胞內(nèi)分子檢測技術(shù)膜片鉗技術(shù)向細胞內(nèi)導入分子的技術(shù)顯微注射法電休克法脂質(zhì)體導入法轉(zhuǎn)染法導入DNA六、掃描探針顯微術(shù)（Scanning Probe Microscope）基本原理 基本結(jié)構(gòu) 應用納米生物學研究,在原子水平上揭示樣本表面的結(jié)構(gòu)。DNA、蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的研究SPM的基本原理原理：掃描探針與樣品接觸或達到很近距離時，即產(chǎn)生彼此間相互作用力，如量子力學中的隧道效應（隧道電流）、原子間作用力、磁力等，并在計算機顯示出來，從而反映出樣品表

25、面形貌信息、電特性或磁特性等。如：原子力顯微鏡：AFM 模式 掃描隧道顯微鏡：STM 模式磁力顯微鏡：MFM模式電力顯微鏡： EFM模式Scanning Tunneling M, STM SPM的基本結(jié)構(gòu)掃描裝置探針探針位移傳感器其他第二節(jié) 細胞培養(yǎng)技術(shù)一、細胞分離技術(shù) （一）離心法（二）流式細胞技術(shù) （三）激光顯微切割（四）吸附法、免疫磁珠法等。二、細胞培養(yǎng)技術(shù)（一）體外細胞培養(yǎng)技術(shù) （二）原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng) （三）細胞株的建立 （四）細胞融合技術(shù) （五）胚胎干細胞培養(yǎng)技術(shù) 流式細胞技術(shù)（Flow cytometry）結(jié)構(gòu)及其工作原理細胞流動室光源和聚光裝置信號檢測器計算機系統(tǒng)應用細胞分選（

26、cell sorting）參數(shù)分析細胞分離技術(shù)實體組織細胞的分離胰蛋白酶EDTA操作原則：等滲低溫無菌細胞培養(yǎng)無菌、培養(yǎng)箱培養(yǎng)基血清等體外細胞培養(yǎng)技術(shù) 原代培養(yǎng)（primary culture）：從機體取出后立即進行的培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)（secondary culture）：將原代培養(yǎng)的細胞從培養(yǎng)瓶取出后進行的培養(yǎng)。細胞系（cell line）：原代培養(yǎng)物成功傳代后，則稱之為細胞系 實驗室中常用的幾種細胞系 （三）細胞株的建立細胞系（cell line）：原代培養(yǎng)物成功傳代后，則稱之為細胞系。細胞株（cell strain）：通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細胞系中獲得具有特殊性質(zhì)或標志物稱為

27、細胞株。克?。╟lone）：無性繁殖系或簡稱無性系。對細胞來說，克隆是指由同一個祖先細胞通過有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致的細胞群。 （三）細胞融合技術(shù)細胞融合(cell fusion)異核細胞（異核體）雜種細胞（合核體）雜交瘤技術(shù)：單克隆抗體（Monoclonal antibody ）B淋巴細胞與瘤細胞融合，形成的雜種細胞克隆既分泌抗體又可無限增殖。（四）胚胎干細胞培養(yǎng)技術(shù)胚胎干細胞（embryonic stem cell, ESC）培養(yǎng)時需加入分化抑制物：飼養(yǎng)層（feed layer）條件培養(yǎng)基（conditional medium）分化抑制因子（differentiation inhibit

28、or）培養(yǎng)步驟：應用：用于研究細胞增殖、分化等ESC培養(yǎng)圖解第三節(jié) 細胞及其組分的分離純化和分析一、離心技術(shù)：分離細胞亞微結(jié)構(gòu)和大分子二、非細胞體系：分級分離得到的具有生物功能的細胞抽提物三、層析法：分離蛋白質(zhì)四、電泳：檢測大分子的分子量五、質(zhì)譜技術(shù)：短肽測序和蛋白鑒定六、氨基酸測序一、離心（centrifugation）（一）差速離心沉降速度法根據(jù)顆粒的體積、質(zhì)量、大小、形態(tài) （二）速度沉降：根據(jù)顆粒的沉降系數(shù)（顆粒大小與形態(tài)）（三）平衡沉降等密度離心法，根據(jù)顆粒密度差異 密度梯度離心 差速離心密度梯度離心electrophoresis第四節(jié) 細胞化學技術(shù)（cytochemistry）一、酶

29、細胞化學技術(shù)二、免疫細胞化學技術(shù) 三、放射自顯影技術(shù) 四、活細胞內(nèi)分子示蹤一、放射自顯影技術(shù)利用同位素（3H, 14C, 32P, 35S , 125I）的放射自顯影，對細胞內(nèi)生物大分子進行定性、定位或半定量研究； 基本步驟：前體物摻入細胞（持續(xù)標記或脈沖標記） 放射自顯影（涂乳膠、曝光、顯影、定影）例：用3H-TTP研究細胞DNA合成及增殖 放射自顯影二、免疫細胞化學技術(shù)（immunochemistry）基本原理：直接法和間接法：單克隆抗體技術(shù) 基本原理利用抗原和抗體的結(jié)合具有高度敏感性和特異性的特點，用已知的經(jīng)過標記的抗體來檢測組織或細胞中是否存在相應抗原的方法。標記物：熒光素：酶：鐵蛋白

30、：膠體金：常用標記方法直接法和間接法1、直接法標記的特異性抗體直接檢測樣品中相應抗原2、間接法先用未標記一抗與樣品中的抗原結(jié)合，再用標記的二抗與一抗結(jié)合來檢測樣品中的抗原單克隆抗體技術(shù) 第五節(jié) 細胞功能基因組學研究技術(shù)一、基因的基本研究技術(shù) 二、RNA干擾三、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)四、生物芯片技術(shù) 五、蛋白質(zhì)組學研究技術(shù) 一、基因的基本研究技術(shù)（一）限制性內(nèi)切酶：分子刀（二）凝膠電泳：分離DNA分子（三）聚合酶鏈反應技術(shù)：體外DNA擴增（四）基因（DNA）克隆、基因文庫（五）DNA測序 （六）分子雜交技術(shù)：（二）凝膠電泳（三）PCR反應體系：緩沖液、待擴增DNA模板、dNTP、Mg2+、引物、

31、耐熱DNA聚合酶。步驟：變性、退火、延伸應用：克隆基因、疾病診斷步驟（四）基因（DNA）克隆基因組DNA克隆基因文庫（gene library）：包含人染色體的全部基因的克隆。cDNA克?。喝縞DNA的克隆cDNA：將mRNA通過逆轉(zhuǎn)錄酶合成的與mRNA互補的DNA單鏈。（五）DNA測序12（六）hybridization雜交技術(shù)DNA變性與復性（雜交）探針（marked probe）：帶有標記物的已知核苷酸序列。In situ hybridization：核酸的定位分析 Northern blot ：對RNA的分析Southern blot：對DNA的分析 In situ hybridiz

32、ation步驟：組織細胞或染色體的固定和置片預處理：除去蛋白質(zhì)、DNA變性標記探針雜交檢測二、RNA干擾技術(shù)RNAi，基因敲除術(shù)四、生物芯片技術(shù)信息芯片DNA芯片（基因芯片）：用于雜交的基因探針固定在固相支持物上成而為陣列。蛋白質(zhì)芯片：大量蛋白或多肽固定在支持物上功能芯片五、蛋白質(zhì)組（proteome）蛋白質(zhì)組：指在特定時空條件下某種細胞、組織或器官所含有的全部蛋白質(zhì)。技術(shù)：雙向電泳、質(zhì)譜技術(shù)END 第四章 細胞膜與物質(zhì)的運輸 PLASMA MEMBRANE 第五章 細胞膜與物質(zhì)的運輸?shù)谝还?jié)：細胞膜的化學組成和分子結(jié)構(gòu)第二節(jié)：小分子物質(zhì)的運輸?shù)谌?jié)：大分子和顆粒物質(zhì)的跨膜運輸?shù)谒墓?jié)：細胞表面及

33、其特化結(jié)構(gòu) 第五節(jié)：細胞膜異常與癌變小結(jié) 第一節(jié)：細胞膜的化學組成和分子結(jié)構(gòu) 基本概念： 一、細胞膜的化學組成二、細胞膜的特征三、細胞膜的分子結(jié)構(gòu)模型 基本概念 細胞膜：胞質(zhì)與外界環(huán)境相隔的界膜。 內(nèi)膜系統(tǒng)（endo-membrane system） 生物膜（biomembrane）： 單位膜（unit membrane）： endo-membrane system 細胞質(zhì)內(nèi)在結(jié)構(gòu)、功能以及發(fā)生上具有一定聯(lián)系的膜性結(jié)構(gòu)的總稱。包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體、過氧化物酶體以及核膜等。 生物膜（biomembrane） 質(zhì)膜和細胞內(nèi)膜系統(tǒng)在起源、結(jié)構(gòu)和化學組成的等方面具有相似性，故總稱為。 單位膜（

34、unit membrane） 在電子顯微鏡下觀察，細胞膜可分為三層，內(nèi)外兩層為致密層，中間為一層不太致密的層，稱單位膜。 一、 質(zhì)膜的化學組成 （一）膜脂： （二）膜蛋白： （三）糖脂和糖蛋白： 生膜的化學組成 （一）膜脂構(gòu)成細胞膜的骨架 膜脂是兩親性分子 1、磷脂構(gòu)成膜脂的基本成分 2、膽固醇能夠穩(wěn)定膜和調(diào)節(jié)流動性 3、糖脂位于質(zhì)膜非胞質(zhì)面 膜脂在水溶液中自動形成雙層膜： 1、磷脂 占膜脂的50以上。 分類：甘油磷脂(舉例)和鞘磷脂 主要特征是：(1)具有一個極性頭和兩個非極性尾。(2)脂肪酸碳鏈為偶數(shù)(多為1424）(3)常含有不飽和脂肪酸（如油酸）。 甘油磷脂 含甘油、脂肪酸鏈和磷脂酰堿

35、基。包括 磷脂酰膽堿，PC，舊稱卵磷脂 磷脂酰絲氨酸，PS 磷脂酰乙醇胺，PE，舊稱腦磷脂 磷脂酰肌醇，PI 雙磷脂酰甘油, DPG，舊稱心磷脂 磷脂酰乙醇胺 2、膽固醇 兩親性分子 功能：提高膜的穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)膜的流動性，降低水溶性物質(zhì)的通透性。 驗證實驗：在缺少膽固醇培養(yǎng)基中，不能合成膽固醇的突變細胞株很快自溶。 3、糖脂 占脂總量5， 兩性分子，由糖殘基與鞘氨醇結(jié)合。 最簡單的糖脂是半乳糖腦苷脂，在髓鞘中含量豐富； 最復雜的糖脂是神經(jīng)節(jié)苷脂，是神經(jīng)元質(zhì)膜的特征性成分。 Glycolipids Glycolipids （二）自發(fā)形成脂質(zhì)體（liposome） 脂質(zhì)體：是一種人工膜，由磷脂雙層

36、膜構(gòu)成的中空小球。可用于： 轉(zhuǎn)基因 制備藥物 研究生物膜的特性 liposome （二）膜蛋白是膜功能的體現(xiàn)者 根據(jù)其與脂分子結(jié)合方式分為：1、整合蛋白（integral protein） 2、外周蛋白（peripheral protein） 3、脂錨定蛋白（lipid-anchored protein） 膜蛋白的分類 , integral protein； , , peripheral protein； 1、整合蛋白 多為兩性分子，為跨膜蛋白，與膜緊密結(jié)合，需去垢劑才能從膜上洗滌下來。 2、外周蛋白 靠離子鍵或其它較弱的鍵與膜表面的蛋白質(zhì)或脂類的親水部分結(jié)合。 改變?nèi)芤旱碾x子強度、溫度就可分

37、離。 3、脂錨定蛋白 一類與糖磷脂酰肌醇結(jié)合 如引起羊瘙癢病 一類與長碳氫鏈結(jié)合 三、糖脂和糖蛋白 動物細胞表面一層富含糖類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，稱為細胞外被或糖萼。（模型） 作用：保護，細胞通信，抗原性。 如ABO血型系統(tǒng)的血型抗原。 細胞外被 cell coat ABO血型系統(tǒng)的血型抗原 A型血：N-乙酰半乳糖 B型血：半乳糖 O型血：無 二、 細胞膜的特性（一）細胞膜的不對稱性（二）質(zhì)膜的流動性 1、脂雙層是一種二維流體 2、膜脂分子的多種運動 3、影響膜脂運動的因素 4、脂蛋白分子在質(zhì)膜中的運動 5、 膜流動性的生理意義 （一）膜的不對稱性 質(zhì)膜內(nèi)外兩層的組分和功能的差異。 1、膜脂的不對稱性：

38、2、膜蛋白的不對稱性：3、復合糖的不對稱性： 小鼠肝細胞膜冰凍蝕刻 ES，細胞外表面；EF，細胞外小頁斷面；PS，原生質(zhì)表面；PF，原生質(zhì)小頁斷面。 1、膜脂的不對稱性： 同一種脂分子在脂雙層中呈不均勻分布 如磷脂酶處理完整的人類紅細胞實驗。 還表現(xiàn)在膜表面具有膽固醇和鞘磷脂等形成的微結(jié)構(gòu)域脂筏。 脂酶處理研究膜脂分布 2、膜蛋白的不對稱性： 膜蛋白分子在細胞膜上具有方向性和分布的區(qū)域性，如受體。 3、復合糖的不對稱性 只分布于細胞膜的外表面。 2、膜脂分子的運動： 側(cè)向擴散運動 翻轉(zhuǎn)運動、 旋轉(zhuǎn)運動、 伸縮震蕩運動： 烴鏈的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)運動 3、影響膜脂流動性的因素 脂肪酸鏈的飽和度： 脂肪酸鏈

39、的鏈長： 膽固醇： 卵磷脂/鞘磷脂： 膜蛋白的影響：與膽固醇類似 其他因素：溫度、酸堿度、離子強度等 4、膜蛋白的分子運動 主要有側(cè)向擴散和旋轉(zhuǎn)擴散。 實驗：細胞融合技術(shù)檢測側(cè)向擴散。 側(cè)向運動受細胞骨架的限制。（圖） 實驗：細胞松弛素B破壞微絲證實。 膜骨架對膜流動性的影響 觀察蛋白質(zhì)運動實驗 膜流動性的生理意義 質(zhì)膜的流動性是保證其正常功能的必要條件。 流動性過低：酶活性和跨膜運輸停止， 流動性過高，造成膜的溶解。 三、 質(zhì)膜的分子結(jié)構(gòu)模型早期研究： E. Overton 1895 E. Gorter & F. Grendel 1925 一、片層結(jié)構(gòu)模型二、單位膜模型三、液態(tài)鑲嵌模型四、脂

40、筏模型 E. Overton 1895推測細胞膜由連續(xù)的脂類物質(zhì)組成。 E. Gorter & F. Grendel 1925 推測細胞膜由雙層脂分子組成。 一、片層結(jié)構(gòu)（三夾板）模型 Danielli & Davson 1935年提出。1959年提出有蛋白質(zhì)通道。 定義：膜的骨架是脂肪形成的脂雙層結(jié)構(gòu)，脂雙層的內(nèi)外兩側(cè)由一層蛋白質(zhì)包被，即蛋白質(zhì)-脂-蛋白質(zhì)的三層結(jié)構(gòu)。 片層結(jié)構(gòu)（三夾板）模型 （二）單位膜模型 Robertson 1959年提出。 定義：電子顯微鏡下顯示暗-明-暗三層結(jié)構(gòu)，由厚約3.5nm的雙層脂分子和內(nèi)外表面各厚約2nm的蛋白質(zhì)構(gòu)成，總厚約7.5nm。 Unit membr

41、ane model 三、液態(tài)鑲嵌模型 Singer & Nicolson 1972提出。 模型要點；其他修正模型1；2 Fluid-mosaic model 定義：鑲嵌有球形蛋白的脂類二維排列的液晶態(tài)體。 強調(diào)膜的特點：流動性；不對稱性 缺點：不能解釋流動性的質(zhì)膜怎樣保持膜的相對完整和穩(wěn)定性。 晶格鑲嵌模型 流動的膜脂是在可逆地進行無序（液態(tài)）和有序（晶態(tài)）的相變，膜蛋白對脂類分子的運動具有限制作用。鑲嵌蛋白和其周圍的脂類分子形成膜中的晶態(tài)部分，而具有流動性的脂類分子呈小片的點狀分布。 板塊鑲嵌模型 流動的脂雙層中存在許多大小不同、剛性較大的能獨立移動的脂類板塊（有序板塊），有序板塊之間被流動

42、的脂類區(qū)（無序板塊）分開。兩者之間處于連續(xù)的動態(tài)平衡狀態(tài)之中。 （四）脂筏（lipid raft） 定義：膜中富含膽固醇和鞘磷脂的微區(qū)聚集一些特定的蛋白。這些區(qū)域較厚、更有序且較少流動。 特點： 脂筏的特點 就像一個蛋白質(zhì)停泊的平臺，與膜的信號轉(zhuǎn)導、蛋白質(zhì)分選均有關。 特點： 1、許多蛋白聚集利于相互作用 2、提供一個環(huán)境有利于蛋白質(zhì)的變構(gòu) 小結(jié) 兩親性分子 內(nèi)膜系統(tǒng)、生物膜、單位膜的比較 膜的流動性和不對稱性 片層結(jié)構(gòu)模型、單位膜模型、液態(tài)鑲嵌模型、脂筏模型的 比較 第二節(jié) 小分子的跨膜運輸 一、膜的選擇性通透和簡單擴散二、膜轉(zhuǎn)運蛋白介導的跨膜運輸 一、膜的選擇性通透和簡單擴散 細胞膜的選擇

43、透過性總結(jié) 脂溶性越高通透性越大，水溶性高通透性?。?非極性分子比極性易透過，極性不帶電荷小分子，如H2O、O2等慢透過人工脂雙層； 小分子比大分子容易透過；分子量略大一點的葡萄糖、蔗糖則很難透過； 帶電荷的物質(zhì)，如各類離子是高度不通透的。 脂溶性與通過細胞膜能力的關系 簡單擴散又稱被動擴散 膜運輸小分子物質(zhì)方式： 被動運輸：速度取決分子大小和脂溶性 簡單擴散（自由擴散、被動擴散）；易化擴散 主動運輸 簡單擴散的特點 沿濃度梯度（或電化學梯度）擴散； 不需要提供能量； 沒有膜蛋白的協(xié)助 主要運輸非極性分子、不帶電荷的小極性分子、水等 二、膜轉(zhuǎn)運蛋白介導的跨膜運輸（一）離子通道高效轉(zhuǎn)運各種離子（

44、二）載體蛋白介導的易化擴散（三）載體蛋白介導的主動運輸 膜轉(zhuǎn)運蛋白 載體蛋白（carrier protein），有的需要能量驅(qū)動，如離子泵；有的則不需要能量，如纈氨酶素。 通道蛋白（channel protein）形成親水的通道，允許特定的溶質(zhì)通過，均為被動運輸。 Membrane Transport Proteins 離子泵 纈氨酶素 （一）離子通道高效轉(zhuǎn)運各種離子 channel protein的特點 類型：配體門通道、電位門通道、應力激活通道、環(huán)核苷酸門通道、機械門通道、水通道 神經(jīng)肌肉接頭處離子通道 特點 特點： 轉(zhuǎn)運速度快 高度選擇性 多數(shù)非持續(xù)開放 均為被動擴散 Ion Chann

45、els 1、配體門通道(ligand gated channel) 受體與細胞外的配體結(jié)合，引起門通道蛋白發(fā)生構(gòu)象變化， “門”打開。又稱離子通道型受體。 陽離子通道，如乙酰膽堿、谷氨酸和五羥色胺受體；陰離子通道，如甘氨酸和氨基丁酸受體。 Ach受體為2的梅花狀通道樣結(jié)構(gòu)。 模型 Nicotinic acetylcholine receptor 2、電位門通道(voltage gated channel) 特點：細胞內(nèi)或細胞外特異離子濃度或電位發(fā)生變化時，致使其構(gòu)象變化，“門”打開。 K+電位門有四個亞單位。 K+通道具有三種狀態(tài)：開啟、關閉和失活。 Na+、K+、Ca2+三種電壓門通道結(jié)構(gòu)相

46、似，在進化上是由同一個遠祖基因演化而來。 Voltage gated K+ channel Ion-channel linked receptors in neurotransmissionVoltage gated Ca2+ channel 3、環(huán)核苷酸門通道 CNG通道與電壓門鉀通道結(jié)構(gòu)相似， CNG通道分布于化學感受器和光感受器中，與膜外信號的轉(zhuǎn)換有關。 如氣味分子與化學感受器中的G蛋白偶聯(lián)型受體結(jié)合，可激活腺苷酸環(huán)化酶，產(chǎn)生cAMP，開啟cAMP門控陽離子通道（cAMP-gated cation channel），引起鈉離子內(nèi)流，膜去極化，產(chǎn)生神經(jīng)沖動，最終形成嗅覺或味覺。 4、機械門

47、通道 感受摩擦力、壓力、牽拉力、重力、剪切力等。細胞將機械刺激的信號轉(zhuǎn)化為電化學信號，引起細胞反應的過程稱為機械信號轉(zhuǎn)導。 如牽拉活化或失活的離子通道（幾乎存在于所有的細胞膜），剪切力敏感的離子通道（僅發(fā)現(xiàn)于內(nèi)皮細胞和心肌細胞）。 5、水通道 水擴散通過人工膜的速率很低，推測膜上有水通道。 1991年Agre將CHIP28的mRNA注入非洲爪蟾的卵母細胞中，在低滲溶液中，卵母細胞迅速膨脹，5 分鐘內(nèi)破裂。 2003年獲諾貝爾化學獎。 命名為水通道蛋白（Aquaporin，AQP） 2003年，美國科學家彼得阿格雷和羅德里克麥金農(nóng)，分別因?qū)毎にǖ?，離子通道結(jié)構(gòu)和機理研究而獲諾貝爾化學獎。

48、（二）載體介導的易化擴散 運輸極性分子和無機離子；如葡萄糖 比自由擴散轉(zhuǎn)運速率高； 運輸速率同物質(zhì)濃度成非線性關系； 特異性；飽和性。 易化擴散速率同物質(zhì)濃度的關系 載體蛋白促進葡萄糖擴散示意圖 （三）載體蛋白介導的主動運輸： 1、離子泵直接水解ATP進行主動運輸（1）鈉鉀泵（2）鈣離子泵其他：質(zhì)子泵、ABC 轉(zhuǎn)運器2、離子梯度驅(qū)動的主動運輸（協(xié)同運輸） 主動運輸?shù)奶攸c逆濃度梯度（逆化學梯度）運輸；需要能量；能量來源主要有： ATP驅(qū)動的泵通過水解ATP獲得能量； 協(xié)同運輸中的離子梯度動力；都有載體蛋白。 （1）鈉鉀泵（Na+-K+ATP酶） 構(gòu)成： 工作圖解1；離子結(jié)合與釋放圖解2， 總結(jié) Na+-K+泵的作用 Na+-K+ATP酶的構(gòu)成 2個亞基、2個亞基組成的4聚體 Na+-K+ATP PUMP圖解 圖解 Na+-K+泵的作用 維持細胞的滲透性，保持細胞的體積； 維持低Na+高K+的細胞內(nèi)環(huán)境； 維持細胞的靜息電位。 地高辛、烏本苷等強心劑抑制其活性；Mg2+和少量膜脂有助提高于其活性。 Na+/K+ ATPase運輸過程:在靜息狀態(tài)，細胞